大连理工大学 生化实验B
大连理工大学884物理化学及物理化学实验专...考研内部资料
考研专业课系列辅导之大连理工大学884物理化学及物理化学实验强化讲义全国考研专业课教研中心编光华职业教育咨询服务有限公司目录第一部分强化阶段的“一个目标两项任务” (3)第二部分强化课程主讲内容 (4)第一章化学热力学基础 (4)第二章相平衡热力学 (8)第三章相平衡状态图 (10)第四章化学平衡热力学 (17)第五章统计热力学初步 (20)第六章化学动力学基础 (21)第七章界面层的热力学及动力学 (28)第八章电解质溶液 (29)第九章电化学系统的热力学及动力学 (31)第十章胶体分散系统及粗分散系统 (36)第十一章物理化学实验 (38)第三部分历年真题解析 (39)3.1大连理工大学884物理化学及物理化学实验2010年真题解析 (39)3.2大连理工大学884物理化学及物理化学实验2009年真题解析 (39)3.3大连理工大学884物理化学及物理化学实验2008年真题解析 (41)3.4兄弟院校试题练习 (41)第四部分结束语 (83)第一部分强化阶段的“一个目标两项任务”专业课强化阶段学习时间是9月初至11月初，通过该阶段的学习，学员要达到“一目标”完成“两任务”。
“一个目标”是指做专业课真题自我模拟成绩达到最少120分。
得到这个分数，说明学员已经全面掌握了目标学校的考研基础知识点。
“两项任务”是指掌握教材知识点，研究真题并总结思路。
具体如下：强化阶段任务一：在认真学习完考研专业课公用知识点的基础上，扩展并掌握目标院校目标专业的考研知识点，完成强化、巩固过程，并逐步建立清晰的知识框架图，形成学员自有的知识体系，具体步骤如下（1）通识教材针对指定教材，毫无遗漏的将教材的章节知识点、例题及习题，仔细完整的进行一遍自学，并对把握不准的知识点做好标记；（2）阅读讲义在听课前，先自学一遍强化班讲义，在自学过程中，将讲义中涉及到的知识点标记在教材中。
如果同学还没有完成前面两步，我建议你暂时不要听课，先完成以上两个步骤，然后再听课，这样效果甚佳。
生理性生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解细菌生理生化反应原理；2. 掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法；3. 了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。
二、实验原理通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些糖的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物的多样性。
某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚反应阳性。
微生物发酵葡萄糖成丙酮酸，2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性条件下与肌酸类物质反应，生成红色物质，为甲基红反应阳性。
三、实验方法1. 吲哚试验：将细菌接种于含有色氨酸的培养基中，加入吲哚试剂，观察颜色变化。
2. 甲基红试验：将细菌接种于含有葡萄糖的培养基中，加入甲基红试剂，观察颜色变化。
四、实验结果1. 吲哚试验：接种了大肠杆菌的试管在加入乙醚和吲哚试剂后，能在乙醚和液体培养基的交界面上产生红色环状物质，大肠杆菌的吲哚试验显阳性。
2. 甲基红试验：大肠杆菌甲基红试验阳性，即大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH。
五、实验分析1. 吲哚试验失败原因分析：可能是因为乙醚加量太少，影响实验现象的观察；另一个可能的原因是大肠杆菌菌种有问题。
2. 甲基红试验结果分析：大肠杆菌在培养后仍能维持酸性，而产气杆菌则转化为非酸性末端产物。
六、实验结论1. 通过本实验，我们了解了细菌生理生化反应原理；2. 掌握了细菌鉴定中常见的生理生化反应方法；3. 认识到生理生化反应在鉴别细菌中的意义。
七、实验注意事项1. 实验过程中要严格按照操作规程进行，避免污染；2. 注意观察实验现象，记录实验数据；3. 分析实验结果，找出实验失败的原因。
第2篇一、实验目的1. 了解生理性生化实验的基本原理和方法。
2. 掌握常用的生理性生化指标及其检测方法。
3. 通过实验，学会使用生理性生化检测仪器，提高实验技能。
二、实验原理生理性生化实验是研究生物体内各种生化反应及其代谢过程的重要手段。
2022年大连理工大学微生物学专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年大连理工大学微生物学专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、放线菌孢子丝的形状有______、______和______之分，孢子丝的排列方式有______、______或______。
2、血凝抑制试验是根据特异性的病毒抗体与病毒表面蛋白作用可能抑制______性质设计的。
3、微生物的4种糖酵解途径中，______是存在于大多数生物体内的一条主流代谢途径；______是存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中的一种替代途径，为微生物所特有；______是产生4碳、5碳等中间产物，为生物合成提供多种前体物质的途径。
4、生长因子异养微生物很多，如______、______、______和______ 等。
5、真菌的特点有：①______；② ______；③ ______；④ ______；⑤ ______和⑥ ______等。
6、现代微生物学发展有以下几个特点：______，______，______，______，______，______。
7、利用干燥对微生物影响的原理，在日常生活中常用______、______ 和______等方法保存食物。
8、微生物生态学是生态学的一个分支，它的研究对象是______与其周围的______和______环境条件间的相互作用规律。
9、普通性转导的基本要求是______，它可能出现的三种后果是______、______和______。
10、常用的特异性免疫治疗剂有______、______、______和______等。
二、判断题11、芽孢杆菌必须处于不利的环境下才形成芽孢。
（）12、有些假单胞菌可以利用多达90种以上的碳源物质。
（）13、在肽聚糖的合成过程中，各个肽聚糖单体间的交联仅靠转肽作用即可完成。
（）14、一步生长曲线是用于描述温和噬菌体生长规律的一种实验曲线。
（）15、游动孢子只存在于鞭毛菌和子囊菌的无性世代中。
（）16、“三域学说”是根据对大量微生物DNA的测定后而提出的。
生化大实验——精选推荐
实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。
以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。
两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。
与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。
1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。
然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。
这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。
密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。
颗粒在梯度中移动的快慢。
取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。
在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。
用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
通过这种方法可粗略的分离叶绿体。
大连理工大学2024年硕士招生考试自命题科目考试大纲 630 无机化学及无机化学实验
大连理工大学2024年硕士研究生入学考试大纲科目代码：630 科目名称：无机化学及无机化学实验具体复习大纲如下：一、气体和溶液1、理想气体的概念、理想气体状态方程、理想气体状态方程的应用.2、混合气体中组分气体、分压的概念，分压定律、分体积定律.3、真实气体与理想气体的差别.4、液体的蒸发及饱和蒸汽压.5、稀溶液的依数性.二、热化学1、系统、环境、相、热、功、热力学能和焓等概念.2、热力学第一定律.3、热化学方程式、化学反应的标准摩尔焓变（Δr H mӨ）.4、物质的标准摩尔生成焓（Δf H mӨ）、物质的标准摩尔燃烧焓（Δc H mӨ）.5、Hess定律及有关计算.三、化学反应速率1、化学反应速率、（基）元反应、复合反应等概念.2、反应速率方程、速率系数、反应级数的确定.3、活化分子、活化能等概念、阿伦尼乌斯方程.4、用碰撞理论和活化络合物理论说明浓度、温度和催化剂对反应速率的影响.四、化学平衡熵和Gibbs函数1、化学平衡、标准平衡常数、平衡组成的计算、多重平衡规则.2、反应商判据、Le Chaterlier原理.3、浓度、压力、温度对化学平衡移动的影响及相关计算.4、熵的概念、吉布斯函数的概念，物质的标准摩尔熵S mӨ、物质的标准摩尔生成Gibbs函数、反应的Δr S mӨ和Δr G mӨ的简单计算，Δr G mӨ与Δr H mӨ和Δr S mӨ的关系、Δr G mӨ与KӨ的关系.5、介绍反应的Δr G m，用Δr G m和Δr G mӨ判断反应进行的方向和程度.五、酸碱平衡1、酸碱质子理论、水的解离平衡、水的离子积常数、常见酸碱指示剂的变色范围.2、强酸、强碱溶液有关离子浓度和pH的计算.3、一元（多元）弱酸（碱）的解离平衡、解离常数和平衡组成的计算.4、一元弱酸强碱盐和一元强酸弱碱盐的水解平衡、水解常数和平衡组成的计算.5、多元弱酸强碱盐的分步水解及其平衡组成的计算、酸式盐溶液pH的近似计算.6、同离子效应、缓冲溶液、缓冲能力、缓冲溶液pH的计算.7、酸碱电子理论、配合物的基本概念、配合物的命名、配合物的不稳定常数和稳定常数、配体过量时配位平衡组成的计算、酸碱反应与配合反应共存时溶液平衡组成的计算.六、沉淀-溶解平衡1、难溶电解质的沉淀-溶解平衡、标准溶度积常数、标准溶度积常数与溶解度之间的关系和有关计算.2、溶度积规则、用溶度积规则判断沉淀的生成和溶解.3、pH对难溶金属氢氧化物沉淀-溶解平衡的影响及有关计算、沉淀的配位溶解及其简单计算.4、分步沉淀和两种沉淀间的转化及有关计算.七、氧化还原反应电化学基础1、氧化还原反应的基本概念、氧化反应方程式的配平.2、原电池的基本概念、电池电动势的概念.3、电极电势的概念及其影响因素、Nernst方程式及其相关计算、电极电势的应用.4、元素电势图及其应用.八、原子结构和元素周期律1、氢原子光谱、Bohr原子结构理论、电子的波粒二象性、量子化和能级、原子轨道、概率密度、概率、电子云.2、四个量子数的名称、符号、取值和意义.3、s、p、d原子轨道与电子云的形状和空间伸展方向.4、多电子原子轨道能级图和核外电子排布的规律、写出常见元素原子的核外电子排布、根据核外电子排布确定它们在周期表中的位置.5、周期表中元素的分区、结构特征.6、原子半径、电离能、电子亲和能和电负性的变化规律.九、分子结构1、化学键的分类、共价键价键理论的基本要点、共价键的特征和类型.2、杂化轨道理论的概念和类型、用杂化轨道理论解释简单分子和离子的几何构型.3、价层电子对互斥理论的要点、用价层电子对互斥理论推测简单分子或离子的几何构型.4、分子轨道的概念、第二周期同核双原子分子的能级图、电子在分子轨道中的分布、推测第二周期同核双原子分子（离子）的磁性和稳定性（键级）.5、键级、键能、键长、键角等概念.十、晶体结构1、晶体的类型、特征和组成晶体的微粒间的作用力.2、金属晶体的三种密堆积结构及其特征、金属键的形成和特征.3、三种典型离子晶体的结构特征、晶格能的概念、离子电荷和半径对晶格能的影响、晶格能对离子化合物熔点、硬度的影响、晶格能的热化学计算方法.4、离子极化及其对键型、晶格类型、溶解度、熔点、颜色的影响.5、键的极性和分子的极性、分子的偶极矩和变形性及其变化规律、分子间力的产生及其对物质性质的影响.6、氢键形成的条件、特点及对物质某些性质的影响.7、过渡性晶体结构（如：层状晶体）.十一、配合物结构1、配合物价键理论的基本要点、配合物的几何构型与中心离子杂化轨道的关系、内轨型和外轨型配合物的概念、中心离子价电子排布与配离子稳定性和磁性的关系.2、配合物晶体场理论的基本要点、八面体场中d电子的分布、高自旋和低自旋配合物、推测配合物的稳定性和磁性、配合物的颜色与d-d跃迁的关系.十二、s区元素1、碱金属和碱土金属的通性、单质的重要物理性质和化学性质.2、碱金属和碱土金属的重要氢化物、氧化物、过氧化物、超氧化物的生成和基本性质.3、碱金属和碱土金属氢氧化物碱性强弱的变化规律、重要盐类的溶解性和稳定性.4、锂和铍的特殊性、对角线规则.十三、p区元素（一）1、硼族元素的通性、缺电子原子和缺电子化合物的概念、乙硼烷的结构和重要性质、硼酸的晶体结构和性质、硼砂的结构和性质、硼的卤化物的结构和水解.2、铝及其重要化合物的性质.3、碳族元素的通性、碳单质的结构、碳的氧化物、碳酸及其盐的重要性质、用离子极化理论说明碳酸盐的热稳定性.4、硅单质、硅的氢化物、硅的氧化物、硅酸及其盐的重要性质.5、硅的卤化物的结构和水解.6、锡和铅的氧化物和氢氧化物的酸碱性及其变化规律、Sn(Ⅱ)的还原性、Pb(Ⅳ)的氧化性、锡和铅硫化物的颜色、生成和溶解性.十四、p区元素（二）1、氮族元素的通性、氮分子的结构和特殊稳定性、铵盐的性质、氮的氧化物的结构、硝酸的结构和性质、硝酸盐和亚硝酸盐的性质.2、磷的单质、氢化物、氧化物、卤化物的结构和性质.3、磷酸及其盐的性质、亚磷酸、次磷酸、焦磷酸、聚磷酸、聚偏磷酸的结构和性质.4、砷、锑、铋氧化物及其水合物的酸碱性及其变化规律.5、砷、锑、铋化合物氧化还原性的变化规律和重要反应.6、砷、锑、铋硫化物的颜色、生成和溶解性及砷、锑的硫代酸盐.7、氧族元素的通性、氧单质的结构和性质、过氧化氢的结构和性质及其重要反应.8、硫单质的结构和性质、硫化氢的性质、金属硫化物的溶解性、多硫化物的性质、二氧化硫和三氧化硫的结构、亚硫酸及其盐的性质、硫酸及其盐的性质、硫代硫酸盐的结构和性质、过二硫酸盐的结构和性质、焦硫酸盐和连二亚硫酸盐的性质.十五、p区元素（三）1、卤素的通性、卤素单质的制备和性质、卤化氢的制备及其性质（还原性、酸性、稳定性）的变化规律、氯的含氧酸及其盐的性质及其变化规律、溴和碘的含氧酸的基本性质.2、稀有气体的重要性质及其变化规律、稀有气体化合物及其几何构型.3、p区元素的氢化物、氧化物及其水合物性质的递变规律.4、p区元素化合物的氧化还原性递变规律、p区元素含氧酸盐的热稳定性递变规律.十六、d区元素（一）1、过渡元素的原子结构特征和通性.2、钛单质的性质和用途.3、铬单质的性质、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)化合物的酸碱性和氧化还原性及其相互转化，杂多酸盐磷钼酸铵.4、Mn(Ⅱ)、Mn(Ⅳ)、Mn(Ⅵ)、Mn(Ⅶ)重要化合物的性质.5、Fe(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)重要化合物的性质及其变化规律.6、Fe(Ⅲ)、Co(Ⅲ)、Ni(Ⅲ)重要化合物的性质及其变化规律.7、铁、钴、镍的重要配合物.十七、d区元素（二）1、铜族元素的通性.2、铜的氧化物、氢氧化物、重要铜盐的性质.3、Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)相互转化、铜的重要配合物、水溶液中Cu2+的重要反应.4、银的氧化物和氢氧化物的性质、银的重要配合物、水溶液中Ag+的重要反应.5、锌族元素的通性、氢氧化锌的性质、水溶液中Zn2+的重要反应、锌的重要配合物.6、镉的重要化合物的性质.7、汞的重要化合物的性质、Hg(Ⅰ)和Hg(Ⅱ)间的相互转化、水溶液中Hg2+和Hg22+的重要反应.十八、无机化学实验1.实验基本操作：加热、洗涤、过滤等无机化学实验操作。
全国各高校的生物医学工程专业的排名
排名 学校名称 等级 排名 学校名称 等级 排名 学校名称 等级
1 浙江大学 A+ 2 四川大学 A+ 3 上海交通大学A 4 东南大学 A 5 西安交通大学A 6 天津大学 A 7 清华大学 A 8 华中科技大学 A 9 南方医科大学 A 10 大连理工大学 A
学生在校期间主要学习化学、生物学、食品工程学及计算机等方面的基本理论和基本知识，接受食品生产技术、新产品研制、新资源开发和高附加值功能食品开发等方面的基本训练。本专业涉及国民经济和日常生活密切相关的肉类、粮油、糖果、糕点、饮料、酒类、水果、调味品等31个食品行业，就业范围较广 可适应生产技术管理、质量检测、品质控制、科学研究、工程设计等领域从事研究、管理、教学等工作。
C 等 (11 个 ) ： 太原理工大学、上海大学、江苏大学、天津工业大学、南京大学、云南大学、苏州大学、中南民族大学、哈尔滨工程大学、山东中医药大学、武汉理工大学 有人预言21世纪是生物科学的世纪，谁掌握了生命科学，谁就主宰了一切。20世纪70年代后，生物科学的新进展如雨后春笋，层出不穷。从总体上看，当代生物科学主要朝着微观和宏观两个方面发展：在微观方面，生物学已经从细胞水平进入到分子水平去探索生命的本质；在宏观方面，生态学的发展正在为解决全球性的资源和环境等问题发挥着重要作用。
在实际教学过程中，有的高校生物科学专业与生物工程（技术）专业课程设置却大致相同。以清华大学为例，生物科学与技术系是培养在生物科技领域从事科学研究、教学和应用开发工作的高水平人才的专门系科，设有生物科学和生物技术两个本科专业。虽然分为两个专业，但课程安排和教学内容上并没有多大区别，只是在写毕业论文时各有侧重。
主要专业课程：有机化学、生物化学、食品营养学、食品化学、食品微生物学、微生物学、饮料工艺学、食品安全与质量控制、食品生物技术、食品工程原理、食品工艺原理、机械设计基础等。
2022年大连理工大学(盘锦校区)生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年大连理工大学(盘锦校区)生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、革兰氏染色步骤分为______、______、______和______，其中关键步骤是______；染色结果凡呈紫色的菌为______，呈红色的菌为______。
2、T4噬菌体由______、______和______三部分组成。
3、硫细菌是以______作为呼吸链的最终电子受体，并产生______的生物氧化作用。
4、作为微生物营养要素之一的水，它的主要功能有______、______、 ______以及许多优良的物理性质，如______、______、______和______ 等。
5、真核生物鞭毛杆的横切面为______型，其基体横切面则为______ 型，这类鞭毛的运动方式是______。
6、微生物学发展史上发展期的实质为______水平研究，其主要特征是：① ______，②______，③ ______，④ ______，⑤ ______。
7、许多因素会影响加压蒸气灭菌的效果，主要有：① ______，② ______，③ ______，④ ______，以及⑤ ______等。
8、自然界的碳素循环主要包括______和______两个过程。
9、在诱变工作中，常用的物理诱变剂如______、______和______等；化学诱变剂如______、______、______和______等，其中的______ 有“超诱变剂”之称。
10、由酵母多糖、LPS等多种微生物及其产物从______和______因子开始的补体激活途径称______。
它的C3转化酶是______，C5转化酶是______，攻膜复合体是______。
二、判断题11、G＋细菌和G－细菌在鞭毛构造上是相同的。
（）12、促进扩散可实现营养物从外界环境中逆浓度梯度输入到细胞内。
（）13、EMP途径主要存在于厌氧生活的细菌中。
（）14、朊病毒是以蛋白质为主并含有微量核酸的分子病原体。
生化需氧量的测定
500~1000 重度污染的工业废水
实验步骤
1 硫代硫酸钠标定。
2 在碘量瓶中装稀释水2瓶(空白)。 3 稀释5两个倍数的水样(50倍、100倍)，每个稀释倍数 的水样装碘量瓶两瓶。不要有气泡, 在量筒中稀释 4 测培养前的DO(空白+2个样品)。
5 1个空白和2个样品进行标记，置于托盘中，放入培 养箱中20 ℃培养。 6 5天后，硫代硫酸钠标定及水样DO测定。
实验目的和要求
1. 了解BOD5间接表示水体中有机物含量的意
义和稀释法测定BOD5的基本原理;
2. 掌握一般稀释水的制备和稀释倍数的选择;
3. 掌握碘量法测定溶解氧的方法;
4. 掌握BOD5测定方法与操作规程。
实验原理
20℃五日培养法（BOD5法）：分别测
定水样培养前的溶解氧含量和在201C
经稀释，而直接以虹吸法，将约20℃的混匀水样转移
入两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使产生气泡。
以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许， 加塞。瓶内不应留有气泡。 其中一瓶随即测定溶解氧，另一瓶的瓶口进行水 封后，放入培养箱中，在20±1℃培养5d。
BOD5 (mg/L) C1 C2
稀释倍数的确定
2. 稀释水样的测定 稀释倍数的确定： 典型的R值
BOD5/TOC 未处理废水 经生化处理的废 水 1.2~2.8 0.3~1.0 BOD5/IMn 1.2~1.5 0.5~1.2 BOD5/COD 0.35~0.65 0.2~0.35
稀释倍数的确定
水样的稀释倍数
BOD5期望值 (mg/L) 稀释倍数 水样类型
分工合作
水样的稀释：公用稀释水、体积计算
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2014年生物化学实验B实验报告姓名：姓名学号：201247044实验时间：2014.11.15实验分组：第七组组内成员：组员201247002组员201247020组员201247060 任课教师：李晓晖小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定考马斯亮蓝法测定蛋白质含量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量组员1，组员2，组员3，组员4化工与环境生命学部 化工学院 化学工程与工艺（国际）1201班摘要 本文以从小牛肠中提取碱性磷酸酶为例，介绍了生物体中分离、提取酶的方法，以及如何使用考马斯亮蓝法测定所提取酶的蛋白含量并以此得出酶活。
同时通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定给定蛋白质样品的相对分子质量。
关键词 小牛肠碱性磷酸酶 酶活 对硝基苯酚 吸光值 考马斯亮蓝R-250 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量碱性磷酸酶（AKP,EC 3.1.3.1）是一种非特异性水解酶，广泛存在于动物各脏器、微生物和植物中。
它在体外能催化多种磷酸单脂类化合物的水解，得到相应的醇。
不同来源的AKP ，其分子量和亚基结构各不相同。
小牛肠碱性磷酸酶相对分子质量为145000，等电点为7.5。
在体外可催化底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，后者在405nm 光波长下有最大吸收，通过测定吸光值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力。
酶活定义：在最适条件下，以每分钟催化水解1µmol 底物的酶量为一个酶活力单位。
本实验温度取37℃。
酶活力的计算：酶活力（u/mg ）=L C V DV A E R ⨯⨯⨯⨯⨯∆405E min /式中，∆A/min 为405nm 波长下的吸光值的变化率；V R 为反应液的体积，D 为稀释倍数；E 405为405nm 波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数，18.3；V E 为所加酶液体积；C 为蛋白浓度；L 为比色皿光程。
考马斯亮蓝R-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝R-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为465nm ，后者为595nm 。
在一定蛋白浓度范围内（0.01-1.0mg/L ），蛋白质-色素结合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、分析蛋白质的常用方法，在科研工作中，经常需要从凝胶中回收蛋白质，用于蛋白质的测序和制备抗体[1]。
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷、大小、性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。
但如果加入足够量十二烷基硫酸钠（SDS ）和巯基乙醇，SDS 就可以使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质-SDS 复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于相对分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的相对分子质量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH与离子强度不同于配胶缓冲液。
该凝胶包括浓缩胶和分离胶两部分。
当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的浓缩胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变形和解聚，解离成亚甲基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子质量。
1 实验部分1.1试剂与仪器（1）试剂①正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）。
②1mol/L乙酸（CH3COOH）,1mol/L NaOH，硫酸铵，对硝基苯磷酸二钠，二乙醇胺，盐酸。
③平衡缓冲液：0.01mol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.0×10-3mol/L MgCl2和1.0×10-5mol/L ZnCl2。
④底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液(pH9.8)，含1.0×10-3mol/L MgCl2。
⑤酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。
⑥考马斯亮蓝G-250溶液。
⑦ 30%丙烯酰胺。
⑧分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，已加入10% SDS）、浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8)，已加入10% SDS）⑨ 10%过硫酸铵（AP）、TEMED（四甲基乙二胺）⑩上样缓冲液（称100mg SDS，2mg溴酚蓝，2g甘油，加0.1mL巯基乙醇，2ml 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至10mL）、染色液(配制含0.1%考马斯亮蓝R250，体积分数40%甲醇，体积分数10%冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用)、脱色液（500mL体积分数10%甲醇和体积分数10%冰醋酸的脱色液1000mL）、电泳缓冲液（含0.1% SDS，0.05mol/L Tris，0.384mol/L 甘氨酸pH8.3）。
（2）仪器及耗材离心管，剪刀，载玻片，冰冻离心机，滤布，量筒，烧杯，移液枪，试管，制胶板，染色缸，所需仪器见下表。
1.2 实验过程（一）小牛肠碱性磷酸酶的提取与酶活测定(1) 酶的分离①取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片将肠黏膜刮下，加入匀浆机中高速匀浆15s，重复二十次。
②用量筒量体积后放入烧杯中，加入1.5体积的蒸馏水，摇匀。
③缓缓加入1倍体积的冰冷正丁醇，摇匀，将匀浆倒入离心管中，配平，4℃、10000r/min 离心15min。
④取下层水相，用滤布过滤除杂质，把清液倒入分液漏斗静置取下层清液，然后用1mol/L HAc调pH到4.9，4℃下10000r/min离心10min。
⑤取上清（12.9mL），用1mol/L NaOH调pH至6.5，加入5%的硫酸铵0.6455g，摇匀至溶解后，再加入0.47倍体积（6.1mL）的冰冷丙酮，混匀，4℃放置41min。
⑥4℃、10000r/min离心10min，除去沉淀，向上清液（18.5mL）中加入1.07倍体积（19.8mL）的冰冷丙酮，4℃放置31min。
⑦ 4℃、10000r/min离心10min，保留沉淀，逐渐加入平衡缓冲液，使沉淀刚好完全溶。
（2）酶活力的测定①取150µL酶的底物溶液，置于37℃水浴中10min；②用平衡缓冲溶液将酶液稀释10倍（10µL酶溶液稀释至100µL）；③取两个2mL（0.5光程）比色皿，各加入1.5mL底物缓冲液，放入分光光度计中校对归零；④取出其中一个加入20µL稀释后的酶液，迅速摇匀，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线，读出吸光值的变化率。
（二）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量①玻璃试管中加入5ml考马斯亮蓝。
②在1.5ml离心管中，取实验一（1）中的酶液10µL分别稀释25、50、100倍。
③各取100µl加入到5ml考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5min以上（观察溶液至浅蓝色）。
④紫外分光光度计检测条件：595nm波长；⑤取2个比色皿（1cm光程），加入考马斯亮蓝（比色皿的2/3），分光光度计中校对归零。
将样品放入外侧比色皿中，读取吸光值（0.1-0.5之间）。
根据蛋白质浓度标准曲线计算蛋白质浓度。
（三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量（1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。
（2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。
分离胶配制最后加入TEMED,应快速摇匀分离胶，向玻璃板间隙，沿着长玻璃板的内侧缓缓注胶，然后再用移液枪贴壁慢慢移动注入乙醇200µL，以防止氧气进入胶内。
15min后，分离胶和乙醇之间出现分界线，表明分离胶凝固，倒出乙醇。
（3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。
浓缩胶配制一旦加入TEMED，应快速摇匀浓缩胶，在已凝固的分离胶层上加浓缩胶，立即将梳子插入胶液顶部，避免进入气泡，放置待浓缩胶凝固。
（4）蛋白样品处理：在1.5mL离心管中按1:1体积比加入样品和上样缓冲液，100℃加热3min 使蛋白质变性。
（5）27min后，浓缩胶聚合完全，去掉夹子和胶条，拔去梳子，把凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。
（6）用移液枪在泳道加样（1-4道为SW混合样品，7-10道为SB混合样品，5道为标准样）。
（7）电泳：连接正负极，打开电源，开始时，电流控制在40A，样品进入分离胶后，缓慢升高电压至140V。
保持电流强度不变，2.35h后溴酚蓝指示剂迁移至下沿处，停止电泳。
（8）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用金属片从玻璃两侧轻轻撬开，使板内进入空气，同时用水冲洗，取出凝胶板。
将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色15min。
（9）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，30min换一次脱色液，脱色至背景清晰。
（10）观察测定蛋白质迁移率以及条带，对比标准样品，分析蛋白质的纯度和分子量。
2 结果与讨论2.1 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量根据考马斯亮蓝法测定蛋白质的标准曲线,如下图可得吸光度与蛋白质溶液浓度的关系函数为 y=0.697x-0.007，实验所测的蛋白质溶液稀释25倍，50倍，100倍时，其吸光度分别为0.5330，0.3199，0.1526，代入方程计算并乘于稀释倍数得到各蛋白质浓度分为50倍：21.50mg/mL，100倍：21.00mg/mL。
求平均值可得原蛋白溶液的浓度为21.25mg/mL。
2.2 小牛肠碱性磷酸酶酶活计算公式：酶活力（u/mg ）=根据酶动力学曲线，如下图估算得曲线的斜率A/min 为1.1062。
V R =1.5mL ，D=10，E 405=18.3L/（mol ×cm ），V E =0.020mL ，C=21.25mg/mL ，L=0.5cm 。
带入上述公式求得：酶比活力（u/mg ）=4.267u/mg 。
2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量L C V DV A E R ⨯⨯⨯⨯⨯∆405E min /∆图1从图1中可以看出，mark 中出现四条蛋白质标记线，对照标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线（图3）及各低分子量蛋白的组成（图2），根据其间距及参考给出的mark 泳道各蛋白质标记线间距，可判定mark 泳道中四条线从上到下分别是兔磷酸化酶B ，牛血清白蛋白，兔肌动蛋白和牛碳酸酐酶。