脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理
一、概述
脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。
与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。
本文将就WJ-MSCs制备
原理进行详细介绍。
二、脐带间充质干细胞的来源
脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。
在
脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。
这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。
三、WJ-MSCs制备方法
1. 脐带获取
制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。
通常情况下，在新生
儿出生后不久即可进行采集。
采集过程中需要注意消毒和无菌操作。
2. 分离WJ组织
将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ
组织。
WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。
3. 制备单细胞悬液
将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。
消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。
4. 培养和扩增
将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。
在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。
5. 鉴定和纯化
经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定
和纯化。
通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。
6. 冻存
经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。
在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。
四、WJ-MSCs的应用前景
WJ-MSCs具有广泛的应用前景。
目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏
疾病等。
此外，WJ-MSCs还可以用于组织工程学和再生医学领域，如骨髓移植、软骨修复等。
五、总结
WJ-MSCs是一种来源于新生儿脐带的干细胞，具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，在临床应用中具有广泛的
前景。
制备WJ-MSCs需要采集新生儿脐带组织，并进行分离、消化、培养和纯化等步骤。
未来随着技术的不断发展，相信WJ-MSCs将会
在更多领域得到应用。
脐带间充质干细胞制备操作规程
1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。
去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。
充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。
静置培养7天。
第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。
用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。
1200rpm，离心6min，弃上清。
合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。
根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。
利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞新生儿脐带组织——脐带间充质干细胞脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
脐带间充质干细胞的特性：间充质干细胞是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。
间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。
脐带间充质干细胞的分化能力：间充质干细胞具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。
这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。
脐带间充质干细胞的取材：脐带间充质干细胞来源于新生儿脐带华通氏胶，取材方便，体外增殖能力强。
一根脐带提取的间充质干细胞的数量相当于成人5000毫升骨髓中的间充质干细胞数量，且质量优、活性高、更纯净，可多次使用，是理想的间充质干细胞来源。
脐带间充质干细胞的分离培养：1. 取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织。
2. 将所得组织充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素。
3. 脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，4. 一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
间充质干细胞临床应用美国FDA已批准了近60项临床试验，主要包括以下几个方面：1）造血干细胞移植：增强造血功能；促使造血干细胞移植物的植入；治疗移植物抗宿主病。
2）组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病。
3）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。
脐带间充质干细胞的
脐带间充质干细胞脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
目录1概念2优势3分离培养4用途5干细胞研究▪期刊简介▪研究对象▪研究内容1概念脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%。
结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。
2优势脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。
它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。
有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低[1]，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
干细胞的培养体系主要应用含动物血清（如胎牛血清）的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带间充质干细胞的实验研究。
以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性。
同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。
[2]3分离培养脐带间充质干细胞的获取主要有组织块贴壁法与酶消化法，由于酶对细胞的损伤较大，且细胞得率较低，费用昂贵，因此大多数实验室采取了组织块贴壁法进行培养。
脐带间充质干细胞PPT
分离与培养技术
01
02
03
酶消化法
使用特定的酶如胶原酶、 胰酶等分解脐带组织，释 放出间充质干细胞。
组织块贴壁法
将脐带组织切割成小块， 贴壁培养，让间充质干细 胞从组织块中爬出并扩增。
流式细胞术分离法
利用间充质干细胞的表面 标记物，通过特定的抗体 进行免疫分离。
诱导分化与基因编辑
再生医学
组织工程
脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，可诱导分化为多种组 织细胞，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。在组织工程领 域，可用于构建人工组织器官，为器官移植提供新的来源。
损伤修复与再生
脐带间充质干细胞可分泌多种生长因子和细胞因子，具有促 进损伤组织修复和再生的能力。在损伤修复领域，可用于治 疗烧伤、创伤等，促进受损组织的再生与修复。
技术挑战与解决方案
技术挑战
脐带间充质干细胞的分离、培养和分化等技术在实践中仍面临一些技术难题，如低分离效率、低细胞活率等。
解决方案
加强基础研究，深入了解脐带间充质干细胞的生物学特性和调控机制；采用先进的分离和培养技术，提高细胞的 分离效率和活率；加强国际合作，共享技术和资源，推动干细胞技术的进步。
05
脐带间充质干细胞的挑战与解 决方案
伦理挑战与解决方案
伦理挑战
脐带间充质干细胞的研究和应用涉及到伦理问题，如胚胎和胎儿的权益、人类基因编辑 等。
解决方案
建立严格的伦理审查机制，确保研究符合伦理标准；加强公众教育和科普，提高公众对 干细胞研究的认知和理解；尊重和保护受试者的权益，确保研究过程的公正和透明。
社会影响与普及程度
疾病治疗
脐带间充质干细胞在多种疾病的 治疗中展现出巨大潜力，有望为
脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变
脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变李晓玲;朱旅云;宋光耀;贾黎静;杨少玲;胡丽叶【摘要】BACKGROUND:Compared with bone marrow and autologous peripheral blood stem cells, umbilical cord mesenchymal stem cells are characterized as more primitive, more powerful amplification and lower immunogenicity, no ethical problems, which are more important to the elderly patients with diabetes mel itus. OBJECTIVE:To evaluate the efficacy and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation in the treatment of the elderly patients with diabetic lower limb vascular disease. METHODS:Fifty-six elderly patients with diabetic lower limb vascular disease were randomly divided into observation group and control group. The control group was treated with conventional therapy, while the observation group was treated with umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation. RESULTS AND CONCLUSION:Observation group showed a higher efficiency than the control group, with significant difference(P<0.05). After treatment, foot skin temperature, transcutaneous oxygen pressure, and ankle brachial index were al improved in both two groups, and the ankle brachial index showed a better value in the observation group (P<0.05). There were no significant adverse reactions in the two groups. Umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation is a simple, safe and effective therapy for the elderly patients with diabetic lower limb vascular disease, with better short-term curative effect.%背景：与骨髓和自体外周血干细胞相比，脐带间充质干细胞更原始，扩增能力更强，且免疫原性弱，无伦理问题，对于年老体弱的糖尿病患者更具有重要意义。
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。
WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。
在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。
分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。
脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。
获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。
分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。
具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。
细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。
具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。
鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。
免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。
活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。
多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。
结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。
临床级间充质干细胞如何生产制备？小旎带你一览全过程
临床级间充质⼲细胞如何⼲产制备？⼲旎带你⼲览全过程！⼲间充质⼲细胞（human mesenchymal stem cells, hMSCs）由于其再⼲和免疫调节特性，以及能够迁移到损伤的确切部位，在现代治疗和再⼲医学中发挥着重要的作⼲；这些特性使hMSCs成为⼲前在开发创新细胞治疗产品中具有前景的活性细胞之⼲，已应⼲在糖尿病、烧伤、⼲关节炎、移植物抗宿主病等特定疾病治疗上。
⼲前，全球基于hMSC的细胞治疗产品有500多项正进⼲临床试验，以评估其安全性和副作⼲，确定其剂量和给药途径，并检视其作为特定疾病的疗效。
然⼲，只有8种基于hMSC的产品获得了上市营销。
鉴于近年来hMSC临床试验数量的快速增长和这些产品的复杂性，以及它们的细胞组分特征和药物产品状态，需要更严格、更具体、更统⼲地要求定义hMSCs的质量，并加强其安全性和有效性的分析。
这些质控管理与分析应在整个制造过程中实施，以确保hMSC的功能和完整性，并保证每批次⼲产始终符合规范。
因此，正确设计⼲产制造过程对于授权hMSC产品上市⼲关重要，最终产品的质量、安全性和有效性可以得到保证，然后才能作为医疗產品在⼲体内使⼲。
hMSC的产品制造过程设计hMSC的产品制造过程包括不同阶段：供者选择和评估（异基因疗法）、⼲清学检测、活检、分离、⼲物样品处理，必要时通过体外扩增获得预期的细胞数量，中间产品和最终产品的鉴定、包装和放⼲(下图)。
hMSC产品制造过程需符合GMP⼲产规范。
GMP确保hMSC产品始终按照质量标准制造和管控，同时将细胞制造过程中被传染源污染的风险降到最低。
除了质量控制程序和风险评估，其他制造⼲法应与设施⼲起到位和验证，如体外扩增过程、清洁、环境监测、运输、材料消毒、培养液填充等。
操作⼲员尤其需要经过严格训练，以获得操作资质。
因此标准化操作程序与环境是⼲常必要的。
hMSC的产品制造过程供者选择与⼲清学检测hMSC产品制造过程的第⼲步是选择供者（异基因产品），然后通过供体测试来检查⼲物起始材料，包括⼲体和异基因hMSC产品。
脐带间充质干细胞制备存储标准
脐带间充质干细胞制备存储标准脐带间充质干细胞（Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells，WJ-MSCs）是一种来源于脐带的多潜能干细胞，具有广泛的临床应用前景。
为了确保脐带间充质干细胞的制备和存储质量，制定脐带间充质干细胞制备存储标准非常重要。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准应包括以下几个方面：1.取材标准：脐带是脐带间充质干细胞的主要来源，因此在制备和存储过程中需要确保脐带的质量。
取材时，应确保脐带来自经过筛选和检测的健康母亲，脐带的无菌处理应符合相关规定。
2.分离和培养标准：脐带间充质干细胞的分离和培养是制备过程中的关键步骤。
应采用符合相关规定的分离和培养方法，确保脐带间充质干细胞能够获得最佳生长和增殖环境。
3.鉴定标准：在制备过程中，需要对脐带间充质干细胞进行鉴定。
鉴定标准可以包括表面标记物的检测、多向分化潜能的检测等指标，以确保制备的细胞具有干细胞的特性。
4.冻存标准：为了确保脐带间充质干细胞的长期保存，应采用合适的冻存方法和条件。
冻存标准可以包括冷冻液的选择、冷冻速率的控制、冷冻样品的保存温度等指标。
5.质量控制标准：脐带间充质干细胞的制备和存储过程中应进行严格的质量控制。
质量控制标准可以包括细胞数目的检测、细胞活力的检测、无菌检测等项目，以确保制备的细胞符合质量要求。
在制定脐带间充质干细胞制备存储标准时，需要参考国内外相关的法规和标准。
同时，制定标准时需要考虑到国内的实际情况和相关研究的最新进展。
制定标准应充分结合实际情况和科学研究，确保标准的可行性和科学性。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准对于保证脐带间充质干细胞的质量和应用的安全性具有重要意义。
符合标准的脐带间充质干细胞可以应用于临床医学领域，对于治疗一些疾病和促进组织再生具有重要的作用。
因此，制定脐带间充质干细胞制备存储标准是当务之急，对于推动相关领域的研究和应用具有重要的意义。
小鼠脐间带充质干细胞培养方法
小鼠脐间带充质干细胞培养方法引言充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。
在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。
本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。
原料与试剂准备1.小鼠脐带组织2.DM EM/F12培养基3.胎牛血清（F BS）4.细胞培养袋5.1×PB S缓冲液步骤1.小鼠脐带的处理（1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。
（2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。
（3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。
（4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。
（5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。
2.细胞的收获和培养（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒残渣。
（2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。
（3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。
（4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10%的F BS。
（5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。
（6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。
3.细胞的传代与冻存（1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓冲液洗涤。
（2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。
（3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养瓶中。
（4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。
4.脐带间充质干细胞的鉴定（1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。
人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析
人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析摘要：目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学。
方法：培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体，通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。
结果①所抽取的外泌体分散度比较好，而且均匀。
②，外泌体粒径分布的高峰为（129.5+8.7) nm，它的膜表面是带有负电荷的，其浓度为8.375>109颗粒/ml，平均 zeta电位为（-28.1+3.6) mV。
③ 外泌体中存在着一类特殊的膜蛋白，即CD9,CD63等。
④蛋白质组学研究发现外泌体中的大部分蛋白都具有较高的活性，它们涉及到 RNA剪接、 mRNA加工、蛋白质折叠等生物学过程，涉及到 RNA/DNA等基因材料的合成、加工、降解等过程。
结论：经研究发现，人脐带间充质干细胞外泌体与其母系细胞存在某种“同质”、“差别”，且这些“差别”的蛋白质功能与其自身的免疫学特性都不相关，从而证实人脐带间充质干细胞外泌体具有较小的免疫学活性及较高的安全性。
关键词：人脐带间充质干细胞；外泌体;蛋白组学:免疫原性引言：间充质干细胞起源于中胚层，它是一种能够在各种组织中进行定向分裂并进行自身增生的干细胞，它可以从各种组织中被提取，比如脐带、子宫内膜息肉、月经期血液、骨髓、脂肪组织等，由于它的来源多样化，并且可以大规模地获取，所以它在实验和临床上都有着非常重要的研究价值。
本课题拟通过分离人脐带间充质干细胞源性外泌体，并通过比较两者的蛋白质组水平上的差别，验证其在体外的免疫活性，进而验证其在临床上的应用前景，并评估其在临床应用中的应用前景。
一、资料与方法1.1一般资料选取本企业2021年8月至2022年8月该时间段接受人脐带充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析的足月产新生儿脐带50例。
1.2方法1．2.1人脐带间充质干细胞培养及鉴定(1)人脐带充质干细胞的原代培养法：6小时之内，对所收集的脐带进行清洗，并将其两侧有瘀斑或瘀斑的部位，用 PBS对其周边及脐静脉进行彻底的清洗，并将其切割为1毫米×1毫米×1毫米的小段，并将其放置在18 wt的 DMEM全培养剂（Rh)+1 wt青链霉索 V+ DMEN （DMEM）浸润的T75玻璃瓶底部，底部向上，放置在37℃，5%体积分数的 DMEM全培养剂（DMEM）浸润的玻璃瓶中，2小时后将玻璃杯倒置，倒入5 mL DMEM全培养剂，第2日再更换玻璃杯，并用2 mL TrypL酶解，使其达到70%-80%的水平，按1:4的比例进行传代，获取生长良好3-6代细胞。