凝胶色谱基础知识
凝胶色谱(中国药典)
0514分子排阻色谱法中国药典2015年版件均应使用惰性材料，如聚醚醚酮（P E E K)等。
也可使用一般的高效液相色谱仪，只要其部件能与洗脱液和供试品溶液相适应。
仪器应定期检定并符合有关规定。
(11色谱柱离子交换色谱的色谱柱填充剂有两种，分别是有机聚合物载体填充剂和无机载体填充剂。
有机聚合物载体填充剂最为常用，填充剂的载体一般为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有机聚合物。
这类载体的表面通过化学反应键合了大量阴离子交换功能基（如烷基季铵、烷醇季铵等）或阳离子交换功能基（如磺酸、羧酸、羧酸-膦酸和竣酸-膦酸冠醚等），可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。
有机聚合物载体填充剂在较宽的酸碱范围(p H0〜14)内具有较髙的稳定性，且有一定的有机溶剂耐受性。
无机载体填充剂一般以硅胶为载体。
在硅胶表面化学键合季铵基等阴离子交换功能基或磺酸基、羧酸基等阳离子交换功能基，可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。
硅胶载体填充剂机械稳定性好、在有机溶剂中不会溶胀或收缩。
硅胶载体填充剂在p H2〜8的洗脱液中稳定，一般适用于阳离子样品的分离。
(2)洗脱液离子色谱对复杂样品的分离主要依赖于色谱柱中的填充剂，而洗脱液相对较为简单。
分离阴离子常采用稀碱溶液、碳酸盐缓冲液等作为洗脱液；分离阳离子常采用稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。
通过调节洗脱液p H值或离子强度可提高或降低洗脱液的洗脱能力；在洗脱液内加入适当比例的有机改性剂，如甲醇、乙腈等可改善色谱峰峰形。
制备洗脱液的水应经过纯化处理，电阻率大于18M n*c m。
使用的洗脱液需经脱气处理，常采用氦气等惰性气体在线脱气的方法，也可采用超声、减压过滤或冷冻的方式进行离线脱气。
(3)检测器电导检测器是离子色谱常用的检测器，其他检测器有安培检测器、紫外检测器、蒸发光散射检测器等。
电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和部分极性有机物，如竣酸等。
凝胶渗透色谱(GPC)
凝胶渗透色谱（GPC）1. 简介凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）是一种常用的分离和分析高分子化合物的方法。
该技术基于样品中高分子与凝胶基质之间的相互作用特性进行分离，并通过检测其分子量进行定性和定量分析。
2. 原理GPC的原理基于高分子在溶剂中形成的动态螺旋结构。
在这个多孔的凝胶基质中，高分子可以通过不同的速度渗透进入孔隙中，较大分子量的高分子会更难进入孔隙，而较小分子量的高分子则相对容易进入。
因此，在GPC中，高分子化合物会根据其分子量的大小在凝胶柱中得到分离，从而实现对样品的分析。
3. 实验操作3.1 样品制备：将待分析的高分子化合物溶解在合适的溶剂中，得到样品溶液。
确保样品溶液中没有明显的悬浮物或杂质。
3.2 柱装填：将凝胶柱装入色谱柱座，并根据柱座的要求进行调整和固定。
3.3 校准：使用一系列已知分子量的标准品进行校准。
将标准品溶液以一定流速注入凝胶柱中，记录各标准品的保留时间。
3.4 样品进样：使用自动进样器或手动进样器将样品溶液以适当流速注入凝胶柱中。
3.5 分离：样品在凝胶柱中进行凝胶渗透分离，不同分子量的高分子以不同的速度通过凝胶基质，完成分离。
3.6 检测：通过不同的检测器检测凝胶柱中流出的样品，常用的检测器包括紫外-可见光谱检测器、折光率检测器等。
3.7 数据处理：根据标准品的保留时间和已知分子量，结合样品的保留时间，计算出样品的分子量。
4. 应用领域GPC广泛应用于高分子化合物的分析和研究领域。
主要应用包括但不限于以下几个方面：•分析聚合物的分子量分布：通过GPC可以获得聚合物样品的分子量分布情况，了解样品中分子量大小的范围和占比，有助于进一步研究和应用。
•聚合物纯度分析：GPC可以用于判断聚合物样品的纯度，通过检测样品中的低分子量杂质，评估样品的纯净度。
•聚合物杂质分析：GPC可以用于分析聚合物样品中的杂质物质，如副产物、残留单体等。
gpc凝胶色谱法
GPC凝胶色谱法（Gel Permeation Chromatography）是一种常用的高效分离和纯化大分子化合物的方法。
它利用多孔凝胶填充柱，通过溶剂的流动来实现样品分离。
本文将详细介绍GPC凝胶色谱法的原理、操作步骤和应用领域。
一、原理GPC凝胶色谱法基于溶液中溶剂分子能够穿过凝胶柱，而样品分子由于体积较大而无法穿过凝胶柱的特点。
在柱中填充的多孔凝胶具有不同的孔径大小，通过调整填充凝胶的孔径大小可以实现对不同分子大小的分离。
当样品溶液通过凝胶柱时，大分子会被凝胶阻挡，停留在柱上，而小分子则能够穿过凝胶柱，以较快的速度流出。
二、操作步骤1. 样品准备：将待测样品溶解在适当溶剂中，并去除悬浮物或杂质。
确保样品溶液的浓度适中，不要过于稀释或浓缩。
2. 准备柱：选择合适的凝胶柱，并根据样品大小选择合适的填充凝胶。
将凝胶柱放入色谱系统中，并用适当的溶剂预洗柱体，以去除空隙中的杂质。
3. 样品进样：使用自动进样器或手动进样器将样品溶液注入色谱系统中，确保样品进入凝胶柱。
4. 溶剂流动：打开溶剂泵，使溶剂以一定的流速通过凝胶柱，保持稳定的流速和压力。
5. 检测器测量：在溶剂流动的同时，使用合适的检测器（如紫外检测器）对流出的溶液进行连续监测。
记录下各组分的峰面积或峰高度，以及相对保留时间。
6. 数据处理：根据样品的分子量和峰面积或峰高度，绘制标准曲线，从而得到待测样品的分子量分布。
三、应用领域1. 聚合物研究：GPC凝胶色谱法是聚合物分子量分布分析的重要手段。
通过测定不同聚合物样品的分子量分布，可以评估聚合反应的效果、控制聚合物的质量以及研究聚合物的性质和结构。
2. 生物医药领域：GPC凝胶色谱法在生物医药领域中被广泛应用于蛋白质、多肽和核酸等生物大分子的分离和纯化。
它可以帮助研究人员获取纯度高、分子量分布窄的样品，为后续的生物学研究和制剂开发提供可靠的基础数据。
3. 环境监测：GPC凝胶色谱法也常用于环境监测中，例如对水体中有机物的分析和大气颗粒物的检测。
凝胶色谱法
凝胶色谱法凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需凝胶色谱系统要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱凝胶色谱仪溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
第2节 凝胶色谱(GPC)
3.2.4 热力学理论
该理论认为，决定GPC分离的因素，不仅有胶体的孔径大 小，而且包括在一定溶剂中高聚物分子构像的尺寸分布。 Casassa研究了溶液中不同构像的分子链在同一胶体孔洞 大小上的分离他假设孔洞内外的溶质分子处于平衡，而且 两相是那样的稀,以致高聚物之间无作用。他用无规飞行 统计来描述分子的构像，即符合方程式： 2 式中，Pn（r）表示距坐标原点为矢量r的位置上，无规飞 行出现n次的几率密度；b2表示聚合物链段的平均平方长 度。上式在分散（dissipative）物理过程中是基本的，适 用于各种边界条件。
[ ]1[ M ]1 [ ]2[ M ]2
把Mark－Houwink方程：代入上式再经过 一些公式的化简可得：
lg M 2 1 1 1 lg( K 1 / K 2) lg M 2 1 2 1 2
因此只要知道两种聚合物样品在实验条件 下的参数K1，α1和K2，α2的值，就可由一种 高聚物的校正曲线以上式换算成第二高聚 物的校正曲线。 此方法的优点是主要一种高聚物（一般采 用窄分布聚苯乙烯）作校正曲线就可以测 定其他类型的聚合物，但先决条件式两种 聚合物的K和α必须是已知的，否则无法进 行定量计算。
对于线性校正曲线可用下列方程表示： lg M A BVe 式中，Ve为淋洗体积（也可用保留时间）； M代表分子量；A和B为常数，B>0。 如果校正曲线是非线性的，则可用曲线方 程或多段折线方程表示。 这种测定校正曲线的方法简便，准确性高， 但获得于被测样品相同类型的窄分布高分 子样品比较困难，限制了它在实际中的应 用。
KC 1 2 A2C R MW
4 2 2 dn 2 K n ( ) N4 dc
凝胶色谱原理是什么
凝胶色谱原理是什么
凝胶色谱是一种常用的分离技术，常用于生物大分子如蛋白质、核酸和多糖的分离纯化。
它利用不同生物大分子在凝胶柱中的迁移速度差异来实现分离。
凝胶是一种具有三维网状结构的物质，常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺（polyacrylamide）和琼脂糖（agarose）等。
凝胶柱是
由这些凝胶材料构成的柱状结构。
凝胶色谱的原理是利用凝胶柱中的孔道（空隙）来阻碍和分隔样品中的不同分子。
其中，孔径越小的孔道会更容易阻碍大分子的迁移，使大分子留在凝胶柱上；而孔径较大的孔道则更容易允许小分子迁移通过。
在凝胶色谱中，样品溶液被添加到凝胶柱的顶端，然后通过柱内流动。
不同大小的分子因为在凝胶孔道中的阻碍效应不同，会以不同的速度迁移通过凝胶柱。
这样，分子的大小决定了它们经过柱后的出现时间。
凝胶色谱的分离效果取决于凝胶材料的孔径大小和样品分子的大小。
通常，选择合适的凝胶材料和适当的操作条件，可以实现对多种不同大小的分子进行有效的分离。
总的来说，凝胶色谱利用凝胶柱中的孔径选择性地阻碍和分离样品中的不同分子，从而实现分离纯化的目的。
凝胶色谱操作步骤
凝胶色谱操作步骤
凝胶色谱是一种常见的生物化学分离技术，用于分离和纯化生物大分子，如蛋白质、核酸等。
以下是凝胶色谱的一般操作步骤：
样品制备：将待分离的生物大分子样品溶解在适当的缓冲液中，通常要加入一些生物样品的裂解缓冲液以打破细胞结构。
样品加载：将样品加载到凝胶中，通常是通过在凝胶柱或凝胶板上形成样品孔道或者直接混合凝胶。
运行凝胶色谱：加入适当的运行缓冲液，施加电场或者离心力，让样品在凝胶中进行分离，根据分子大小、电荷、亲疏水性等特性进行分离。
收集分离物：根据需要，可以收集不同部位的凝胶，收集后的物质可以进行后续的分析或者纯化。
分析和评估：对分离得到的物质进行分析和评估，可以通过染色、质谱等方法进行鉴定和定量分析。
需要根据具体的实验要求和分离物质的特性来选择合适的凝胶材料、缓冲液和分离条件。
在操作凝胶色谱时，要注意严格控制操作条件，以确保分离的准确性和重复性。
GPC系统介绍和谱图解析
0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 Minutes
山东圣泉化工股份有限公司 2007年10月
1.凝胶色谱概述
• 凝胶色谱法（GPC）又称之为体积排阻色谱法 （SEC）。它是液相色谱中的一种，但与其他液 相色谱的分离机理不同，是基于试样分子的尺寸 和形状不同来实现分离的。
• 凝胶色谱技术是上世纪末发展起来的一种快速而 又简单的分离分析技术，由于其对高分子 物质有 很高的分离效果。目前已经在高分子化学、分子 生物学、医学等有关领域的科学实验研究和工业 生产得到广泛采用。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外还可以进入凝胶颗粒的微孔中即进入凝胶相内在向前移动的过程中从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒如此不断地进入和扩散小分子物质的前进速度落后于大分子物质从而使样品中分子大的先流出色谱柱中等分子的后流出分子最小的最后流出得到了最终的凝胶色谱图
凝胶色谱系统介绍和谱图解析
部分添加剂的定量，这大 大提高了凝胶色谱在酚醛 树脂分析中的定性定量能 力。
0.40
• 相同物质在不同波长下色
0.ห้องสมุดไป่ตู้0
谱图明显不同
0.20
• 左图为PF-1350分子量和
0.10
水杨酸在不同波长下的检
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes
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分子质量。
10
为什么要用GPC方法
❖ 相对分子量分布(多分散性指数)对聚合物的性 质有重要影响。
❖ 在相对分子质量分布（多分散性指数）成为 人们关注的热点后，经典方法却不能同时测 定聚合物的相对分子质量分布。凝胶渗透色 谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了 可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分 布的方法，使其成为测定高分子相对分子质 量及其分布最常用、快速和有效的技术。
❖ 渗透极限
能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。
在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固
定相的渗透极限和排阻极限之间。
6
平均分子量计算公式
数均分子量
Mn =
S Hi S (Hi / Mi)
重均分子量 Mw = Z均分子量 Mz =
S Mi Hi S Hi ΣMi 2Hi S Mi Hi
4x105(GPC-804), 4x106(GPC-805), 4x107(GPC-
806)，4x107 (mixed gel，GPC-80M),
16
8
GPC色谱柱类型
11
GPC系统配置
进样器 泵
色谱柱 柱温箱
检测器
THF, 氯仿, DMF
示差检测器
需要GPC软件才可计算MW
12
配置实例
No.
产品编号
产品名称
型号
数量
1
228-45011-38
系统控制器
CBM-20Alite
1
2
228-45000-38
输液单元
LC-20AD
1
3
228-45018-32
在线脱气机
DGU-20A3
1
4
228-45041-91
容器盘
-
1
5
228-45006-38
自动进样器
SIL-20A
1
6
228-46606-96 自动进样器用GPC对应组件
-
1
7
228-45009-38
柱温箱
CTO-20A
1
8
228-45095-38
示差折光检测器
RID-10A
1
9
228-20810-91
色谱柱
❖ 直接方法
渗透压方法 (for Mn) 光散射方法 (for Mw) 粘度方法 (for Mv) 超速离心方法 (for Mz)
❖ 间接方法
GPC (for Mn, Mw and Mz)
用标准品进样得到分子量校正曲线，间接算出聚
合物样品的相对分子量。如和标准品结构不同，
还需进行相应的计算才能得到聚合物样品自身的
15
GPC色谱柱系列
❖ Shim-pack GPC-80X for THF ❖ Shim-pack GPC-80XC for 氯仿 ❖ Shim-pack GPC-80XD for DMF
❖ 排阻极限 (聚苯乙烯)
1.5x103(GPC-801), 5x103(GPC-802),
2x104(GPC-8025), 7x104(GPC-803),
常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物
❖ 凝胶过滤色谱 (GFC)
主要用于生命科学领域
以水溶液为流动相
常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖，琼脂
糖，聚丙烯酰胺等)
2
GPC用途
❖ 高聚物的分子量及其分布是高聚物最基本的 参数之一。高聚物的许多性质是与分子量有 关的。例如冲击强度、模量、拉伸强度、耐 热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量和分子量 分布有关。
Z+1均分子量 Mz+1 =
ΣMi 3Hi S Mi 2Hi
Hi： 峰高 Mi：分子量
7
平均分子量含义
❖ 数均分子量 (Mn)
拉力、抗冲击性
❖ 重均分子量 (Mw)
脆度
❖ Z 均分子量 (Mz)
弹性、硬度
分布宽度指数D(分散度)= Mw/Mn
对于多分散试样 Mn ＜ Mw ＜ Mz
8
高聚物多分散性表征
常规HPLC有多种检测器可选
❖ 梯度
GPC系统是等度系统，并且用并联泵
常规HPLC可以是等度或者梯度
❖ 管路
GPC系统采用全不锈钢流路
常规HPLC用PEEK或者不锈钢流路
❖ 自动进样器针密封
GPC系统采用Vespel针密封，适用THF、氯仿、DMF等
常规HPLC用PEEK针密封
14
LCsolution GPC软件
3
❖ 固定相是多孔填G料P，C小分分子离样品原可理以进入孔径内部
❖ 样品与固定相之间无作用力 ❖ 迁移时间不同
样品
填充物颗粒
大
中
孔穴
小
4
MW与RT之间的关系
排阻极限 渗透极限
GPC柱
5
GPC术语
❖ 排阻极限
排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子 量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直 接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻 极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶 的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。随固定相不同， 排阻极限范围约在 400至60×106之间。
SEC定义
❖ SEC全称Size Exclusion Chromatography(体 积排阻色谱，或者尺寸排阻色谱）
❖ SEC定义：是利用多孔凝胶固定相的独特特 性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的 差异来分离的液相色谱方法。
1
SEC分类
❖ 凝胶渗透色谱 (GPC)
主要用于聚合物领域
以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF)
❖ 样品间分子量分布宽度的比较，最直接的方 法是将实验所得到的分子量分布曲线作对比。
❖ 分子量分布曲线有两种形式：
用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分布 曲线；
用累积重量分布对分子量作图的曲线叫做积分分 布曲线。
❖ 还有一种更一般化且最常用的方法就是重均
数均比，即：Mw/Mn。
9
测定聚合物分子量的方法
GPC-80M
1
10 228-20812-91 11 223-05671-92
保护柱 LC工作站
GPC-800P
1
LCsolution Single 1
12 223-05655-92
GPC软件
LCsolution GPC
1
13
GPC系统与常规HPLC系统区别
❖ 检测器
GPC系统标配示差折光检测器