人脐带间充质干细胞操作规范
脐带间充质干细胞制备操作规程
1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。
去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。
充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。
静置培养7天。
第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。
用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。
1200rpm，离心6min，弃上清。
合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。
根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。
利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
脐带间充质干细胞培养操作细则
脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。
2.查看客户信息是否与交接表一致。
3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。
二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。
2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。
4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。
50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。
将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。
5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。
拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。
使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。
6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。
清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。
再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。
7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。
脐血间充质干细胞的培养
脐血间充质干细胞的培养
一、试剂：
胰酶、DMEM/F12培养基、胎牛血清、冻存管及二甲基亚砜(DMSO)、淋巴细胞分离液( 比重1.077g/cm3 ) 。
二、人脐血MSCs 分离和培养
1、无菌条件下采集脐带血，每份40～100 ml，肝素抗凝(20 U/ ml)，所有标本要求在6 h 内分离接种。
2、将人脐血沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液(比重1. 077 g/ cm3 )上，2000 r/min 离心20 min (离心半径15 cm)，取中间白膜层，PBS 洗涤2 次。
3、取洗涤后细胞1×107个接种于含30 % FBS 的DMEM/F12培养基中，置37 ℃、5 %CO2培养箱中培养，7d 后全量换液，去除未贴壁细胞，以后每隔2d 全量换液1次。
4、当MSCs 达到80 %融合时，1 ∶2 常规消化传代。
三、人脐血MSCs 的冻存和复苏
1、冻存
取第3 代1 ×106个MSCs 加入1 ml 含10 % DMSO 和90 %FBS 的冻存液，吹打均匀后移入冻存管，采用非程序性降温液氮冻存法进行细胞冻存，冻存管依次置于4 ℃冰箱20 min，- 20 ℃冰箱30 min 和- 80 ℃冰箱过夜，第2 d 移入- 196 ℃液氮中冻存。
2、冻存4周后复苏细胞，即从液氮中取出冻存管立即置于37 ℃水浴并轻轻摇动，1 min 内迅速解冻；冻融后的MSCs 加入含30 % FBS 的DMEM/F12 培养基洗涤2次，然后接种到含30 % FBS 的DMEM/F12 培养基中，置37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，第2 d 全量换液。
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞1 资料与方法1.1 一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4C保存，6h内无菌处理。
1.2 脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's 液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton 胶。
将其剪碎至1mm31织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20〜25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37 C，体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。
3〜5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%台牛血清的DMEM/F1培养基，正向放入体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d 可有间充质干细胞爬出。
1.3 脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F1（2 不含酚红）、StemProRMSC SFM 三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
1.4流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1X 106个细胞，分别加入10 u l单克隆抗体CD73 CD34 CD45 CD105 HLA-DRHLA-ABC及阴性对照lgG1 -PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min, PBS洗涤两次，室温300g, 5min。
PBS重悬后上流式细胞仪。
1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4 代细胞，调整细胞浓度至0.2 X 105/ml，加入96孔板。
每孔90卩l放在37C、体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内培养。
7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100卩l换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。
用酶标仪波长450nm测定各孔OD 值。
以OD直代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。
人脐带间充质干细胞及外周静脉移植SOP课件
05
问题与展望
目前存在的问题
安全性问题
目前关于人脐带间充质干细胞及 外周静脉移植的安全性仍存在争 议，需要进一步的研究来验证其
长期效果和潜在的副作用。
移植效率低
目前人脐带间充质干细胞的移植效 率相对较低，如何提高移植后的细 胞存活率和功能发挥是需要解决的 关键问题。
伦理问题
由于涉及到人类胚胎干细胞的采集 和使用，因此存在一定的伦理道德 问题，需要制定相应的伦理规范和 法律法规。
潜在的应用前景
1 2 3
治疗多种疾病 人脐带间充质干细胞及外周静脉移植有望成为治 疗多种疾病的新方法，如糖尿病、帕金森病、脊 髓损伤等。
个性化治疗 利用人脐带间充质干细胞进行个性化治疗，根据 患者的具体情况定制治疗方案，提高治疗效果。
促进组织再生和修复 人脐带间充质干细胞具有促进组织再生和修复的 能力，有望在损伤修复、整形外科等领域发挥重 要作用。
干细胞来源与获取
来源
人脐带是hUC-MSCs的主要来源，通常在新生儿出生后由产科医生提供。
获取方法
通过特定的分离和培养技术，从脐带中提取出间充质干细胞，并进行扩增和储存。
干细胞的分化与增殖能力
分化能力
hUC-MSCs具有多向分化潜能，能 够分化为多种组织细胞类型，如骨细 胞、脂肪细胞、心肌细胞等。
增殖能力
hUC-MSCs具有强大的增殖能力，能 够在体外培养条件下进行大量扩增， 以满足临床治疗的需求。
02
外周静脉移植概述
移植方式与途径
移植方式
外周静脉移植是一种常用的移植方式，通过将干细胞注入外周静脉，使干细胞随 血液流动至全身各组织器官。
移植途径
外周静脉移植的途径通常包括自体移植和异体移植，自体移植使用患者自身的干 细胞，而异体移植则使用他人的干细胞。
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min;2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min;5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿;7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min;8. 弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614. 细胞计数，按10/瓶接种，每瓶加入10 ml脐带无血清培养液(UltraCULTURE + 2% Ultroser G + 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液; 15. 细胞融合率达到80%左右时，加胰酶消化，按1: 3传代。
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection.2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days.（二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged.(三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。
间充质干细胞流程
间充质干细胞流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!间充质干细胞（MSCs）是一类具有多重潜能的成体细胞，在干细胞领域具有重要的应用前景。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人脐带间充质干细胞操作规范
一、人脐带间充质干细胞的分离和培养
1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;
2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;
3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。
4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;
5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);
6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。
7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。
8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;
9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml
bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;
10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);
11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;
12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;
13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;
614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液
UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。
15.细胞融合率到达80%左右时，加胰酶消化，按1: 3传代。
二、细胞传代
1.观察细胞融合率在80%以上时，进行传代;
2.将培养瓶依此排好，取10~20瓶放入超净台，同时举行操纵。
3.依次倒去上清液(预留10~20 ml作终止液)，每瓶插手3 ml心理盐水，洗濯细胞后弃去;
4.每瓶加入2 ml胰酶，消化2~3 min，镜下观察，待细胞收缩变圆，加入1ml终止液终止消化;
5.轻轻拍打培养瓶底面，收集消化液，再用10 ml心理盐水逐瓶洗濯，并收集洗濯液，夹杂消化液和洗濯液，2000 rpm 离心5 min;
66.弃上清液，加入适量脐带无血清培养液重悬细胞，按10/瓶接种，每瓶培养液终体积为10 ml。
三、细胞冻存
1.预先配置细胞冻存液(FBS + 10% DMSO):取50 ml离心管，插手FBS，然后逐滴插手DMSO并摇匀，放入4?C培养箱冷藏。
7
2.将消化得到的细胞悬液2000rpm离心 5 min，按10/ml密度重悬于细胞冻存液，分装入冻存管，每管装量不超过1 ml;
3.将冻存管置入预先安排室温下的梯度降温盒后，放入-80?C冰箱。
4.24 h后，将冻存管放入冻存盒内，继续于-80?C 冰箱内储存，或转移至液氮罐中，长期储存;
5.梯度降温盒每使用5次更换一次异丙醇，每次加液量为250 ml。