色谱峰,色谱柱及全参数
色谱图和峰参数
色谱图和峰参数色谱图和峰参数Ø色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
Ø基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
Ø噪音(noise)——基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
Ø漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
Ø色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。
不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
Ø拖尾因子(tailing factor，T)——T,，用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T,0.95为前延峰，T,1.05为拖尾峰。
Ø峰底——基线上峰的起点至终点的距离。
Ø峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。
Ø峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W,4σØ半峰宽(peak width at half-height，W)——峰高一半处的峰宽。
Wh/2h/2,2.355σØ标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x,?1时(拐点)的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
色谱柱参数
色色谱谱柱柱的的参参数数
载碳量
硅胶表面键合相的比例 与比表面积，键合覆盖度等有关 对ODS，载碳量从7-18%（ODS-100Z为20%）不等 ODS的载碳量高， 则保留增加，适合分析非极性化合
物。制备色谱的上样量也可以增加 载碳量通常影响选择性
色色谱谱柱柱的的参参数数
硅胶表面性质-纯度
Super-ODS为2 μm 填料，UPLC为1.7 μm填料 3cm以下的制备色谱柱通常使用5-10 μm填料 更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径，如10 μm, 或20 μm
色色谱谱柱柱的的参参数数
孔径
孔径小，含孔率高，则 比表面积大，载碳量高
化合物在孔内分离 孔径大小必须和分子大小相匹配，分子必须能进入孔内，一般小分
CH3
monomeric bonding
柱效高, 平衡快
OH
CH3
+ X Si (CH2)17CH3
OH
X
稳定性好， 制备上样量大
polymeric bonding
R Si (CH2)17CH3 R
O
CH3
Si
O
(CH2)17CH3
色色谱谱柱柱的的参参数数
ODS柱的特征结构
色色谱谱柱柱的的参参数数
强极性化合物使用AQ色谱柱(ODS-100V) 高比表面积和载碳量可以提高制备色谱的上样
量
TTSSKKGGEELL反反相相色色谱谱柱柱选选择择一一览览表表
硅胶填料：
TSK-GEL
固定相
ODS-100V
C18
ODS-100Z
C18
ODS-100S
C18
ODS-120T
C18
气相色谱中常用的术语和参数
1.典型的色谱图在用热导检测器时，往色谱仪中注入带有少量空气的单一样品时，得到图1-3-4的典型气相色谱图。
在图1-3-4中当没有样品进入色谱仪检测器时0t是噪声随时间变化的曲线，一般是一条直线，叫作“基线” 。
h是峰高，其他符号将在后边解释。
2. 区域宽度区域宽度是色谱流出曲线中很重要的参数，它的大小反映色谱柱或所选色谱条件的好坏。
区域宽度有以下三种表示方法：（1）半高峰宽（peak width at half height）（Wh/2）是在峰高一半处的色谱峰的宽度，即图 1-3--2中的CD ，单位可用时间或距离表示。
（2）峰宽（peak width）（W ）是在流出曲线拐点处作切线，在图1-3-2中于基线上相交于E，F 处，此两点间的距离叫峰宽，有些色谱书上叫做“基线宽度” 。
（3）标准偏差（σ ）在图 1-3-2中AB距离的一半叫标准偏差。
在这三种表示方法中以前两者使用较多，三者的关系是：3. 保留值（retention value）保留值是总称，具体参数的名称有以下一些：（1）死时间（dead time）(tM) 一些不被固定相吸收或吸附的气体通过色谱柱的时间，如用热导池作检测器时，从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间，以s或min为单位表示。
（2）死体积（dead volume）（Vm）指色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统管道和检测系统的总体积，等于死时间乘以载气的流速。
（3）死区域（dead zone）（ Vg）指色谱柱中不被固定相占据的空间。
（4）保留时间（retention time）（ tR）从注射样品到色谱峰顶出现时的时间，以s或min为单位表示。
（5）调整保留时间（adjusted retention time）保留时间减去死时间即为调整保留时间（tR-tM）。
（6）保留体积（retention volume）（ Vr）从注射样品到色谱峰顶出现时，通过色谱系统载气的体积，一般可用保留时间乘载气流速求得，以mL为单位表示。
色谱参数及色谱图方面的术语
（一）色谱参数1、死时间：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的时间。
2、保留时间：组分从进样到出峰最大之所需的时间。
2.1调整保留时间：减去死时间保留时间。
2.2校正保留时间：用压力梯度校正因子修正的保留时间。
2.3净保留时间：用压力梯度校正因子修正的调整保留时间。
3、死体积：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的载气体积。
4、保留体积：组分从进样到出先峰最大之所需的载气体积。
4.1调整保留体积：减去死体积的保留体积。
4.2校正保留体积：用压力梯度校正因子修正的保留体积。
4.3净保留体积：用压力梯度校正因子修正的调整保留体积。
5、比保留体积：每克固定液校正到273K时的净保留体积。
6、相对保留值：在相同操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比。
7、分配系数：在平衡状态下，组分在固定液与流动相中的浓度比。
8、容量因子在平衡状态时，组分在固定液与流动相中的质量之比。
9、柱效能：色谱柱在色谱分离过程中主要由动力学因素所决定的分离效能。
通常用理论板数，理论板高或有效板数表示。
9.1理论板数：表示柱效能的物理量。
9.2理论板高：单位理论板的长度。
9.3有效板数：减去死时间后表示柱效能的物理量。
10、分离度：两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与其平均峰宽值之比表示。
11、灵敏度：通过检测器的物理量变化时响应信号的变化率。
12、检测线：随单位体积的载气或在单位时间内进入检测器的组分所产生的信号等于基线噪声二倍时的量。
13、线性范围：检测信号与被测物质的量呈线性关系的范围。
14、载气流速：在色谱柱出口的温度和压力下测得并校正到柱温时的载气体积流速。
（二）色谱图及其他1、色谱图：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或载气流出体积的曲线图。
2、色谱峰：色谱柱流出组分通过检测系统时所产生的响应信号的微分曲线。
3、峰底：从峰的起点与终点之间连接的直线。
4、峰高：从峰最大值到峰底的距离。
如何选择正确的气相毛细管色谱柱型号及规格
气相毛细管柱是气相色谱柱中最常见，使用频率最多的色谱柱，常规的测试应用基本以此为主。
想要实验顺利选择合适的柱子非常重要。
一根合适的柱子才能保证我们能得到想要的色谱分离结果，错误的选择柱子可能会导致色谱峰间的分离度或者理论塔板数无法达到我们的测试要求。
选择合适的柱子第一要素是我们需要了解色谱柱的规格参数。
毛细管柱的规格参数是什么呢？那就是长度、内径和膜厚，以及固定相种类。
当拿到一根柱子，首先会看到一个CD-5，30m*0.25mm*0.25um类似这样的标识。
它表示：这些参数是固定的吗？当然不是，格式是固定的，但是里面的型号是可以改变的。
柱子长度关于毛细管柱，商品化柱子长度可以从5米至100米不等，我们可以根据自己的实验需求选择合适的长度规格，选择依据一般是组分越简单柱长越短，所以100米规格的色谱柱并不多，除一些专用柱除外。
最常见的色谱柱长度规格是30m。
长度会影响色谱柱的分析时间，快速分析时建议选择短柱子（5米、10米、15米）。
在内径和膜厚相同的情况下，一般长柱子可以提高分离度，当然分析时间也会相应增加。
例如60米柱子与30米柱子相比，分离时间可能是其两倍。
另外色谱柱越长也会增加柱流失、影响柱惰性。
内径规格关于毛细管柱，商品化柱子内径规格有0.1毫米、0.15毫米、0.18毫米、0.2毫米、0.25毫米、0.32毫米、0.45毫米、0.53毫米、0.8毫米。
色谱柱内径的大小对分离效果的影响非常明显，内径越小色谱柱的塔板数就越高，柱效越高。
但是载样量会减少。
使用细柱子需要关注载样量，过载就会导致柱效降低。
经过专家和学者以及实验人员长期的实验摸索，累计的经验是：痕量级杂质的分析多选用0.53毫米内径的色谱柱。
0.32毫米色谱柱可以相对兼顾到进样量和柱效。
实验室最常用的规格是0.25mm内径色谱柱。
一般GC/MS中使用的柱子大多是0.25mm内径。
此外，对于快速分析来说，0.1mm和0.2mm最有优势。
色谱峰 标签
色谱峰标签
色谱峰是色谱分析中，流动相携带样品通过固定相时，由于样品组分在两相之间的分配平衡而产生的，在固定相中滞留时间不同的物质以不同的顺序流出，从而得到不同的色谱峰。
每个物质都有其特定的洗脱体积，这可用于物质鉴定和定量分析。
色谱峰的标签包括以下内容：
峰的编号：每个峰都有一个唯一的数字标签，用于标识和区分不同的物质。
保留时间：色谱峰的起始时间和结束时间，以及峰的宽度和高度。
这些参数可用于定性和定量分析。
峰高或峰面积：用于测量物质在色谱图中的相对浓度或绝对浓度。
这些参数可用于定量分析。
峰的对称性：用于评估色谱峰的形状是否对称或正常。
对称的峰表示物质在固定相和流动相之间的分配平衡，而非对称峰可能表示物质与固定相的相互作用异常。
峰的基线：用于评估色谱图中的噪声水平。
基线水平高表示色谱图的噪声低，而基线水平低则表示噪声较高。
这些标签对于理解和分析色谱图非常重要，因为它们可以帮助科学家识别和测量不
同物质在样品中的含量。
通过使用这些标签，科学家可以确定样品的成分和浓度，并将其用于进一步的分析和研究。
总之，色谱峰的标签是理解和分析色谱图的重要工具，它们提供了关于样品成分和浓度的信息，对于科学研究和分析具有重要意义。
3种色谱参数的详细说明
3种色谱参数的详细说明
1、色谱柱柱效参数：
色谱柱的柱效通常是用理论塔板数或有效理论塔板数来衡量，而它们的大小又与区域宽度有直接关系。
区域宽度：这个色谱流出曲线上的一个重要参数，它的大小反映色谱柱与所选色谱条件的好坏，从色谱分离的角度着眼，希望区域宽度越窄越好，通常度量色谱区域宽度有三种方法：标准偏差，峰宽以及半峰宽。
2、色谱的分离参数：
塔板数和塔板高度：色谱分析的前提是待测组分的分离，而无论柱效参数还是选择性参数均反映不出分离效能的高低，为此引入了一个衡量色谱柱综合分离能力的指标-分离度。
分离度又称分辨率，它是以组分的分离情况来制定的，当两组分色谱峰之间的距离足够大，两峰不互相重叠，即保留值有足够的差别，且峰形较窄时，才可以仍为两组分达到了较好的分离，因此色谱图上相邻两峰的保留时间之差与峰宽均值的比值称为分离度，其定义式为：
式中tR1,tR2分别组分1.2的保留时间；W1,W2分别为组分1.2的峰宽，分离度作为两相邻色谱峰分离程度的量度，其值也大，表明两组分的分离情况越好，对于等面积的两色谱峰，当R=1时，两峰有5％的重合，两峰的分开程度为95％，而当R=1.5时，两峰的分离程度达99.7％，可认为两峰完全分离，如图所示，因此R=1.5可作为两峰完全分离的标志。
不同分离度时两峰分离情况
用色谱图上得到的信息，利用定义式可直接计算分离度，但并不能提现出影响分离度的因素，其影响因素将在色谱方程式中做具体阐述。
3、相平衡参数：
在色谱分离过程中，混合物中的两个组分要达到完全分离，其中重要的一点是两组分色谱峰间的距离必须足够大，也就是说两组分保留值的差别要足够大。
以上关于色谱的三种参数介绍，更多内容后期会更新，如果需要可以关注或者查
阅更多资料。
气相色谱技术参数
气相色谱技术参数色谱性能：保留时间重现性: < 0.06%；峰面积重现性: < 2% RSD。
1.1主机1.1.1全电子气路控制 (EPC) 可用于所有进样口和检测器，确保极佳的重现性以及可靠的准确度和精密度1.1.2 压力设定值和控制精度调节：0.01psi1.1.3 独立的加热区，不包括柱箱：六个（两个进样口，两个检测器，两个辅助区）1.1.4 辅助加热区的最高操作温度：400℃1.2 柱温箱1.2.1 操作温度：室温以上8℃至400℃1.2.2 温度设定：1℃，程序升温间隔 0.1℃1.2.3 最大升温速度：70℃/ min1.2.4 程序升温阶数：51.2.5 稳定性：< 0.01℃（在1℃环境温度变化时）。
1.3 毛细柱分流/不分流进样口1.3.1电子压力/流量控制1.3.2 最高使用温度：400℃1.3.2 电子参数设定压力，流速和分流比*1.3.3 压力设定范围：0-60psi；压力设定精度：0.01psi1.3.4 最大分流比：250：11.3.5 流量范围：0-200mL/分钟N2, 0-500mL/min H2或He1.3.6 适用于所有毛细管柱（内径从50 μm到530 μm）1.3.7 *扳转式进样口（提供照片）1.4 氢火焰离子化检测器（FID）1.4.1电子压力/流量控制1.4.2 最高操作温度：425℃1.4.3 自动灭火检测，自动点火，自动调节点火气流1.4.4 最低检测限：<3 pg碳/秒（用十三烷测定）1.4.5 最大数据采集速率：150Hz1.4.6线性范围：>1072. 化学工作站2.1 *软件：EZChrom Elite Compact 中文软件，Win 2000/XP 操作环境，通过软件操作可控制仪器，自动进行数据采集，数据检索，分析结果报告，定量分析；2.4全中文在线帮助软件。
3. 技术服务3.1供应商免费提供操作手册（中/英文可选）壹套。
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死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。
即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。
为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。
V0＝F×t0（F为流速）
梯度方法的建立：
)1(N a 1-a 41Rs --
+=k
k ）（ )15.1/(∆Φ=-m G V F t k Rs ：分离度，表示两峰分离程度的物理量。
k ：容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比，在等度洗脱中。
一种物质的k 值是恒定不变的。
上面两试针对的是梯度洗脱，k 表示的平均容量因子。
a ：分离因子，两个溶质的容量因子的比。
通常k 大的作为分子。
表示两物质分离能力的大小。
N ：理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。
G t ：梯度时间；F ：流速；m V ：死体积；∆Φ：梯度变化围。
常见问题和维护：
整个液相系统最值得关注的常数：压力
除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。
压力来源：泵上的压力传感器
最常见的问题：
压力小（几乎为零）：说明没有流动相流过柱子。
可能原因：
柱前漏夜
流速设为0了
流动相干了
吸滤头没有放流动相液面之下
流路中有大段气泡
处理方法：
漏液：从泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液几乎不会影响压力值）顺次检查。
泵上有自己的漏液传感器。
检测到漏液。
会停止工作并蜂鸣，变红。
同时显示错误信息：ERROR ：LEAK DETECTED 。
发现漏液点，先停泵，重新接好。
将漏液擦干。
有的漏液不明显，这时压力的也不会太小，检查时要注意，可用手仔细摸各个接口，感觉是否湿冷。
流路中有大段气泡：
通过大流速（如5ml/min ）冲洗可以去除泵体气泡。
也就是常说的PURGE 。
按
下泵的面板上的purge键即可。
每次PURGE的时间和流速可以在面板上设定。
通常不改。
初始值应该是5ml/min，3min。
但有时候泵体空气太多，purge都不可以，或者很难抽上流动相，这是可以在purge 的同时，用注射器，在泵的废液出口处抽。
直到没有气泡。
关于偶尔出现的气泡，不用太过在意，因为：
1.有脱气机在。
2.在purge时，由于流速太大，难免会出现气泡。
尤其是在purge阀开超过180
度，废液出口处出现气泡就跟平常了。
3.只要气泡不在泵腔堆积，就几乎不会影响到分析结果。
只要出了泵口，在高
压下会
被压缩的很小。
不影响流路的延续性。
所以，只要观察压力变化，如果压力没有异常波动，就行。
在泵体有气泡堆积时，压力波动会变大。
什么样的波动算正常，需要大家注意观察。
根究经验，在以恒定流速，梯度不变时，面板上以MP为单位的显示值应该几乎不变。
频繁出现的气泡会影响到流路的延续性，应该注意。
吸滤头堵，管路脏（通常是水相）有可能带来频繁出现的气泡。
可以先A，B的溶剂瓶调换一下。
PURGE 三五次。
后换回来，再PURGE两次。
清洗一下管路。
压力过大：说明流路堵了
逐段排查，先从柱（预柱）前接口（因为柱子最易堵）断开，以一定流速走：压力正常，说明是柱子及其后的某一段堵了（通常是柱子）。
换柱子（或预柱）。
压力还高：说明是柱前某段堵了。
这时再将进样器出口（接柱子）的peek管接头拧下：
压力正常：说明是这段peek管堵了。
换peek管。
压力还高：说明是进样器之前的部分堵了。
通常是进样器六通阀堵了。
反冲或清洗流通阀。
其它部分依次类推。
压力波动大：说明流路中的液流不平稳，这时色谱图通常保留时间不稳定，峰型也不好。
得到的线性，重复性也不会好。
可能原因：泵体有气泡，泵头单向阀坏。
先确认是哪一台泵有问题。
先走100%A相。
看是否压力还是波动大，还大则说明A泵有问题。
压力正常则说明A泵正常。
再走100%的B相，过程如上。
确认好泵之后，先purge一下，以驱赶气泡。
Purge两次后，还是压力波动大，这有可能单向阀坏了，需要清洗或更换。
Ctc自动进样器的常用维护操作（实验室现场操作）：
换针：
调针位：
调针位：
设定洗针体积：
一些小概念：
PEEK：聚醚醚酮
色谱管道，外径多为1/16inch，1inch=2.54cm，1/16in=2.54cm，径大小以颜色标准，红色（我们用的）最小，为0.13mm（应该是国际统一标准）
PEEK接头手紧即可
不锈钢接头要用工具紧
接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。
后者在拧紧的过程中，不易带动管道扭曲变形。
不锈钢的压紧环是一次性的
单位换算：
1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psi
Psi：pound per square inch (psi)
Torr：托里彻利，标准大气压的1/760。
也就是mmHg（毫米汞柱）
其它问题：
残留大：
很可能是洗针过程有问题，注意观洗针时有没有抽上液体，抽上来的液体是否有很多气泡。
出现过由于转子磨损，洗针液不能顺畅流出进样口。
造成洗针不充分。
清洗或更换转子。
也可能进样过程有问题，注意观察进样针活塞是否推到底。
可能由于流通阀堵塞，造成压力大，进样针没法推到底。
重现性不好：
标波动大，可能喷雾针脏了，使得喷雾不均匀。
可能是液相方法没有开发好。
峰型差，峰太宽都有可能造成面积不重复（不会差别太大）。
注意观察重现性不好的那几针，是否峰型比较特殊，保留时间也有较大变化，如果是，很有可能是由于pump里进了气泡，造成流速不稳，这点可以从压力变化得到确认，但是好像没法记录压力曲线。
质谱检测器的色谱图：chromatogram ，强度和时间的图。
等同于紫外检测的色谱图。
质谱检测器的光谱图：spectrum ，某一时间点（段时间平均）的强度相对质荷比的图
下图上半为一色谱图，下半部为图是灰色方块（2.5min 左右），平均强度相对质荷比的光谱图。
类似于紫外中的全波长图。
分辨率：unit 分辨率定义为半峰宽为0.7。
其意义如下：
2/1W =2
2ln W W=1.702/1W
2/1W =0.7则W=0.7*1.70=1.19
差不多刚好实现单位质荷比的分离
线性围：
信号强度与样品浓度的关系可用如下关系式表示：R=ARCX。
R为信号强度大小，AR为响应因子。
C为样品浓度，X为指数。
X=1，表示在线性围之，考虑到实验误差等因素。
一般只要X在0.98-1.92之间，就认为还在线性围之。
线性围是一个浓度围，下限比较难测。
通常就以最小检测量或最小检测浓度作为线性围的下限。
检测器的线性围。