变色龙7.1体系下双三元液相色谱在线样品处理应用指南

智能液相色谱解决方案（四）变色龙7.1体系下双三元液相色谱在线样品处理应用指南1.综述在色谱分析方法中，获得一致且准确的分析结果，样品前处理过程，如溶解，稀释，过滤等，是必不可少的。

对于基质简单的样品（如合成化学品），则样品处理过程比较简单，操作方便，耗时短。

但对于基质复杂的样品（如土壤、生物发酵液、天然产物），则前处理过程会很复杂(如粉碎、提取、富集、液液萃取等)，操作繁琐，耗时长，存在安全隐患，因此不利于日常分析工作。

对于复杂样品前处理，U3000液相色谱可提供完美的整体解决方案。

当U3000液相色谱具有如下配置，则可以进行在线样品处理●双三元梯度泵(DGP-3600)●自动进样器（WPS-3000 SL/TSL）●柱温箱（TCC-3000），配置有2位-6孔(2-position-6-port)或2位-10孔(2-position-10-port)柱切换阀●一根富集（或纯化）小柱●一根分析柱●一台检测器（DAD,FLD,CAD,MSD）同传统离线手工样品处理技术相比较，在线样品处理解决方案具有如下特点：可以引入大体积的未经处理的样品溶液（如血浆，尿液，发酵液，环境水等）自动对样品进行纯化或富集痕量组分，无需投入过多人力，可长时间自动运行（如过夜连续操作）避免人工操作所带来的误差，方法重复性好，结果准确耗时短，操作简便，成本低，工作效率高最大程度降低人员操作所带来的危害和风险2.在线样品处理步骤在线自动样品处理过程包括三个过程（如图1所示）：1、样品组分由进样器与左泵流动相引入到富集（或纯化）上进行富集（或纯化），干扰物（或基质）则从柱上流出并排至废液收集器，分析柱处于清洗与平衡的过程(Sample.Fraction)，2、目标组分由富集（或纯化）柱上转移至分析柱的过程(Transfer/Separation)，3、目标组分在分析柱上定性（或定量）分析，富集（或纯化）柱则进行离线清洗和平衡的过程(Separation)在线样品处理方法开发过程中，正确设置阀的切换时间对分析效果有着重要影响。

通常要设置：1、组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2），2、基质流出时间（t M ），3、阀第一次切换时间（t V1），4、组分转移时间（t T ），5、第二次阀切换时间（t V2）、6、分析条件第一步：确定组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）（如图2所示）：方法：将富集柱与检测器（如UV ）直接连接（切换阀位于1-2连接）。

将组分标准品（浓度接近样品组分浓度，如果富集柱峰形可能比较差，为了便于观察出峰位置，建议适当地浓图2 确定组分洗脱时间时的仪器连接图及洗脱时间示意图图1 在线样品处理过程示意图部件名称：1双三元梯度泵(Dual-Gradient Pump)，2自动进样器(Autosampler)，3富集（或纯化）柱(SPEcolumn)，4分析柱(Analytical column)，5检测器(Detector)，6柱切换阀(Valve)度大一些）由进样器引入至富集柱，观察组分在检测器形成的信号响应，直至基线恢复初始状态，记住组分的起始时间t A1和组分的截止时间t A2，调节左泵流动相条件，使组分在富集柱上有所保留（建议t A1>5min）。

第二步：确定基质流出时间（t M）(如图3所示):图3 确定基质流出时间时的仪器连接图及基质流出时间示意图方法：将富集柱与检测器（如UV）直接连接（切换阀位于1-2连接），左泵流动相条件与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将样品由进样器引入至富集柱，由检测器上观测基线情况，记住当基质流出后基线基本恢复到初始状态时（此时目标组分仍保留在富集柱上，要求t A1> t M时）的时间点t M，t M为基质流出时间。

第三步：验证组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）和基质流出时间（t M）(如图4所示):图4 验证组分洗脱时间时的仪器连接图及基质流出时间、组分洗脱时间示意图方法：将富集柱与检测器（如UV）直接连接（切换阀位于1-2连接），左泵流动相条件与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将加标的样品（加标浓度最好与第一步中确定组分洗脱时间时的标准品一致）由进样器引入至富集柱，由检测器上观测基线情况，如上图所示，记住组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）和基质流出时间（t M），一般情况下基质流出时间（t M）不会变化，组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）会有所变化，要求t A1> t M。

第四步：确定阀第一次切换时间（t V1）：方法：设置第一次切换时间（t V1），使t A1> t V1> t M。

第五步：确定组分转移时间（t T）（如图5所示）：图5确定组分转移时间时的仪器连接图及转移时间示意图方法：将切换阀1位置直接与检测器连接（切换阀最初位于1-2连接）。

左泵流动相条件与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将标准品溶液通过进样器引入至富集柱上，在阀第一次切换时间（t V1）时通过软件将柱切换阀由1-2连接转换为1-6连接，调节右泵流动相条件，观察标准品由富集柱转移出来并经检测器得到响应信号，直至标准品组分完全流出，记住检测器基线恢复至初始状态时的时间点为样品转移时间（t T）。

在调节右泵流动相条件的过程中，每次需要再次进样时，需要手动到控制面板的柱温箱模块里将柱切换阀由1-6连接转换为1-2连接且自动进样器改为“进样(Inject)”状态，然后使用初始左右泵流动相条件平衡富集柱5分钟后才能再次进样。

第六步：验证转移时间（t T）（如图5所示）：方法：将切换阀1位置与检测器直接连接（切换阀最初位于1-2连接）。

左泵流动相条件与最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将加标的样品（加标浓度最好与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法时的标准品一致）溶液通过进样器引入至富集柱上，在阀第一次切换时间（t V1）时将柱切换阀由1-2连接转换为1-6连接，使用第五步确定组分转移时间的最终右泵流动相条件，观察组分由富集柱转移出来并经检测器得到响应信号，直至组分完全流出，记住检测器基线回复至初始状态时的时间点为组分转移时间（t T）。

要求第六步的组分转移时间（t T）与第五步的组分转移时间（t T）保持一致。

然后手动将柱切换阀由1-6连接转换为1-2连接且自动进样器改为“进样(Inject)”状态，使用初始左右泵流动相条件平衡富集柱5分钟之后，再将未加标样品溶液通过进样器引入至富集柱上，重复上述动作，观察加标样品里组分出峰位置，应该没有组分峰的出现。

第七步：确定第二次阀切换时间（t V2）：方法：设置第二次切换时间（t V2），使t V2> t T。

第八步：确定分析条件（连接如图6所示所示）：方法：将富集柱及分析柱按照正常的online SPE连接方式连接后，在第二次阀切换时间（t V2）后调节右泵的流动相条件，确定最终的分析条件。

而在阀第二次切图6 确定分析条件时的仪器连接图及转移时间示意图换时间（t V2）之后，富集柱是用左泵进行离线清洗和为下次进样而进行的平衡过程。

3.使用变色龙7.1版本建立在线样品处理方法步骤基于上述各时间点的信息，运用变色龙(Chromeleon 7.1)色谱管理软件建立的online SPE 方法整个过程如图7所示：图7 Online SPE方法过程示意图下面案例中将介绍在变色龙(Chromeleon , Ver.7.1, SR1)色谱管理软件方法建立过程。

首先，在配置模块(Server Configuration)里确保柱温箱已配置有切换阀（2位-6孔或2位-10孔），如图8所示：图8 配置模块(Server Configuration)所在位置在打开配置模块后，选择相应的色谱系统（Instrument）中柱温箱部件，在工具栏上选择“编辑(Edit)”下的“属性(Properties)”选项（或右键单击选择该选项）。

本例中选择Demo 系统，并右键单击选择“属性”，如图9所示：图9色谱系统（Instrument）中柱温箱配置在柱温箱“属性”窗口中，选择“部件(component)”栏，根据仪器实际配置（左部或右部）选择相应的柱切换阀和安装的两根色谱柱（富集柱和分析柱）。

本例中选择右部安装2位-6孔(2-position-6-port valve)和柱A和B，如图10所示：图10柱温箱阀配置上述设置完成后，保存设置并退出配置模块。

打开变色龙软件，点击菜单栏中“创建(Create)”下的“仪器方法(Instrument method)”，如图11所示：图11仪器方法(Instrument method)的建立所在位置在出现的窗口中，选择相应的色谱系统。

本例中选择Demo系统，如图12所示：图12 选择相应的仪器系统点击“下一步(next)”，进行相应色谱配置（如图13所示），选择相应的运行时间(Run Time)以及不同的通道(Channel)。

图13 选择相应的仪器系统点击“下一步(Next)”，进行上样泵（左泵(PumpLeft)）的设置，输入流动相的基本信息，如图14所示：图14 上样泵（左泵(PumpLeft)）的流动相基本信息继续点击“下一步(Next)”，进行上样泵（左泵(PumpLeft)）流动相梯度设置，如图15所示：图15 上样泵（左泵(PumpLeft)）流动相梯度设置本例中设置左泵上样时流动相为90%A及10%B，流速为1ml/min，样品进入富集柱后在接下来的4分钟内进行富集（或纯化）及转移至分析柱，4分钟后对富集柱进行冲洗和平衡。

输入具体的流动相梯度后后，继续点击“下一步”，进行分析泵（右泵(PumpRight)）的设置，输入流动相的基本信息，如图16所示：图16分析泵（右泵(PumpRight)）的流动相基本信息继续点击“下一步(Next)”，进行分析泵（右泵(PumpRight)）流动相梯度设置，如图17所示：本例中设置右泵分析时，流动相A 在11分钟内由10%升至90%，然后再平衡至10%的初始状态，流速为1ml/min ，最初的4分钟是组分的富集和转移过程，4分钟之前，分析柱在右泵初始流动相条件下进行平衡，4分钟之后，切换阀位于1-2位连接，右泵开始梯度进一步分离并对目标组分进行定性（或定量）分析，分析结束后进行清洗和平衡。

输入具体的流动相梯度后后，继续点击“下一步”，对自动进样器的参数进行设置，如图18所示：图18 自动进样器的参数设置-1图17分析泵（右泵(PumpRight)）流动相梯度设置继续点击“下一步(Next)”，如图19所示，选择与自动进样器连接（也就是与富集柱连接）的泵：继续点击“下一步(Next)”，如果“自动进样器(Sampler)”是带控温功能，需要选择是否启动“控温功能（Use Temperature Control ）”及控温的范围（如图20所示）：图20 控温功能的自动进样器的参数设置图19 自动进样器的参数设置-2继续点击“下一步(Next)”，设置柱温箱的基本信息（如图21所示）：图21 柱温箱的基本信息的设置继续点击“下一步(Next)”，设置左右泵相应的色谱柱（如图22所示），本案例选择富集柱A连接左泵，分析柱B连接右泵，左泵用于样品富集（或纯化），右泵用于在线分析，切换阀位于柱温箱右侧，当柱切换阀处于1-2位相连时，样品由自动进样器引入至富集柱上进行富集，分析柱则处于清洗和平衡过程，如图6连接所示图22设置左右泵相应的色谱柱点击“下一步(next)”，在“柱温箱(Column Oven)”模块下（如图23所示），分别在每一步里按照要求输入第一次阀切换时间（t V1）和第二次阀切换时间（t V2）。