青蒿素分析方法的确定
青蒿素生物合成的研究状况
青蒿素生物合成的研究状况青蒿素是我国科研人员从传统中医药黄花蒿中提取出来并自主研发的一种抗疟疾特效药[1]。
20世纪70年代，我国科技工作者从黄花蒿中分离提纯出一种抗疟活性单体——青蒿素，以后又确定了它的分子结构和构型。
1986年我国自主研发的蒿甲醚油针剂、青蒿琥酯钠盐的水针剂以及青蒿素栓剂等抗疟疾药作为一类新药在我国批准生产。
1995年蒿甲醚率先被收入国际药典，这是我国首次得到国际认可的自主研发新药。
目前，青蒿素系列抗疟药已有5种新药(青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素、复方蒿甲醚)共9种剂型上市并在世界各国销售，每年挽救了数百万重症疟疾患者的生命。
除了独特的抗疟作用外，青蒿素系列药物还具有抗血吸虫、肺吸虫、红斑狼疮、皮炎以及免疫调节，抗流感等多种疗效[2]。
但是，目前国际抗疟药市场上青蒿素类药物只占有很少的份额，其原因主要在于青蒿素原料缺乏。
1植物提取现在，药用青蒿素基本来自植物黄花蒿的提取物。
多年来，野生黄花蒿资源分布零散，其中青蒿素含量非常低，仅为0．4％～1．0％，且产量和品质也不稳定，影响生产工艺和成本[3]。
人们在其近缘植物中至今尚未发现含有青蒿素的植物。
在已探明有利用价值的野生黄花蒿资源中，每年仅可提取青蒿素为10至20吨，远远不能满足市场每年近200吨的需求。
另外，由于作为原料的黄花蒿要求在花前收获，这将导致野生黄花蒿种子逐年减少，进而引发资源枯竭。
况且从黄花蒿叶和花蕾等部分中提取，但环节较多，费时又费力。
2化学全合成青蒿素是具有过氧基团的新型倍半萜内酯，其分子式为C15H22O5，相对分子质量为282.33[4]。
青蒿素虽已能人工合成，但由于合成难度大、成本高、毒性较大，未能投入工业化生产[5]。
3生物合成鉴于此，青蒿素生物合成的研究，对于有效提高青蒿素的生物产量、青蒿素生物工程应用和黄花蒿药用植物资源的可持续利用，均有较重要大的理论意义和应用价值。
3.1青蒿素前体化合物与青蒿素生物合成有关的中间体有十几种，其中最重要的是青蒿酸、青蒿素B、青蒿烯、二氢青蒿素等[6]。
青蒿素的提取
北京化工大学北方学院NORTH COLLEGE OF BEIJING UNIVERSITY OFCHEMICAL TECHNOLOGY（2013）届本科生天然产物有效成分提取大作业题目：青蒿素的提取学院：理工院专业：化学工程与工艺学号： 090101153 姓名：马鸿飞指导教师：刘雪凌教研室主任（负责人）：2012 年 6 月 5 日天然色素的提取——青蒿素提取马鸿飞化学工程与工艺化工0906班学号090101153指导老师：刘雪玲摘要提取青蒿素的工艺 ,考察了粒度、压力、温度、时研究了超临界CO2流量等影响因素.以萃取率为目标 ,综合考虑产品收率 ,优化了超临间、CO2界萃取工艺条件 ,得到较佳的操作条件:萃取压力 20 MPa ,萃取温度50 ℃,每千克原料CO质量流量1 kg/ h ,分离器Ⅰ的温度为60 ℃,压力为14 MPa.2在优化条件下萃取 4 h ,萃取率达到 95 %以上 ,萃取物纯度在 15 %以上. 关键词：青蒿素超临界二氧化碳萃取黄花蒿前言超临界流体萃取是利用处于临界温度，临界压力之上的超临界流体具有溶解许多物质的能力的性质，将SCF作为萃取剂，从液体或固体中萃取分离出特定的成分的新型分离技术由于它具有低能耗、无污染和适合于处理易热分解和易氧化物质的特性，因而在化学工业、能源工业和医药工业中引起广泛的兴趣和应用。
流体与普通的有机溶剂相比，具有明显的优SCF 萃取剂特别是超临界CO2势。
它是环境友好型溶剂，对人畜无害，不污染环境，也不会残留在产品中，而且临界温度（31。
1度）和临界压力（7.387MPa）较低，故操作条件相对较温和。
流体密度接近于液体，因而具有很大的溶解能力，而粘度却接近由于超临界CO2于气体，其扩散能力又比液体大100倍以上。
并且，其溶解能力和选择性很方便的通过改变压力和温度进行调节，萃取速率快，操作时间短，所以一直受到大家的重视。
SFE技术在食品、医药、香料和天然色素等领域的天然物提取分离上的应用研究，一直是SFE技术研究最活跃的领域，受历史和传统习惯的影响，国外这方面的研究主要集中在天然香味物、调味品和天然色素的提取上，而国内则多集中在传统中药的有效成分的提取上，以适应中药现代化的发展要求。
青蒿素分析方法的确定讲解
2.末端吸收[14]
色谱条件：
色谱柱Kromasil
ODSC18(416mm ×250mm, 5 μm); 流动相为乙腈-水 ( 60：40); 流速为 1.0mL/min; 检测 波长为203nm; 柱 温30℃。理论塔 板数2000.
1.2.4 LC-MS-MS
体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代 谢物浓度。由于血液样品试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分 析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分 析化学家的挑战。
色谱分析条件 色谱柱: Nucleodur C18 ( 250mm ×416 mm, 5μm D) ; 流动相: 乙腈-0.1%乙酸 (50 ∶50) ; 流速: 110 mL/min ; 柱温: 25 ℃青蒿乙 素和青蒿酸用UV检测器检测, 波长为209nm; 青蒿 素用ELSD检测器检测, 漂移管温度50 ℃, 载气 (N2 )压力30 p si ( 1 p si≈ 619 kPa) , 增益值为50; 进样体积为10或30μL。
LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到 限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干扰，通过MS／MS的选择反 应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复 杂样品仍可达到很高的灵敏度。
UPLC—MS MS法检测青蒿中青蒿素的含量
UPLC—MS MS法检测青蒿中青蒿素的含量摘要：采用UPLC-MS/MS法检测青蒿中青蒿素的含量，色谱柱Waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.9 μm），以甲醇和水梯度洗脱，甲醇-水体积比为40%（0 min）-70%（4.5 min）-40%（5.0 min）-40%（5.5 min），流速0.30 mL/min，柱温30 ℃，进样量3.0 μL，离子模式（ESI+）分析，青蒿素母离子为m/z=283.3。
子离子m/z=151.2，m/z=209.4。
结果表明，在上述条件下，青蒿素与杂质分离完全，无明显干扰，检出限达到0.174 ng，平均回收率为99.38%，精密度良好，青蒿中青蒿素含量为（1 045.19±27.55）mg/kg，该法适用于青蒿素分析。
关键词：UPLC-MS/MS；青蒿；青蒿素Detection of Artemisinin in Artemisia annua L. by UPLC-MS/MSAbstract：The detection of artemisinin in Artemisia annua L. was analysed by UPLC-MS/MS. The chromatographic column waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.9 μm）was used in the analysis. The elution program was 40% （methanol/water，V/V，0 min）-70%（4.5 min）-40%（5 min）-40%（5.5 min）. The isolation was preformed with 0.3 mL/min at 30 ℃，and the injection volume was 3.0 μL in ESI（+）scan. The precursor ion of artemisinin was m/z=283.3，daughter ion were m/z=151.2，m/z=209.4. The results showed that artemisinin could be detected in these conditions. The detection limit was 0.174 ng with recovery of 99.38% and good precision. The content of artemisinin in Artemisia annua L. reached （1 045.19±27.55）mg/kg. It was suitable for detecting artemisinin in Artemisia annua L..Key words：UPLC-MS/MS；Artemisia annua L.；artemisinin青蒿（Artemisia annua L.），又名黄花蒿，菊科，一年生草本，高1.5 m，全株黄绿色，有浓烈挥发性香气。
2020届高考化学高分突破选择题专练(偏难)-有机物分离提成的几种常见操作
2020届高考化学高分突破选择题专练（偏难）-有机物分离提成的几种常见操作1.下列关于有机物的说法中正确的是()①棉花、蚕丝和人造丝的主要成分都是纤维素②淀粉、油脂、蛋白质在一定条件下都能发生水解③易溶于汽油、酒精、苯等有机溶剂的物质都是有机化合物④除去乙酸乙酯中残留的乙酸，加过量饱和Na2CO3溶液振荡后，静置分液⑤石油的分馏、裂化和煤的干馏都是化学变化A. ②⑤B. ②④C. ①②③⑤D. ②④⑤2.下列关于有机物的说法中，正确的一组是()①米酒变酸的过程涉及了氧化反应②除去乙酸乙酯中残留的乙酸，加过量饱和纯碱溶液振荡后，静置分液③动植物的油脂中都含有油酸，油酸分子中含有碳碳双键，易被空气中的氧气氧化变质④淀粉遇碘酒变蓝色，葡萄糖能与新制Cu(OH)2发生反应⑤塑料、合成橡胶和合成纤维都是合成高分子材料A. ①②④⑤B. ②④⑤C. ①②⑤D. ③④⑤3.下列说法正确的是()A. 要证明硫酸亚铁铵晶体中含有NH4+，可以取少量晶体溶于水，加入足量NaOH浓溶液并加热，再用湿润的蓝色石蕊试纸检验产生的气体B. KClO3、KNO3、KMnO4等强氧化剂或其混合物不能研磨，否则将引起爆炸C. 常温下用pH试纸分别测定0.1mol⋅L−1NaClO溶液和0.01mol⋅L−1NaClO溶液的pH，可以比较浓度对水解程度的影响D. 过滤、结晶、灼烧、萃取、分液和蒸馏等都是常用的分离有机混合物的方法4.下列实验能达到预期目的是()A. 向煮沸的 1 mol⋅L−1 NaOH 溶液中滴加FeCl3饱和溶液制备Fe(OH)3胶体B. 向混有醋酸的乙酸乙酯中加入饱和Na2CO3溶液，振荡，分液分离除去乙酸乙酯中的少量醋酸C. 检验甲酸中是否含有甲酸丙酯时，可以往混合液中加入足量 NaOH 溶液以中和甲酸，再滴加银氨溶液看是否产生银镜D. 用酸性高锰酸钾溶液除去乙烷中少量的乙烯5.我国药学家屠呦呦因发现植物黄花蒿叶中含有抗疟疾的物质−青蒿素而荣获2015年诺贝尔奖。
药化-青蒿素
提取
从青蒿中提取青蒿素的方法以萃取原理为基础， 主要有乙醚浸提法和溶剂汽油浸提法。
投料—加水—蒸馏—冷却—油水分离—精油； 非挥发性成分主要采用有机溶剂提取，柱层析
及重结晶分离， 干燥—破碎—浸泡、萃取（反复进行）—浓缩
提取液—粗品—精制。
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青篙素为无色针状结 晶 , 属倍半萜内脂, 熔点为156一157℃， 分子式C15H22O5
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抗疟药
氯喹（choroguine）：
人工合成的4-氨喹啉类衍生物对各种疟原虫的红 细胞内期裂殖体有杀灭作用，可迅速控制症状。也可 用于症状抑制性预防。其特点是疗效高，生效快。对 红细胞外期无效。因其影响DNA复制和RNA转录并致氨 基酸缺乏而抑制疟原虫的分裂繁殖。 常规剂量不良反应少且轻微，大剂量可引起视力 障碍及肝肾损害。
中药按加工工精品艺课件 分为中成药、中药材。
近年来，随着国际中医、针灸事业的不断发展，各 国相继成立了官方或民间的研究机构，开展中医药、针 灸的理论及临床研究，并应用10多种文字，出版了60多 种中医、针灸学术刊物和一些专著。
目前世界上已有120多个国家和地区设立了中医药 机构，全球采用中医药、针灸、推拿治疗疾病的人数， 已占世界总人口的三分之一以上，中医药、针灸的疗效 已得到各国政府及人民的信任和不同程度的支持。
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药学遗产的一项重大科研成果，是在中西医结合科研 领域中的又一重大成就。 为实现中药现代化 , 首先应明确中西医药学的 优势和劣势; 现代科学化中药应保留现有的宏观优 势 , 再获微观优势 ,从而确定现代科学化中药的标 志。 现代科学化中药不等于由现有中药而研制的具现 代科学内容的新西药。只有现代科学化中药才可能使 中药走向世界 , 当前着力点应在中药先走遍中国 , 在中国占主导地位。从现有中药而得现代科学化中药 固然为途径之一 , 但实现起来艰难 , 而西药中药化 则为得现代科学化中药的另一途径 , 且可能为捷径。 总之 , 明确前提 , 分清误识 ,中药现代科学化才能 早日实现。
青蒿素质量标准
青蒿素的质量标准可能因生产商、用途和地理位置而异。
一般来说，青蒿素的质量标准可能包括以下几个方面：纯度：青蒿素的纯度应达到一定的标准，通常以高效液相色谱法（HPLC）或其他分析方法进行测定。
纯度越高，表明青蒿
素的品质越好。
熔点：青蒿素的熔点通常在284℃~286℃之间，可通过熔点测定仪进行测定。
紫外吸收：青蒿素在紫外光下有明显的吸收峰，可通过紫外-可见光谱法进行测定，以确定其含量。
比旋光度：青蒿素具有一定的比旋光度，可通过旋光仪进行测定，以确定其光学纯度和立体构型。
干燥失重：青蒿素应干燥失重，以确定其水分含量。
重金属含量：青蒿素的重金属含量应符合一定的标准，以确保其安全性。
微生物限度：青蒿素应符合一定的微生物限度标准，以确保其安全性。
青蒿素分子的结构测定——晶体在分子结构测定中的应用
微项目青蒿素分子的结构测定——晶体在分子结构测定中的应用1．了解测定分子结构的一般思路与方法，认识晶体对于分子结构测定的独特意义。
2．知道利用晶体X射线衍射能够测定原子坐标进而确定分子的空间结构，是测定分子结构的重要手段。
3．体会分子结构测定对于建立与优化物质结构理论模型，认识、解释和预测物质性质具有重要价值。
项目活动1了解利用晶体测定分子结构的意义阅读材料我国研究人员从1973年初开始测定青蒿素的组成与结构。
首先，研究人员利用高分辨质谱仪测定出青蒿素的相对分子质量为282.33。
结合元素分析，确定其分子式为C15H22O5。
然后，研究人员经过一系列复杂的氧化还原反应实验，推测青蒿素具有含过氧基团的倍半萜内酯结构。
红外光谱实验结果表明，青蒿素分子中确实含有酯基和过氧基团。
结合核磁共振谱图提供的关于碳、氢原子的种类和数量的信息，研究人员推定了青蒿素中甲基、过氧基团、带有酯基的六元环等部分结构片段。
然而，单纯依靠这些研究方法还不能精确判断青蒿素分子中所有碳原子和氧原子以何种方式连接形成骨架。
1975年，研究人员采用晶体X射线衍射的方法，确定了青蒿素的分子结构。
1．假设一个实验样品尺寸的数量级为10－4m、原子直径的数量级为10－10m，请估算这个实验样品中的原子数目。
提示：晶胞一般是立方体，原子为球体，忽略原子间隙，则该样品中的原子数目约为(10－4)343π(12×10－10)3＝6π×1018个≈2×1018个。
2．上述材料中用到了哪些方法测定青蒿素分子的组成和结构？这些方法主要有什么用途？提示：质谱法测定相对分子质量红外光谱法测定官能团核磁共振谱测定有机物分子中原子的种类和数目比晶体X射线衍射确定分子空间结构科学家测定青蒿素分子结构进行的主要工作流程归纳：1．下列可用于判断某物质为晶体的方法是()A．质谱法B．红外光谱法C．核磁共振法D．X射线衍射法D[A.质谱法用于测定有机物的相对分子质量，不能判断某物质为晶体，故A错误；B.红外光谱仪能测定出有机物的官能团和化学键，不能判断某物质为晶体，故B错误；C.核磁共振氢谱用于测定有机物分子中氢原子的种类和数目比，不能判断某物质为晶体，故C错误；D.晶体与非晶体最本质的区别是组成物质的微粒在微观空间是否有序排列，X射线衍射可以看到微观结构，可以鉴别晶体与非晶体，故D正确。
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为什么要测定青蒿素的含量
不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差异较大，而青蒿 素是青篙截疟的主要有效成分，因此对药材中青篙素含 量的准确测定十分必要。
提取青蒿素的溶剂：
青蒿素C15H22O5 在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易 溶, 在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解, 在水中 几乎不溶解; 在冰醋酸中易溶。
朗伯比尔定律：A=-lgT=εbc
b，ε一定，吸光度A和溶液浓度c成正比
∴青蒿素含量=( 青蒿素样品浓度×标准浓度单位×原始 体积) / 青蒿研细粉末质量
UV法总结
UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿 素衍生物 Q292在292 nm波长处有较强的紫外吸收来定量 的，其优点是操作简单，对仪器设备的要求不高，其缺点 是不能排除青蒿素类似物等物质的干扰。因此，UV法测 定青蒿中青蒿素的含量实际反映的是药材中青蒿素及其类 似物的总量。陈靖等[5]报道，青蒿中青蒿素类似物青蒿 酸、青蒿素B、3α-羟基-1-去氧青蒿素的平均含量分别为 0.47％ 、0.05％、0.005％，对青蒿中青蒿素含量的测定 影响较大，使得测定结果偏高。
1.3.1 HPLC-ELSD法
蒸发光散射检测器(ELSD) 为通用型的质量检测器, 对结构相似物质可给出几乎相同的响应因子,响应 值大小取决于物质浓度及检测条件下物质颗粒的 大小, 而不依赖于紫外吸收, 因此适合于青蒿素及 双氢青蒿素的含量测定。
例：HPLC-ELSD 法测定复方双氢青篙素片中双 氢青篙素的含量
IR、MS、NMR HPLC
(UV、ELSD、SPD...) UPLC
LC-MS/LC-MS-MS 高效毛细管电泳 CE
定量分析
1.1 青蒿素的IR定性分析
双氢青蒿素dihydroartemisinin
3376 O-H;1227 C-O ; 1025 C-O-C;2925 -CH3;
总结：IR专属性强，一般做标准谱图对照法
青篙素经钠硼氢还原而产 生的半缩醛化合物, 其12 位的羟基具有差向异构, 差向异构体a 与β 在一定 溶剂中有相互转化并达到 平衡的过程。DHA 分子 结构中无共扼结构和发色 基团, 不宜用分光光度法 或HPLC法测定含量。
双氢青蒿素 dihydroartemisinin
定性分析
TLC
紫外分光光度法
青蒿素的有效成分
青蒿素是从黄花蒿中提取 分离得到的含过氧基团的 新型半萜内酯。其多种衍 生物均是治疗疟疾的有效 单体，国内外公认的首创 新药。将青蒿素结构中的 C-10为羰基还原成羟基得 双氢青蒿素，进一步烷基 氧化得蒿甲醚，而进行酯 化可得到青蒿琥酯。
青蒿素 artemisinin
双氢青蒿素
双氢青蒿素为天然抗疟药
青蒿素分析方法的确定
主讲人：丁晨
青蒿
青篙为菊科一年生草本植物黄 花篙干燥地上部分，性寒，味苦、 辛，归肝胆经，可清热解暑、除 蒸、截疟，主要分布于重庆、四 川、云南、广西等地。目前青篙 素系列药物已取代奎宁成为治疗 疟疾的最安全有效的药物。青蒿 素是青蒿抗疟的有效成分，也是 合成青蒿素系列药物的起始原料， 它的需求量很大。
1.3 HPLC法
原理：利用流动相与组分间的亲和力，通过组分、流动相 和固定相三者间的相互作用来实现分离。
常见检测器: 1. UV 2. DAD（二极管阵列检测器） 3. FD（荧光检测器） 4. RID(示差折光率检测器) 5. ECD(电化学检测器) 6. ELSD（蒸发光散射器检测器）
文献报道同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙 素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法（高 效液相色谱紫外电化学检测法）、HPLCMS/MS法,采用ELSD法（蒸发光散射检测 法）检测仅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV 法检测青蒿中含量较低的青蒿乙素和青蒿 酸。
例：复方双氢青篙素片（含双氢青篙素32 m g , 磷酸呱哇 0.32g , 甲氧苄啶90 m g )中青蒿素含量的测定
1.2紫外分光光度法
原理：
1.由于青蒿素药物分子结构中母核不具有共轭体系，其紫 外吸收光谱的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同 具有一定的吸收特征。
2.青蒿素由于具有过氧桥和缩醛结构, 对酸碱不稳定, 对 强碱极不稳定, 热至熔点以上即迅速分解。采用0.2%氢氧 化钠50℃水浴加热30min 进行水解, 水解后的波长扫描结 果显示青蒿素在紫外区有最大吸收峰Kmax=290.5nm, 由 此确定最适波长为292nm。（青蒿素衍生化，酸化后亦可作 HPLC-UV检测）
1.青蒿素标准品0.1g+95%稀释成0.001%的标准品溶液
2.0.001%标准溶液0.5 ml加入95% 乙醇4.5ml, 再加入 0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 50℃水浴加热30min, 取 出快速冷却。
3.分别取0.5、1.0、2.0ml 的.001%青蒿素标准溶液, 分别加入95% 乙醇4.5、4.0、3.0ml, 再各加入0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 配成 浓度分别为2×10- 5%、4×10- 5%、8×10- 5%的标准溶液, 50℃ 水浴加热30min, 取出快速冷却, 在已经确立的最适波长下分别测吸 光度。
SPD(二极管阵列检测器)与ELSD 同时检测, 发现双氢青 蒿素转化平衡后SPD图中。a异构体与β异构体峰面积之 比为4: 1 , 而ELSD 检测得。a异构体与β异构体峰面积之 比为8 : 1。因为E L SD 对结构相似物质能给出几乎一致 的响应因子, 属于质量响应型检测器, 因此得到的峰面积比 即为转化平衡后a异构体与β异构体的实际物质量比。从 而也可得知a与β异构体对U V 的响应因子不同, 如用UV 检测则不能直接采用二者峰面积之和定量。
4.样液的制备 取青蒿待测样品研细粉末0.5g, 加入95%乙醇10ml 浸泡, 50℃水浴加 热60min 进行提取, 取出样品振摇、冷却、过滤, 取滤液1ml, 加入 95%乙醇14ml, 再加入0.2% NaOH 10ml, 配制成青蒿素样品溶 液,50℃水浴加热30min。在已经确立的最适波长下分别测吸光度,对 浓度作图, 建立标准曲线。