动物肝星状细胞标记蛋白DESMIN表达免疫组化检测试剂盒产
一种改良的肝星状细胞分离方法
一种改良的肝星状细胞分离方法陈超;陈宁;覃霞;朱樑【摘要】目的改良肝星状细胞(HSC)的分离方法,为深入研究肝纤维化的发生机制奠定基础.方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位消化肝脏,在1.040~1.060 g/mL 范围内多重多次密度梯度离心分离HSC,台盼蓝染色测定细胞存活率,328 nm紫外光激发HSC自发蓝绿色荧光法和Desmin细胞免疫荧光法鉴定HSC及检测HSC 纯度.Desmin和α-SMA细胞免疫荧光方法鉴定HSC静息和活化状态.结果每只大鼠肝脏HSC得率为(3~5)×107个,HSC存活率在95%以上,纯度在90%以上,体外培养14 d后活化的HSC纯度几乎达100%.结论在1.040~1.060 g/mL密度范围内采用多重多次密度梯度离心方法,避免了HSC分离过程中因密度配比误差及HSC自身密度相对不均一性所导致的细胞流失,建立了一种改良的肝星状细胞分离方法,HSC得率和纯度更加稳定,达到国外文献报道水平.%Objective To improve the method of isolating rat hepatic stellate cells (HSCs). Methods Rat hepatic stellate cells were isolated for several times with multiple density centrifugation within 1. 040 ～ 1. 060 g/mL after enzyme perfusion of liver. The cell viability was determined by Trypan blue exclution staining. The purity of HSCs was identified by retinoid antofluorescence and immunostaining by Desmin. The phenotype of HSCs was evaluated by characteristic immunofluorescence using antibodies specific for Desmin and α-SMA. Results About (3 ～5 ) × 107 HSCs were harve sted from each rat through multiple density centrifugation within 1. 040 ～ 1.060 g/mL. The cell viability was more than 95％ determined by the trypan blue exclusion method. The purity of freshly isolated HSCs and the activatedHSCs were more than 90％ and almost 100％ respectively assessed by retinoid antofluorescence and immunostaining cells using Desmin antibody. Conclusion The method of multiple density centrifugation greatly increased the production of HSCs by reducing loss of cells due to error of density preparation and their relative heterogeneity of density during isolating HSCs. This method is more convenient, efficient and reliable.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2011(020)006【总页数】4页(P564-567)【关键词】肝星状细胞;细胞分离;肝纤维化【作者】陈超;陈宁;覃霞;朱樑【作者单位】第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003;第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003;第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003;第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003【正文语种】中文【中图分类】R575肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生发展的中心环节［1］。
免疫组化分型诊断抗体选用表
免疫组化分型诊断抗体选用表（2016年3.15版）注：红字提示目前未购买到，或者抗体预试验未完成，或观点尚未证实。
一、间叶肿瘤：Vimentin+ Cytokeratin- LCA-1、肌源性肉瘤：Actin (广谱肌动蛋白HHF35)，Actin（平滑肌肌动蛋白SMA）+，Desmin（结蛋白）+，横纹肌肉瘤P63/MyoD1/Myogenin+，平滑肌瘤或肉瘤高分子量钙结合蛋白（H-caldesmon）浆+，平滑肌瘤或乳腺肌上皮Calponin肌动蛋白结合蛋白+。
2、组织细胞肿瘤（注：恶纤组CD68阴性、CD10阳性）：CD68（PG-M1单核细胞）+，CD68（KP-1组织细胞/巨噬细胞）+，CD163+。
脂肪肉瘤：S-100和Ki-67脂母细胞核浆+。
骨巨细胞瘤（软组织巨细胞瘤）：单核细胞P63+CD68-，多核细胞P63-Ki67-CD68+3、滑膜肉瘤：Cytokeratin+，Vim+，CK19+，CK7+，CK17+，EMA+，SYT基因+。
胃肠间质瘤：CD34+、CD117+、DOG-1+。
4、神经源性：PNET：CD99/CgA/Syn/S-100/Nue-N+, PNET/髓母: INI-1+(恶性横纹肌样瘤-)。
恶性神经鞘瘤：S-100/CD57/PGP9.5/Leu-7+。
室管膜瘤EMA+（中枢神经用EMA点状胞浆阳性）、CK+，GFAP+，S-100+。
脉络膜瘤GFAP-，S-100+。
星型胶质瘤：GFAP+，少突细胞瘤：Olig2，黄色瘤样星型细胞瘤CD34阳CR阴（节细胞胶质瘤CD34阴CR阳）神经元细胞、：NeuN+，Nestin+，NF+，Syn+。
嗅母NeuN-，Syn+，CgA+，NSE+，S-100癌巢周围支持细胞+、脑膜瘤Vim+, EMA+, PR+，CK+, S-100+。
副神经节瘤：Syn+, CgA+, S-100支持细胞+。
血管母细胞瘤：间质细胞аinhibin/VEGF/NSE/Vim/S-100/D2-40+，GFAP/CK/CD10/EMA-；CD34及CD31血管内皮阳性。
肝星状细胞详解
肝星状细胞肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。
HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。
在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。
中文名肝星状细胞外文名hepatic stellate cell，HSC 科室肝胆外科简介肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC 作为最终靶细胞。
肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。
当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。
激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。
背景早在1876年，德国CarlvonKupffer在使用氯化金染色法研究肝脏的神经系统时无意中发现肝血窦周围有呈星状形态的细胞，将其命名为星状细胞（sternzellen）。
1898年，Kupffer用印度墨水对兔肝进行染色时，观察到能吞噬墨水颗粒的肝巨噬细胞，也就是后来人们为纪念Kupffer而命名的Kupffer细胞。
因为同样为星状形态，Kupffer 误把肝巨噬细胞和星状细胞混为一谈，认为星状细胞就是肝巨噬细胞。
这种观点在当时得到了广泛的认同。
直到1951年，日本学者ToshioIto通过光学显微镜发现人的肝窦周围有一种富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞，并将之命名为伊东细胞（ItoCel1s）或贮脂细胞（fat-storingcells）。
1958年，Suzuki用银染色法在Disse腔内观察到这种星芒状的细胞，发现其突起与肝脏内的自主神经末梢相连系，他认为这种细胞能将来自肝内自主神经的冲动传递给肝实质细胞，并将其称为“间质细胞”；1966年，Bronfenmajor证实了伊东细胞的发现，又给该细胞起新名叫脂细胞（1ipocytes）；1971年，KenjiroWake采用电镜，结合氯化金染色法和苏丹红染色法发现Ito所描述的伊东细胞和Kupffer所发现的星状细胞原来是同一类型的细胞，并指出上述细胞既不同于肝窦内皮细胞，也不是肝内的巨噬细胞。
教你如何看懂花了好几千的免疫组化报告单
教你如何看懂花了好几千的免疫组化报告单免疫组化是用标记的特异性抗原（抗体）对组织内抗体（抗原）的分布进行检测。
免疫组化虽然价钱昂贵，却有不能替代的作用：①恶性肿瘤的诊断和鉴别②确定转移性恶性肿瘤的原发部位③对某类肿瘤进行病理分型④明确软组织肿瘤的正确组织学分类，明确软组织的诊断⑤发现微小转移灶⑥为临床治疗方案提供支持虽然免疫组化有那么多作用，但是很多患友拿到手了根本就看不懂，都是些英文缩写，代表着什么意思呀，别着急，下面小编就按照字母顺序列张表，告诉大家各个代表什么意思：项目临床意义Actin 肌动蛋白，间叶组织来源标记，平滑肌、血管内皮、肌上皮组织表达。
AE1/AE3 细胞角蛋白AE1/AE3 ，标记上皮及上皮来源的肿瘤，鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性，如胆管细胞阳性，肝细胞阴性，鉴别肝癌和胆管癌。
AFP 甲胎蛋白，肝癌细胞表达，胃和肝脏同时肿瘤时，胃肝样腺癌HepPar-1、AFP、CK19 和CDX-2 等4 种不同程度阳性表达，而肝细胞癌CK19 和CDX-2 不表达。
ALK 间变型淋巴瘤激酶，用于淋巴造血来源标记，间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B 细胞淋巴瘤和炎症性肌纤维母细胞瘤的诊断。
AMACR 甲基酰基辅酶A消旋酶，癌特异性指标，只存在于癌症组织。
结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤等过度表达，以结直肠癌和前列腺癌表达最高。
Bax 促进凋亡蛋白，同Fas/FasL。
Bcl-2 抑制细胞凋亡相关基因-2，肿瘤预后指标，高表达者对多数抗癌药物、放射治疗耐受，高表达者预后差。
Bcl-6B 淋巴细胞凋亡相关基因-6，抑制细胞凋亡作用，淋巴造血细胞来源标记，用于B 淋巴瘤诊断。
Bel-XL 抑制细胞凋亡相关基因-XL ，Bcl-2 抑制细胞凋亡基因家族成员之一，作用同Bcl-2 。
Cam5.2 人角蛋白抗原决定簇，正常分泌上皮表达，复层鳞状上皮不表达，用于鉴别腺癌和鳞癌。
病理科开展免疫组化抗体作用使用范围-范本模板
病理科开展免疫组化抗体目录
病理科开展免疫组化抗体作用/使用范围
黑色素瘤细胞、皮内痣细胞及非黑色素细胞不反应。
常用于黑色素瘤及伴有黑色素细
胞分化倾向的肿瘤的诊断。
noma
15.Insulin 胰岛素胰岛素是胰岛ß细胞分泌的一种激素，可以减低血糖浓度。
此抗体和人胰岛
素反应，并与大多数哺乳类动物的一套苏有交叉反应，主要用于胰岛细胞瘤
的功能性分类研究。
16.Inhibin 抑制素ɑ抑制素是由ß亚单位所组成的异二聚体糖蛋白类激素，属于转化生长因子
ß（TGF-ß）超家族成员，可以抑制垂体促性腺激素的合成和分泌.此抗体主要
用于性索间质肿瘤的诊断与鉴别诊断。
Inhibi n-ɑ
17.Hepa—1 肝细胞此抗体识别的抗原存在于正常人肝细胞和大多数的肝细胞癌中，与其他肿瘤
包括消化道肿瘤细胞没有交叉反应。
绝大多数的肝细胞癌为阳性表达，主要
用于肝肿瘤的研究。
Hepa tocyt e
18.TdT 末端脱
氧核苷TdT是一种DNA聚合酶,表达于大多数的皮质胸腺细胞,未成熟的淋巴细胞来源的肿瘤其TdT活性增高，同样情况可见见于淋巴母细胞型白血病、急性T/B。
《软组织肿瘤病理诊断免疫组化指标选择专家共识》要点
《软组织肿瘤病理诊断免疫组化指标选择专家共识》要点软组织肿瘤是外科病理学中一类病种最多，也最为复杂的肿瘤。
WHO(2013）软组织肿瘤病理新分类包括12大类。
各类肿瘤又包含很多种疾病类型，并根据生物学行为的不同，分为良性、中间性和恶性。
与其他类型的肿瘤相似，软组织肿瘤的病理诊断也需与临床、病理相结合。
除部分肿瘤可根据临床特点和镜下形态直接做出诊断外，大多数软组织肿瘤需加做免疫组化标记。
1 免疫组化在软组织肿瘤病理诊断中的应用及注意事项免疫组化不仅在软组织肿瘤的诊断和鉴别诊断中起非常重要的作用，而且在指导靶向治疗或预测肿瘤的生物学行为等方面也有广阔的应用前景。
但要强调的是，免疫组化只是一种辅助性手段，有其自身的局限性，并不能代替传统的组织学检查，后者才是病理学诊断的基础。
免疫组化检测必须以病理组织学形态为基础，选择免疫组化检测指标时应注意以下几个问题：⑴熟悉常用抗体的反应谱和适用条件，首选敏感和特异性较高的抗体类型，特别是公认的抗体型号，并合理配伍，力争采用尽可能少的抗体取得最好的检测结果。
⑵免疫组化检测过程需注重质量控制，尽可能做到标准化，使染色切片背景清晰，标记定位准确。
⑶推荐设置阳性对照，尤其是一些与靶向治疗密切相关的标志物，如CD117等，以确保免疫组化标记结果的可信性。
⑷对标记结果要注意辩证分析，因有相当一部分抗体在一些不同类型的肿瘤之间存在交叉反应或有异常表达，如S-100蛋白在滑膜肉瘤中的阳性率也可高达38％，因此不能仅根据S-100蛋白标记阳性简单地将梭形细胞肉瘤诊断为恶性周围神经鞘膜瘤。
CD31不仅表达于血管肉瘤，也可表达于组织细胞肿瘤。
另外，HMB45是恶性黑色素瘤、软组织透明细胞肉瘤和血管周上皮样细胞分化的肿瘤（PE-Coma）的标志物，但最近有文献报道部分子宫平滑肌肉瘤和子宫内膜间质肉瘤也可表达HMB-45。
⑸软组织肿瘤中存在一些异常表达的情况，如标记上皮细胞的角蛋白，也可在假肉瘤样肌纤维母细胞性增生、胚胎性或腺泡状横纹肌肉瘤和骨外尤因肉瘤等一些不具有上皮样分化的软组织肿瘤中表达。
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
步骤一、实验材料准备1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
免疫组化常用标记物
免疫组化常用标记物免疫组化常用标记物一、常用标志物1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。
是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。
免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。
2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。
癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。
存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。
CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。
3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。
嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～1 20 kDa，分布广泛。
含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。
几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。
嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。
此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。
对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。
4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。
此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。
用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。
5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。
在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
动物肝星状细胞标记蛋白DESMIN表达免疫组化检测试剂盒产品说明书
（中文版）
主要用途
动物肝星状细胞标记蛋白DESMIN表达免疫组化检测试剂是一种旨在使用免疫抗体显色技术，即通过抗DESMIN多克隆抗体以及辣根过氧化物酶缀合物二抗，使用染料二氨基联苯胺染色显示棕褐色，分析肝星状细胞DESMIN蛋白表达和分布状况的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
主要适用于各种人体、大鼠、小鼠等肝星状细胞标记蛋白DESMIN蛋白检测。
广泛用于肝星状细胞鉴定、肝脏发育、肝纤维化病变的研究。
产品严格无菌，即到即用，显色清晰，操作简捷，性能稳定。
技术背景
肝星状细胞（Hepatic stellate cells；HSC），也称为Ito细胞、窦周细胞（perisinusoidal cell）、维生素A储存细胞、脂肪细胞、或脂肪储存细胞。
其位于实质细胞（parenchymal cell）和内皮细胞（endotherial lining）之间，具有维甲类化合物代谢、储存和体内平衡、胞外基质重建、生长因子和细胞因子的制造、窦腔收缩和舒张、肝组织发育和再生的功能，与肝纤维化的发生、门静脉高压（portal hypertension）和肿瘤转移有关。
结蛋白（desmin）属于第三类中间丝蛋白（intermediate filaments），在1984年由Yokoi等发现在肝星状细胞表达，成为其标记蛋白之一，也是识别肝星状细胞的金标准。
进一步研究发现：1）结蛋白在正常大鼠门静脉周围（periportal）细胞呈阳性，而在中央静脉（pericentral）周围50%呈阴性；2）小鼠肝脏发育过程中，结蛋白阳性的肝星状细胞在肝实质（parenchyma）散在分布；3）结蛋白阳性的肝星状细胞分布在狄氏窦周间隙（perisinusoidal space of Disse）的沿边分区（littoral compartment）；4）大鼠静止型（quiescent）肝星状细胞结蛋白阳性，而人体静止型为阴性；5）分离培养的肝星状细胞结蛋白呈阳性；6）肝星状细胞转分化（transdifferentiation）成肌成纤维细胞（myofibroblast）过程中，结蛋白阳性；7）α-SMA和GFAP 也是肝星状细胞的标记蛋白。
通过抗结蛋白多克隆抗体以及辣根过氧化物酶缀合物二抗（Peroxidase conjugated antibody）反应，进而使用染料二氨基联苯胺染色显示结蛋白阳性肝星状细胞为棕褐色。
产品内容
清理液（Reagent A）120毫升
固着液（Reagent B）10毫升
封阻液（Reagent C）4毫升
一抗液（Reagent D）1毫升
二抗液（Reagent E）1毫升
显色液A（Reagent F）500微升
显色液B（Reagent G）5毫升
产品说明书1份
保存方式
保存固着液（Reagent B）、一抗液（Reagent D）、二抗液（Reagent E）和显色液A（Reagent F）在－20℃冰箱里，严格避免反复冻融，其余的保存在4℃冰箱里；二抗液（Reagent E）和显色液A（Reagent F），
避免光照；有效保证3月
用户自备
盖玻片：用于抗体孵育操作
培养箱：用于反应孵育
光学显微镜：用于细胞染色后观察分析
特别注意
1．显色液A（Reagent F）和显色液B（Reagent G）必须在实验操作前即刻混匀；混匀后切忌久放不用或储存后备用；用完扔掉
2．显色液A（Reagent F）如果出现沉淀，须过滤后再用
实验步骤
一、样本固着处理
1．小心加上200微升清理液（Reagent A）在细胞载玻片上，铺满整个细胞载玻片样品表面
2．室温下孵育1分钟
3．小心移去细胞载玻片上的清理液（Reagent A）
4．小心加上500微升—20℃预冷的固着液（Reagent B），铺满整个细胞载玻片样品表面
5．放进—20℃冰箱室温下孵育20分钟
6．小心移去细胞载玻片上的固着液（Reagent B）
7．室温下，将细胞载玻片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育5分钟
8．小心移去细胞载玻片上的清理液（Reagent A）
9．小心加上200微升封阻液（Reagent C），铺满整个细胞载玻片样品表面
10．室温下孵育10分钟
11．小心移去细胞载玻片上的封阻液（Reagent C）
12．室温下，将细胞载玻片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育5分钟
13．小心移去细胞载玻片上的清理液（Reagent A）
二、免疫标记处理
1．小心加上100微升含有一抗液（Reagent D），铺满整个细胞载玻片样品表面
2．在37℃湿润的培养箱里，孵育1小时，保持湿润，避免干燥（注意：可以使用盖玻片盖上孵育）3．小心移去细胞载玻片上的一抗液（Reagent D）
4．室温下，小心将细胞载玻片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
5．小心移去细胞载玻片上的清理液（Reagent A）
三、样本染色处理
在染色前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的显色液A（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移取200微升显色液A（Reagent F）和1.8毫升显色液B（Reagent G）到2毫升离心管，充分混匀，标记为显色工作液，
置于暗室。
然后进行下列操作：
1．小心加上100微升二抗液（Reagent E）在细胞载玻片上，铺满整个细胞载玻片样品表面（注意：可以使用盖玻片盖上孵育）
2．室温下孵育30分钟，避免光照
3．小心移去细胞载玻片上的二抗液（Reagent E）
4．室温下，小心将细胞载玻片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
5．小心移去细胞载玻片上的清理液（Reagent A）
6．小心加上200微升含有显色液A（Reagent F）和显色液B（Reagent G）的显色工作液，铺满整个细胞载玻片样品表面
7．室温下孵育5至30分钟，或直至样本出现棕褐色
8．小心移去细胞载玻片上含有显色液A（Reagent F）和显色液B（Reagent G）的显色工作液9．室温下，小心将细胞载玻片置入50毫升清理液（Reagent A）中浸泡5秒
10．小心移去细胞载玻片上的清理液（Reagent A）
11．（选择步骤）进行甲基绿或苏木素复染（注意：建议使用甲基绿复染试剂盒－GMS40010）
12．放上盖玻片或封片
13．即刻在一般光学显微镜下观察：阳性细胞呈现棕褐色
注意事项
1．本产品为10次操作
2．操作时须戴手套，以防污染
3．清理液（Reagent A）50毫升置于小型染色缸里，可重复使用
4．所有操作在室温下进行
5．每次更换试剂溶液时，保持细胞载玻片面基本晾干。
空气中晾干状态为没有水滴，呈湿润状态，可见反光
6．试剂溶液在细胞载玻片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满细胞载玻片表面
7．细胞显色，避免过度，密切目测观察，控制时间
8．细胞显色完成后，即刻进行光学显微镜观察
9．本公司提供系列骨组织检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定显色清晰。