革兰染色
革兰染色
革兰染色革兰染色原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
革兰染色步骤及结果1. 涂片：首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。
2.固定：将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。
3.染色：在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗，注意水流不要直接对准薄层。
4.媒染：加碘液一滴，染1 min后用水冲洗，用过滤纸吸干。
5.脱色：用95%乙醇脱色，一般脱色时间大概为30 s。
这一步是革兰氏染色的关键，必须严格掌握好，如果脱色时间过长则会把阳性菌误认为阴性菌；如果脱色不够则容易被误认为是阳性菌。
水洗后用过滤纸吸干。
6.复染：滴加番红染色液一滴，染色10～30 s后，用自来水冲洗。
7.观察：干燥后，用油镜镜检观察，染成紫色的是革兰阳性菌，染成红色的是革兰阴性菌。
革兰染色的意义1.鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类，便于初步识别细菌，缩小检查范围，并确定进一步的鉴定方法。
2.选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感性不同，如大多数革兰阳性菌对青霉素、红霉素、头孢菌素等敏感；而大多数革兰阴性菌对链霉素、氯霉素、庆大霉素等敏感。
《革兰氏染色》课件
该方法基于细菌细胞壁的构造和成分 差异，通过染色剂对细菌细胞壁的吸 附和渗透作用，显示出不同的颜色， 从而进行鉴别。
革兰氏染色中使用的试剂及其作用
结晶紫
用于初步染色，能与细 胞壁结合，形成不溶性
复合物。
碘液
用于加强结晶紫与细胞 壁的结合，使染色更明
显。
酒精
脱色剂，去除染料与细 胞壁结合的复合物，使
染色
结晶紫染色
将结晶紫染液滴加在载玻片上，覆盖 菌体，染色1-2分钟。
冲洗
用吸水纸吸去多余染液，用清水轻轻 冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
水洗和脱色
水洗
用流水冲洗载玻片，洗去未结合的染料。
脱色
将载玻片放入脱色液中染液滴加在载玻片上，覆盖菌体，复染1-2分钟。
色或粉红色。
03
革兰氏染色的操作步骤
涂片
涂片
将待染色的菌体轻轻涂布在载玻 片上，确保菌体均匀分布。
干燥
将涂有菌体的载玻片放在室温下 自然干燥，避免强烈气流或直接 阳光照射。
固定
火焰固定
通过短时间轻触载玻片边缘，用火焰迅速固定菌体，使其与载玻片粘附。
冷却
将固定后的载玻片放在干净的桌面上自然冷却。
染色时间
染色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
脱色时间
脱色时间过长或过短都会影响 染色效果和观察结果。
染色方法
不同的染色方法可能会影响染 色效果和观察结果。
05
革兰氏染色的应用和意 义
在医学诊断中的应用
01
鉴别细菌种类
革兰氏染色是鉴别细菌种类的重要方法之一，通过染色结果的不同可以
将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，有助于医生对感染进
革兰染色的原理及意义
革兰染色的原理及意义
革兰染色是一种常用的细菌染色方法，原理是利用革兰氏染色剂对细菌细胞壁的结构差异进行染色。
革兰氏阳性菌染色后呈紫色或蓝色，革兰氏阴性菌染色后呈红色或粉红色。
革兰染色的原理是基于细菌细胞壁的不同构成。
革兰氏阳性菌的细胞壁主要由厚壁的胞外多聚糖和胞内的肽聚糖组成，其内部由大量的穿孔蛋白质穿过；而革兰氏阴性菌的细胞壁则相对薄且由较少的胞外多聚糖构成，胞内也缺乏穿孔蛋白质。
在革兰染色过程中，首先用碘溶液将革兰氏阳性菌的紫色染料紧密地固定在细菌细胞壁上，然后用酒精洗去多余的染料，再用蓝色染料对革兰氏阴性菌进行染色。
最终，经过适当的处理和洗涤后，革兰氏阳性菌呈紫色或蓝色，革兰氏阴性菌呈红色或粉红色。
革兰染色的意义在于对细菌进行初步分类和鉴定。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在形态、结构和代谢特性上存在差异，例如革兰氏阳性菌通常较大、形状多样，而革兰氏阴性菌多为小杆菌状。
通过革兰染色可以快速地初步识别细菌的类别，并为进一步的鉴定提供重要的信息。
此外，革兰染色也对指导药物敏感性试验有一定的参考价值，因为革兰氏阳性菌对抗生素的敏感性通常较差，而革兰氏阴性菌相对较容易受到抗生素的影响。
总之，革兰染色是一种简单而有效的细菌染色方法，能够提供有关细菌类型和某些生理特性的初步信息，对微生物学和临床医学起着重要的作用。
革兰氏染色
2 涂片的制备
无 菌 操 作
灭菌接种环
2 涂片的制备
①接种环取盐 水3ul×2滴, 水滴间距小于 2cm。
② 取 菌 苔 少 许 （ 1mm 小菌落半个） 与盐水混匀，涂成 大于1cm2 均匀涂膜。 ③涂毕→环移至涂膜中 央侧立，待环内菌膜破 裂，接种环烧灼灭菌。
无 菌 操 作
↑ ↑ 细菌合适 细菌较多
2 涂片的制备
①手持载玻片一端，涂膜朝 上，两个涂膜快速通过火焰 外层3次，时间2～3秒钟。
涂片smear
②促使菌体蛋白质凝固，固定 在载玻片上，以免染色水洗的 时候，细菌被水洗掉。
干燥dry
固定 Fixation
3 革兰氏染色的方法和步骤
初染：结晶紫染液染 1min
水洗，甩干
媒染：卢戈氏碘液染1min
革兰氏染色
1.1细菌染色法
★单染色法：只用一种染料染色，能清楚观察菌体大 小、形态与排列，不能鉴别细菌。 ★复染色法（鉴别染色）：采用两种以上的不同染料 进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴 别细菌。
※抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸 性细菌(※一些一旦用某些方法染色后，能够抵抗酸性酒 精脱色的细菌)，阳性者为红色。 ※特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色 （用于白喉杆菌异染颗粒染色）。
肽聚糖少
1.3革兰氏染色的意义
鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。
选择抗菌药物：例如G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐
药。
了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素→ 干燥 → 固定→ 染色
实验器材与材料
接种环接种针，酒精灯，生理盐水2支，镜油瓶、 接种环、细菌分离培养物（上次实验平板） 拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，细菌分离培 养物（上次实验平板），革兰氏染色液
革兰氏染色原理及步骤
革兰氏染色原理及步骤
革兰氏染色原理如下：
1、革兰氏染色与细菌等电点有关系：革兰氏阳性菌的等电点比革兰氏阴性菌低，因而革兰氏阳性菌带负电荷比革兰氏阴性菌多，它与草酸铵结晶紫的结合力大，用碘-碘化钾媒染后，两者等电位均降低，但革兰氏阳性菌等电位降低得多，故与草酸铵结晶紫结合得更牢固，对乙醇脱色的抵抗力强，草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物不被乙醇提取，菌体呈紫色，而革兰氏阴性菌则相反，菌体呈红色。
2、革兰氏染色与细菌细胞壁有关：革兰氏阳性菌的脂质含量很低，肽聚糖含量高，革兰氏阴性菌则相反，因此用乙醇脱色时，革兰氏阴性菌的脂质被乙醇溶解，增加细菌细胞壁的孔径及其通透性，乙醇容易进入细胞内将草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物提取出来，使菌体呈无色，革兰氏阳性菌由于脂质含量极低，而肽聚糖含量高，乙醇既是脱色剂又是脱水剂，使肽聚糖脱水缩小细胞壁的孔径，降低细胞壁的通透性，阻止乙醇分子进入细胞，草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物被截留在细胞内而不被脱色，仍呈紫色。
革兰氏染色步骤如下：
1、涂片，固定；
2、初染：滴加草酸铵结晶紫染色1-2min，水洗；
3、媒染：滴加革兰氏碘液（碘-碘化钾溶液）染色1-2min，水洗；
4、脱色：滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后水洗；
5、复染：滴加番红染液染色2-3min，水洗并使之干燥；
6、镜检：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
革兰氏染色
革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Christain Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。
革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。
可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。
现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
所以染色时的条件要严格控制。
例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。
此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。
所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。
革兰氏染色原理：G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：１）涂片固定。
革兰氏染色
革兰氏染色求助编辑革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。
未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法。
目录编辑本段解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所应起的。
①革兰氏阳性细菌的细胞壁G＋细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层紧密相连（图2-9）。
有的G ＋细菌细胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也称胞壁质（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。
由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。
磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素（autolysins）酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。
如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G＋细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。
除链球菌外，大多数G＋细菌细胞壁中含极少蛋白质。
②革兰氏阴性细菌的细胞壁 G—细菌细胞壁比G＋细菌细胞壁薄（15～20nm）而结构较复杂，分外膜（outer membrane）和肽聚糖层（2～3nm）（图2-10）。
在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙（periplasmic space）。
外膜 G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。
O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脱氧已糖。
革兰氏染色名词解释
革兰氏染色名词解释革兰氏染色（Gram staining）是一种常用的细菌鉴定和分类方法，由丹麦细菌学家克里斯蒂安·格拉默（Christian Gram）于1884年首次提出，并被广泛应用于临床微生物学和实验室研究中。
革兰氏染色的原理是通过对细菌细胞壁的染色特性进行区分。
细菌的细胞壁在结构上分为两种类型：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有厚实的胞壁，其细胞壁主要由多聚肽和多糖组成，对革兰氏染色染料结构相对稳定。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，含有一个内膜和一个较薄的胞壁，对革兰氏染色染料结构不稳定，容易被清洗脱色。
革兰氏染色方法通常由紫晶染液（crystal violet)、碘液（iodine）、酒精脱色液（ethyl alcohol）和洗净液（wash buffer）组成。
以下是革兰氏染色的步骤：1. 取一块无菌玻璃片，用手套或钳子夹住，然后在玻璃片上滴加一滴样本（可以是细菌培养物或分离纯培养的菌液），将细菌均匀涂抹于玻璃片上形成细菌涂片。
2. 将预先烘干的细菌涂片放置在静止的温和热环境中，使菌液完全固定在玻璃片上。
3. 将预热的紫晶染液倒在细菌涂片上，让染液覆盖整个细菌涂片，静置片上1分钟。
4. 倒掉多余的紫晶染液，用洗净液将染液冲干净。
5. 加一倍稀释的碘液在细菌涂片上，静置片上1分钟。
6. 倒掉多余的碘液，用洗净液将碘液冲洗干净。
7. 用酒精脱色液滴在细菌涂片上，进行制片人定时（通常为15-30秒），直到底色变得非常浅。
8. 倒掉酒精脱色液，用洗净液将细菌涂片冲干净。
9. 加入红粉溶液，让染料覆盖细菌涂片，静置片上1分钟。
10. 倒掉多余的红粉溶液，用洗净液将细菌涂片洗净，待片子晾干。
观察结果时，革兰氏阳性菌会呈现出紫色或蓝色，因为其细胞壁能够保留紫晶染料和碘复合物的结晶。
而革兰氏阴性菌则会呈现出红色或粉红色，因为其细胞壁无法保留紫晶染料和碘复合物的结晶，在酒精脱色过程中已经被去除。
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五、辅导过程
1、学生实验准备的辅导 2、革兰染色过程中的辅导 3、显微镜观察结果的辅导 4、实验操作完毕物品归位辅导 5、总结、纠偏
1、学生实验准备的辅导
• 每位辅导老师负责两组同学的实验辅导，要 求学生统一听指令操作，按使用的先后顺序 准备好物品分左右侧摆放，左侧放菌种、试 管夹，中间放酒精灯载玻片，右侧放取菌针、 环、生理盐水。两人一组互相检查，教师抽 查 • 此时教师最好站在两组一端的中间，这样有 利于观察到全局
二、对学生情况分析
1、学生知识储备 2、学生能力估计
1、学生知识储备
因材施教
理论知识好
理论知识弱
有更高的操作标准
要引导他们知实 验操作的所以然
2、学生能力估计
学生的动手能力差异很大，在不同 的实验操作过程中操作的速度、效果不 会一样，在辅导过程中要做到有统一操 作（实验准备过程）有个别指导（涂片 过程、染色过程）。
号同学 号同学 号同学 号同学
染色结果 分析问题
评分 第 组总分
3、显微镜观察结果的辅导
（3）巩固知识——动用手、口、脑增强记忆 手画
脑加工
革阳像男喜紫兰，革阴似女喜红衫
4、实验操作完毕物品归位辅导
•
各小组长检查，组间评比（培养团队合
作意识）
• 老师对收拾的整齐的组以及检查认真负责 的组长提出表扬
5、总结、纠偏
• 与主讲老师沟通、总结学生整个实验过程中 存在的问题及优点
• 总结后，再通过教师规范、正确的示教，纠 正学生们存在的问题。
六、物品归位
1、教室卫生的清理 2、仪器设备的检查
显微镜
3、污染物的处理
高压灭菌 医疗垃圾运送
谢 谢！
1 、 巡 视 ----发现学生存 在的问题 2 、 个 别 指 导 ---- 纠 正 学 生错误的操作方法 3、对学生的操作进行评 价和及时的表扬
练习
实验教师与主讲教师沟 通将整个教学活动中反 映出的问题进行归纳总 结。
“脑”加工 由分析到掌握
1、与学生沟通对实验结 果进行分析找出关键问题 2、将总结出的问题再重 复的进行正确的示教
3、其它物品的准备
• 特别要提出的是：
1.菌种:
• 一能节约成本， 二可以减小污染的影响因素
三是使用玻璃器皿可以做到环保
• 在菌种标注上要使用代码，以 配合实验课任务引领的教学模式。
• 提前一天传种保证染色结果
3、其它物品的准备
• 特别要提出的是：
2、灭火布：用以防止酒精灯的意外喷燃
3、其它物品的准备
• 特别要提出的是：
3、消毒液：用以处理在学生操作过程中不慎而发生 的洒溅（此试剂属于微生物实验室的常备试剂放置 于洗手池处按使用情况及有效期定期更换）
四、辅导内容分析
•
我们实验课上的辅导内容恰好与
德国职业教育的新教学法中的四步教
学法相吻合。具体分析如下:
四步教学法
辅导内容
学生的感知 途径
讲解
教师主要采用提示型的 “耳”感知 教学样式讲授教学内容 由听到知道
革兰阳性细菌 革兰阳性细菌
2、在微生物课程实践教学中的地位
• 是贯穿于微生物实践教学始终的一项 基本技能 • 是保证细菌鉴定结果的 首项工作
• 故是检验专业学生
必备技能
3、教学目标
培养学生严谨、求实的工作作
德育目标
案例讲述
风
叙述革兰染液的作用；
说出革兰染色的方法步骤；
知识目标
说明革兰染色的临床意义和影
（3）生物安全，包括无菌操作及 1、反复提醒，及时发现及时纠正
菌液意外洒溅的处理
2、模拟意外情况处理
4、实验教学重点和难点
教学重点教学难点 （1）革兰染色
难点突破
1、正确示范 2、Flash、真实录像的循环播放 3、教师的巡视、个别指导、结果评价、 学生间的相互学习
（2）显微镜的油镜的使用
1、统一操作 2、教师个别指导 3、反复练习
结晶紫 卢革氏碘 稀释复红
我们
自已配置染液
结晶紫：是时间越长越好，就提前大多次
配置。
质量保证
3、其它物品的准备
• 我们是按照实验的操作过程以及学生人数准 备所需物品的
标记 蜡笔、玻片
涂片
菌种、取菌环、酒精灯、灭 火布、火柴
染色 吸水纸
镜检 擦镜纸、消毒缸
2、革兰染色过程中的辅导
• Flash、录像片在多媒体上循环播放 • （1）标记----逐一检查 • （2）生理盐水的滴加----逐一检查 • （3）酒精灯的正确使用——教师监督 • （4）取菌过程----------定量 • （5）菌膜薄厚---教师评定（薄、厚、适当） • （6）染色过程-----------教师监督 • （7）物品归位------小组评比（口头表扬）
实验教师的辅导方法
协助教师维持课堂纪律， 提高学生对讲解内容的吸 收度
示范
按操作规程正确示范每 “眼”感知
一个动作
由看到明白
1.重点操作步骤边说边做 2.老师制作的Flash及操 作录像循环播放
模仿
采用整组指导，个别辅 导，逐个过关的辅导原 则，使每个学生熟练掌 握此项基本功。
“手”感知 由做到熟悉
响因素
提问 示教+flash+提问+顺口溜 提问
掌握革兰染色技能；
能力目标 培养无菌观念及生物安全的意
识
严格要求实验操作过程的各个 步骤，要求学生动作标准、反 复训练、反复提醒
4、实验教学重点和难点
教学重点 （1）菌膜制备
（2）酒精灯的正规使用
实现方法
1、示教盐水量的控制 2、菌种刮取1mm
1、正确示教 2、使用注意事项的反复声明 3、讲述实例：酒精灯的喷燃的起因、 后果，让学生提高警惕
三、准备流程内容分析
1、仪器设备的准备 2、试剂的准备 3、其它物品的准备
1、仪器设备的准备
•
实验课前检查显微镜的使用状态（学
生自查、组长检查、教师抽查）
•
显微镜使用频繁为防止意外要准备两
台备用
•
课后进行使用登记
2、试剂的准备
香柏油、 二甲苯、 95%乙醇
我们用市售的试剂
革兰染液： 市售革兰染液 价格昂贵、使用量非常大
革兰染色
实验中心 藏明
革兰染色
• 对实验项目的分析 • 对学生情况分析 • 准备流程内容分析 • 辅导内容分析 • 辅导过程 • 课后归位
一、对实验项目的分析
1、教学内容 2、在微生物课程实践教学中的地位 3、教学目标 4、实验教学重点和难点
1、教学内容
细菌染色方法中最经典应用最广泛的染色方法 革兰染色
3、显微镜观察结果的辅导
（1）油镜的使用——严格要求按规程操作 （2）小组评比——引入竞争机制 （3）巩固知识——动用手、口、脑增强记
忆
3、显微镜观察结果的辅导
（1）油镜的使用——严格要求按规程操作 调光：容易达到标准 调距：不容易达标，需要反复的练习
3、显微镜观察结果的辅导
（2）小组评比——引入竞争机制、强化所 学技能