植块法分离培养人脐带间充质干细胞
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。
方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。
结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。
结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。
%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究
ｈ ＵＣＭＳ Ｃ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｂ ｙ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ｂ ｌ ｏ ｃ ｋ ｉ ｍｐ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ．Ｃ ｅ ｌ ｌ ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ ｗａ ｓ ｄ ｒ ａ ｗｎ ． Ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ｃ ｅ ｌ ｌ ｇ ｒ ｏ ｔｈ ｗ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ． ｔ ｈ ｅ ３ ｐ ａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ．Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ － ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ｈ ＵＣＭＳ Ｃ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｄ ｂ ｙ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｆ ｌ ｏ ｗ ｃ ｙ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｙ， ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｍｉ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｎ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｍｍｕ —
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比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞1 资料与方法1.1 一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4C保存，6h内无菌处理。
1.2 脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's 液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton 胶。
将其剪碎至1mm31织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20〜25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37 C，体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。
3〜5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%台牛血清的DMEM/F1培养基，正向放入体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d 可有间充质干细胞爬出。
1.3 脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F1（2 不含酚红）、StemProRMSC SFM 三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
1.4流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1X 106个细胞，分别加入10 u l单克隆抗体CD73 CD34 CD45 CD105 HLA-DRHLA-ABC及阴性对照lgG1 -PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min, PBS洗涤两次，室温300g, 5min。
PBS重悬后上流式细胞仪。
1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4 代细胞，调整细胞浓度至0.2 X 105/ml，加入96孔板。
每孔90卩l放在37C、体积分数为5%CO饱和湿度培养箱内培养。
7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100卩l换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。
用酶标仪波长450nm测定各孔OD 值。
以OD直代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。
脐带来源的华通氏胶间充质干细胞的分离、特性及应用前景
233CARCINO GENESIS ，TERATO GENESIS &MUTA GENESIS脐带来源的华通氏胶间充质干细胞的分离、特性及应用前景丁赛，张红霞，朱海英*(海军军医大学基础医学院细胞生物学教研室，上海200433)收稿日期：2021-11-21；修订日期：2022-05-13基金项目：国家自然科学基金(32171387)作者信息：丁赛，E-mail ：。
*通信作者，朱海英，E-mail ：【摘要】间充质干细胞(MSCs)的来源非常广泛。
虽然各种组织来源的MSCs 生物学特性不尽相同，但在标准培养条件下该类细胞均可以贴壁生长；细胞群体中有95%以上的细胞表达典型的间充质标记分子，如CD73、CD90和CD105，但缺乏造血标记分子CD14、CD19、CD34、CD45和CD79a 的表达；特别是均具有分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞的能力。
这些性质是国际细胞治疗协会给出的定义该类细胞的最低标准。
脐带间充质干细胞是指来源于新生儿脐带组织中的多能干细胞。
目前来看，从脐带不同解剖学部位(区室)获得的MSCs 的生物学性质也存在差异，其中从脐带华通氏胶中分离获得的华通氏胶间充质干细胞，在增殖能力、分化潜能、免疫调节能力等方面均明显优于其他区室来源的间充质干细胞，是用于组织器官损伤修复及免疫调节的一种理想的“种子”细胞，被认为具有更好的临床应用前景。
本文围绕近年来华通氏胶间充质干细胞的分离建系、增殖特性、分化潜能以及临床应用方面的研究进展进行了综述，其中重点介绍了化学诱导分化方案的建立和优化，认为与通过遗传改变诱导重编程方法相比，化学诱导分化方法具有更好的临床应用潜力。
【关键词】脐带；华通氏胶；间充质干细胞；分化潜能；分离；增殖特性中图分类号：R329.2+8文献标志码：A文章编号：1004-616X(2022)03-0233-04doi ：10.3969/j.issn.1004-616x.2022.03.011间充质干细胞最早在骨髓中被发现和鉴定，随后在人体胚胎及成体的多种组织中被陆续鉴定出来，这些组织主要包括成体骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带和脐带血等。
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection.2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days.（二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged.(三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。
人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离_培养_鉴定及冻存_复苏
见 明显钙结节;成脂诱导 14 d，有明显的脂滴出现，油红 O 染色阳性。 冻 存 再 复 苏 细 胞 活 力 达 80%，细 胞 免 疫 表 型 及 成
骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。 结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充
质干细胞，冻存、复苏不改变其特性。
[关键词] 人脐带间充质干细胞；华通氏胶；细胞培养；诱导分化；冻存
定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力；将 P1 细胞冻存 6 个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特 性。 结果：植块法容易从人
脐带华通氏胶中获得间充质干细胞； 组织块贴壁后 6 d 可见组织 块周围细胞爬出， 原代培养 14~18 d 细胞融合 70%~
80%；P3 代细胞强烈表达 CD73、CD90、CD105，不表达 CD14、CD34、CD45、CD79a 和 HLA-DR；成骨诱导分化后 10 d，可
图 1 剪成 2 cm 脐 图 2 剔 除 脐 静 脉 图 3 剥 离 的 华 通
带小段
及脐动脉
氏胶
1.2.2 脐带华通氏胶 MSCs 表型的测定 用流式细 胞仪对 P3 代 UC-MSCs 表面特异性抗原进行检测。 Tryple 酶消化待检细胞，PBS 洗涤 3 次，制成 1×106/ml 的细胞悬液。 将待检细胞样品分为每管 0.1 ml，加入 CD14 -FITC、CD45 -FITC、CD79a -APC、CD90 -APC、 CD34 -PE、CD73 -PE、CD105 -PE、HLA -DR -PE 一 抗，4 ℃孵育 30 min，流式细胞仪测定各类抗原的阳 性率。 1.2.3 脐 带 华 通 氏 胶 MSCs 诱 导 分 化 向 成 骨 细 胞 诱导分化：将 P3 代细胞消化后，调整细胞密度为 1×105/ml， 接 种 于 24 孔 板 内 ，1~2 d 后 细 胞 融 合 达 70%~80%， 此时以成骨细胞诱导培养液培养， 每 3 天全量换液 1 次，第 10 天茜素红染色；向脂肪细 胞 诱导分化：培养液改为成脂肪细胞诱导培养液，其余 同前，第 14 天油红 O 染色。 1.2.4 脐带华通氏胶 MSCs 的冻存、复苏 将 P1 代
人脐带间.充质干细胞最适宜培养条件研究
Ｄｅ ｐａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｈｕ ｍａ ｎ Ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｐ １ ０ ｇ ｙ， Ｎｉ ｎ ｇ ｂ ｏ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｈｅ ａ ｌ ｔ ｈ Ｓ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｎｉ ｎ ｇ ｂ ｏ ３ １ ５１ ０ ４
表面表达 Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 相关抗原 Ｃ Ｄ ２ ９ ，但不表达造血细胞相关抗原 Ｃ Ｄ ３ ４ ，表明此种 自脐带 中分离得到并诱 导扩增的成纤 维样细胞 为间充 质干细 胞。结论 ：优化 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 的培养条件 ，成功地建立稳定 的培养方法 ，可 提高 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 培养成功率 ，为 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 的实 验研究 和ｌ 床应用 打下
学 术 探 讨
Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｉ ｃ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ
中 国 民 族 民 间 医 药
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｊ ｏ ｕ ｍａ ｌ ｏ ｆ ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ・３ １・
胎儿脐带 ６份 ，分离培养 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ ，观察 比较不 同的新鲜程度 、不同分离方法在相同的培养条件下对 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 培养的影响 ，并 对优化条件下 培养的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 进行扩增 ，评估其贴壁 细胞形成集落数 。对 培养得 到的细胞进行 表面抗原标 志检测及其鉴定 。结果 ：从足月胎儿 新鲜脐带 中采用组织块贴壁的方法 ，在 ５ ％血 清浓度 的 Ｉ ＭＤ Ｍ 培养 基 中，分离 培养 得到 的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 成 功机 率最 高，且生成 集 落数 最多 为 （ ５ ． ３± ０ ． ２ ８ ） ×１ ０ ／ ０ ． ５ ｃ ｍ脐带组织 ，与双酶法 比较存在明显差异 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ０ １ ） ；而胶原 酶法接 种后未见 明显贴壁细胞 。培养 得到 的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 细胞
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。
WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。
在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。
分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。
脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。
获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。
分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。
具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。
细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。
具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。
鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。
免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。
活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。
多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。
结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。
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植块法分离培养人脐带间充质干细胞
胡文龙[1];杜玉丹[2];王丽丽[3];汪建样[1];耿书国[1];殷嫦嫦[3]
【期刊名称】《九江学院学报：自然科学版》
【年(卷),期】2015(030)004
【摘要】目的探讨体外植块法分离人脐带间充质干细胞的可行性,为体外获取纯度较高的人间充质干细胞提供理论基础。
方法采用植块法分离培养人脐带间充质干细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、增殖及形态学的变化,并采用CCK-8法绘制P3代细胞生长曲线。
结果脐带组织贴壁培养6~10d即可从组织块边缘爬出的成纤维样细胞,传代后,细胞均呈长梭形,以栅栏样、漩涡样及鱼群样贴壁生长,细胞间紧密排列,细胞生长曲线呈近似S型。
结论植块法能从人脐带组织中简便高效地分离出高纯度、高增殖活性的人脐带间充质干细胞。
【总页数】5页(P96-100)
【作者】胡文龙[1];杜玉丹[2];王丽丽[3];汪建样[1];耿书国[1];殷嫦嫦[3]
【作者单位】[1]南昌大学研究生院医学部江西南昌330006;[2]九江市妇幼保健院江西九江332000;[3]九江学院基础医学院江西九江332000
【正文语种】中文
【中图分类】TP393.2
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