细胞培养2_人体间期细胞X—小体的制备
人体间期细胞X—小体的制备
一、原理
1949年Barr等发现，在雌性体细胞中的两条X染色体有一条（或这条的大部分）处于凝集不活动状态，从而形成X-小体（或称X-染色质、性染色质、Barr 小体）。
进而发现，所有哺乳类雌体细胞中都有一条这种表现的X染色体，当在个用雌或雄体中，有多于2条X染色体时，在间期细胞内除一条外，其余均形成X-小体。
人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY 和XX。
女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。
正常女性间期细胞中X小体阳性率约为30—50%。
二、仪器、用品及试剂
光学显微镜，恒温水浴箱；
牙签、载玻片、染色缸；
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶l）70%乙醇，硫堇染液；
5N HCl，0.2%甲苯胺兰染液。
三、操作步骤
（一）方法一
l．取材、涂片：取女性口腔上皮细胞均匀涂布在洁净载玻片上。
2．固定：涂片后立即95％乙醇中固定30分钟（不可干燥）。
气干。
3．染色：玻片在蒸馏水中冲洗几次后5N HCl（22℃）水解10分钟，蒸馏水洗去多余HCl，硫堇染色30分钟。
水洗。
4．镜检、气干后即可镜检。
若背景颜色过深可在75%乙醇、95%乙醇中分色后再镜检。
（二）方法二
l．取女性口腔上皮细胞涂片。
待干燥。
2．Carnoy固定液中固定15分钟。
干燥。
3．5N HCl中10分钟。
水洗。
干燥。
4．0.2%甲苯胺兰染色2—5分钟。
水洗。
气干。
5．镜检。
四、注意事项
l．涂片时应均匀涂成单层，取材细胞要多些。
取材前应漱口。
2．镜检应选择完整、核质中颗粒均匀的细胞观察，X-小体大小约为1μm，多位于细胞核边缘。
3．统计X-小体阳性率，计数应选300—500个细胞。
五、试剂
1．硫堇染液配方：
①4%硫堇原液：4g硫堇粉末置研钵中以50%乙醇100ml研磨溶解。
过滤。
②Michaelies缓冲液：醋酸钠9.714g，巴比妥钠14.714g加双蒸水至500ml。
③硫堇工作液（PH5.7）：0.1N HCl 32ml
Michaelies缓冲液28 ml
4%硫堇原液400ml
2．甲苯胺兰染液配方：
0.2g甲苯胺兰粉末溶于100ml双蒸水中即可。
细胞生物学考试押题及参考答案(1)
一、选择题1-5 BABBB 6-10 BDABB 11-15 ABCAC 16-18 CCC二、填空题1、根据线粒体和叶绿体起源内共生学说，认为线粒体起源于细菌，叶绿体起源于蓝藻。
2、协助扩散和主动运输的主要相同之处在于都需要载体，速度都很快,主要差别在于协助扩散只能顺浓度梯度进行，不消耗能量；主动运输可以逆浓度梯度进行，消耗能量。
3、核纤层结构的组成成分, 属于中间纤维蛋白家族4，核小体的核心由四种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各两分子共8分子组成的八聚体，核心的外面缠绕了1.75圈的DNA双螺旋，其进出端结合有H1组蛋白分子。
5、YAC（酵母人工染色体）的构建成功说明：一个有功能的染色体至少有自主复制DNA序列,着丝粒DNA序列, 端粒DNA序列三个不可缺少的功能元件。
6、真核细胞和原核细胞中都存在的rRNA是5SrRNA。
7、细胞周期调控中的两个主要因子细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶（CDK 激酶）和。
细胞周期蛋白其中前者是催化亚基，后者相当于调节亚基。
三、名词解释1.常染色质(euchromatin):间期核中处于伸展状态，压缩程度相对较低、着色较浅的染色质。
2.双信号系统：以PIP2代谢为基础的信号通路中，胞外刺激使转化为IP3和DAG，引发IP3/Ca2+和DAG/PKC 两条信号转导途径，在细胞内沿两个方向传递，实现细胞对外界的应答，这样的信号系统称之为双信号系统。
3.细胞周期同步化：将一个细胞群体内处于不同时期的细胞处于细胞周期的同一时相的方法。
4.多聚核糖体：具有特殊功能与形态结构的核糖体与mRNA的聚合体。
5.细胞凋亡：为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
6.Hayflick界限：正常的体外培养的细胞寿命不是无限的，只能进行有限次数的增殖。
7踏车行为：在一定条件下,微丝的正极由于肌动蛋白亚基不断添加而延长,负极由于肌动蛋白亚基去组装缩短,这种现象称为踏车行为。
实验五 人体细胞Barr氏小体的制备与观察
间期细胞核内侧靠近核膜处有约1微米大小的反光极强 的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果 可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核 膜较远或接近核中央制备与观察
一、实验目的
掌握 X - 染色质鉴别方法，识别 X - 染色质的 形态特征及部位。
二、原理
巴氏小体，又叫巴尔体（Barr body），指雌性动物的体细胞在间期 时，在核膜内面的一块染色很深的染色质。巴氏小体实际上是浓缩 了的X染色体，其上的基因不转录。 哺乳动物的雌性细胞有两个X染色体，其中一条来自母方，另一条 来自父方，在胚胎发育的早期，这两个X染色体中的一条浓缩形成 巴氏小体，因此雌性哺乳动物的体细胞中都含有一个巴氏小体和一 个能转录的X染色体，而雄性哺乳动物的体细胞有一条可转录的X 染色体和一条Y染色体。随着细胞分裂，巴氏小体也要复制，但上 面的基因从不转录。如果这个动物是三倍体，体细胞中也只有一个 能转录的X染色体，其余的X染色体都会浓缩形成巴氏小体。 巴氏小体只有女性有，巴氏小体数=X染色体数-1。
三、材料
人口腔黏膜细胞
四、方法步骤——人体细胞Barr氏小体的制备与观察 用灭菌牙签刮取口腔黏膜细胞； 涂片与风干（涂抹一下，不要来回涂）； 染色及压片（滴卡宝品红压片）： 染色10min后，盖上盖玻片，一头蒸馏水冲 洗，另一头用滤纸吸干。
五、观察结果——Barr body
观察人不同形态的X-染色体，并绘图
形态实验学PPT：人类X小体的检测-形态学自设计实验
——形态学自设计实验
一、实验目的
掌握人类X小体玻片标片的制作方法。 观察识别X小体形态特征及所在部位。
二、实验原理
发现：
1949年，加拿大学者Barr在研究猫的神经元 细胞时，发现雌猫神经元细胞核边缘有一个 染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没有这种 结构。进一步研究发现，所有雌性哺乳动物 细胞中都有这种小体，能显示性别差异。 在人类，男性细胞中很少或没有这种小体， 而女性有一个。
3.固定：
（ 1 ） 加 入 固 定 液 1ml ， 混 匀 ， 室 温 预 固 定 2min ， 1200r/min离心8min，弃上清。
（2）加入固定液5ml，吹打混匀，室温固定15min， 1200r/mi。
固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，使蛋白凝固，终止细胞代谢过 程，并保持细胞核染色体结构的完整性，并且能够增强染色体的嗜碱 性，达到优良的染色效果。
剂量补偿（dosage compensation effect）
女性有两条X染色体，但所表达的绝大部分遗传物质与只 有1个X染色体的男性是一样多的。这种男女X连锁基因产 物相等的现象在遗传学上称为剂量补偿。
对这一现象的解释是女性的X染色体中只有1个保持活性， 而另一个是晚复制的，没有活性。结果无论男女都只有一 条有功能的X染色体。
该失活的染色体在形态学上呈异固缩状态（细胞分裂周期 中与大部分染色质不同步的螺旋化现象），DNA螺旋压 的很紧，故染色深而致密。
应用：
1. 鉴定个体的性别
取材：口腔上皮细胞、毛囊细胞、羊水细胞
用途：优生学中进行胎儿性别检查，预防性染色体遗传性 疾病的发生。奥运会运动员性别鉴定。
2. 诊断性染色体异常综合征
弃上清时，用吸管吸取上清，弃去，接近下方沉淀时，应 小心吸取。
人类X染色质小体的检测 山东大学
科目遗传学实验题目人类X染色质小体的检测人类X染色质小体的检测摘要X染色质是指雌性哺乳动物体内的体细胞在间期细胞核中，除了一条X染色体外，另一条呈固缩状态的染色质结构，也称巴氏小体。
该特殊结构曾被用于检测奥运女选手遗传性别。
本次实验采用人口腔黏膜细胞和发根细胞为标本，通过硫瑾染液染色，在显微镜下观察巴氏小体部位和形态特征，并进行简单计数统计，估计自己具巴氏小体的细胞比率。
1.引言1948年，Barr的研究生Bertram在研究长时间刺激后神经元是否产生细胞学变化的实验时，观察到核仁附近有一种染色很深的小体，并且存在于部分细胞之中。
Barr通过观察标本，发现该结构与性别有关，称其为“核仁随体”并推测该小体是由两条性染色体的异染色质衍化而来的。
随着人类核型分析技术的成熟，X染色质小体逐渐被证实并且广泛用于大规模筛检X染色体数畸变个体。
1960年，Ohno和Hauschka发现X染色质小体实际上是一条在细胞分裂间期，收缩的、异染色质化的X染色体，与核仁关系不大。
后续研究表明，X染色质小体是由于胚胎发育早期X染色体失活造成的，在X 染色体长臂靠近着丝点的一段序列控制X染色体的失活。
本实验以人类口腔黏膜细胞和发根细胞为标本，经解离、硫瑾染液染色和压片后，观察巴氏小体的部位和形态，通过简单的计数，估计具巴氏小体的细胞比率。
2.材料和方法2.1 实验材料显微镜，牙签，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片；冰醋酸，蒸馏水，95%乙醇，1MHCl，染液：硫瑾染液。
2.2 实验方法2.2.1 获取实验材料实验一：口腔黏膜细胞先漱口2-3次，尽可能除去口中的杂物。
用牙签钝头在口腔一侧用力刮取，弃去第一次的刮取物，在同一部位用另一根牙签重新刮取，将刮到的细胞涂在清洁干燥的载片上，反复几次，晾干。
实验二：发根细胞拔取带毛囊的一根头发，将其置于45%的醋酸溶液中解离5Min，等毛根松软之后用解剖针尖将外层毛囊的组织细胞轻轻刮下。
用解剖针将载玻片上的组织细胞摊平。
人类X染色质的制备与观察
人类X染色质的制备与观察摘要X染色质（巴氏小体）是除一条X染色体外，其余的X染色体常浓缩成染色较深的染色质体。
本实验选取口腔粘膜细胞和毛囊细胞，通过解离、染色、压片等方法观察巴氏小体在细胞核内的分布及形态等特征，并且通过显微观察对巴氏小体进行计数，估计巴氏小体在不同性别和不同性格人体细胞中的出现率。
此外，了解X染色体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点也是本实验的目的之一。
关键词X染色质（巴氏小体）口腔黏膜细胞毛囊细胞1.引言X染色质小体（巴氏小体）是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），形成直径约1μm、贴近于核膜边缘的染色小体。
巴氏小体在细胞分裂间期细胞核中出现异固缩现象，表现出浓缩、染色深、无活性的特点。
巴氏小体在不同细胞中呈现不同的形态，有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。
一般来说，正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。
1949年，加拿大学者Barr在雌性猫神经元核仁附近发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现，Barr称这种小体为“核仁随体”，并推测小体是由两条性染色体的异染色质衍化来的。
1955年，Barr在女性的口腔细胞中发现Barr body（巴氏小体），Moor与Barr 用口腔黏膜上皮细胞检测Barr body，制作出日后被广泛使用的颊涂片。
1959年，人们把性染色体异常造成的畸形与巴氏小体的研究联系起来。
1960年，Ohno和Hauschka发现，X染色质小体实际上是一条在细胞分裂间期，收缩的、异染色质化的X染色体，与核仁并无关系，也不是Barr推测的那样由两条性染色体各贡献一部分异染色质形成。
受此启发，Lyon（1961，1962）研究了小鼠X染色体连锁的皮毛颜色基因突变体，进一步指出异染色质化的X染色体可以来自父方，也可以来自母本；异染色质化的染色体在遗传上没有活性（后来的研究表明异染色质化的染色体中还是有部分基因保持活性）；这种随机失活是性别决定为XX-XY的动物为平衡两性之间性染色体上的基因剂量而采取的一种特殊的调控方式（因为Y染色体上的基因数量很少，因此雌性个体必须通过减少X染色体上基因剂量的方式使两性个体间基因剂量取得均衡），即所谓的“剂量补偿”，这是X染色体失活的意义所在。
人类性染色质小体的制备和观察
箭头所示为巴氏小体（女性细胞[左]中存在，男性细胞[右]中没有）
六、注意事项
1．在实验中取材时应该注意安全； 2．如果用毛囊细胞进行试验，采样前应清 洗头发，因出油后拔漱口数次，用洁净牙签 从女性口腔两侧刮取粘膜，原位刮2～3次， 第1次舍去，第2，3次分别涂于干净载玻片 上。 固定：口腔粘膜细胞加入新配置的固定液 （95%乙醇:冰醋酸＝3:1），固定30min （固定液勿干）以上，空气干燥。
3）染色、制片 滴加染液，室温10min（勿干）； 在95%的酒精中分色1-3分钟； 在无水乙醇中继续分色两次，每次1分钟 用二甲苯透明两次，每次约3分钟； 加盖玻片，压片。
巴氏小体为女性细胞中所特有的染色体结构，是1条X染 色体呈异固缩状态所形成，各实验室所统计的观察率不尽 相同，从30％一50％不等，有些实验室中在男性的细胞 中发现X小体有2%的出现率，但小体结构不规范、典型。 巴氏小体常位于核膜内侧。直径为1μm左右，其形状有微 凸形、三角形、卵形、短棒形和双球形等。观察时需注意 巴氏小体与细胞的比例。 正常女性细胞中仅可观察到1个巴氏小体，而正常男性细 胞中无巴氏小体或仅在个别细胞中有不典型的巴氏小体存 在。
2）固定 口腔粘膜细胞加入新配置的固定液（95% 乙醇:冰醋酸＝3:1），固定30min以上，空 气干燥。
2）固定 毛囊细胞-拔取一根毛根比较大的毛发，在一张干 净的载玻片中央滴一滴45%的醋酸，静置约5分钟， 待毛根稍软后，用镊子尖把外层毛囊的组织细胞 轻轻刮下，弃去毛干。将细胞用解剖针在载玻片 上均匀摊平，并在空气中晾干。 实验改进意见：拿起上述发根的梢部，将其上毛 囊细胞轻轻蹭于另一干净载片上即可达到转移的 目的。（若用刀片或镊子将毛囊细胞刮下，可造 成细胞的堆积，同样会出现多层细胞的现象。1根 发根的毛囊细胞可以转移到3-4张载片上，以达到 充分利用实验材料的目的。观察时又可以看到清 晰的单层涂布细胞，便于观察统计。）
实验六 人类性染色体小体的制备与观察0
人类性染色体小体的制备与观察
实验原理
一、什么是人体X—染色体（1949，美，巴尔；1961，
英，莱昂，剂量补偿效应的X染色体失活假设 ）
常染色体和性染色体，常染色质和异染色质
二、X—染色质数目
克氏综合症XXY，特纳氏综合症XO
三、X—染色质的部位 (靠近核仁、在核质中、靠近核膜)
四、X—染色质的几种名称介绍
① 口腔颊部粘膜细胞：
取材→涂片→染色（3min）→压片
② 毛发根部细胞观察：
取材→45%冰乙酸（软化5分钟）→水洗
→染色（5min）→压片
正常女性头发毛囊细胞X－染色质
正常女性头发毛囊细胞X－染色质
作 业
绘口腔颊部粘膜细胞和毛发根部细胞
Байду номын сангаас
X—染色质，男女同学分别做对照。
①核仁卫星 ⑤X—染色质 ②性染色质 ③Barr小体 ④X—小体
实验目的
实验材料
1、口腔颊部粘膜细胞
2、头发毛囊细胞
实验器具与药品
1、用具：显微镜、镊子（2）、载玻片、盖 玻片、滤纸、刀片（4）、消毒牙签、小 烧杯（1）等 2、药品：45％醋酸（每大组一瓶）、改良 品红染液 （每小组一瓶）
实验步骤
人类X染色质(巴氏小体)制备与观察
人类X染色质（巴氏小体）的制备与观察摘要巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中形成的呈异固缩状态，贴近于核膜边缘的染色小体，在遗传学、细胞观察方面有重要意义。
实验中作者取人口腔颊部上皮细胞与发根毛囊细胞进行硫瑾染色操作，通过显微观察对巴氏小体进行识别与计数，描述巴氏小体的形态，并统计其在不同性别人体细胞中的出现率。
引言在哺乳动物体细胞间期细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体失活并呈异固缩状态，此即为巴氏小体。
又称X小体、性染色质，直径约1μm，通常位于间期核膜边缘。
1949年，加拿大学者Barr在雌性猫的神经元细胞核中发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现[1]。
通常人类男性细胞核中很少或没有巴氏小体，而女性有1个，性染色体异常的患者如XXY、 XXYY、XXX、XXXY等，巴氏小体的数量＝X染色体数量－1。
综合巴氏小体与哺乳动物性染色体的剂量补偿效应，Lyon M．F 于1961年提出Lyon 假说，主要内容有：(1)正常的雌性哺乳动物两条X染色体只有一条在遗传上有活性，另外一条失活；(2)X染色体失活是随机的。
因此表达是随机的，结果在杂合子中会出现嵌合现象（mosaic）。
例外：有袋类失活的X染色体全部是父方的。
(3)失活发生在胚胎发育的早期，如人在受精后的16天（5000-6000个细胞时）。
一个细胞的一条染色体一旦失活，这个细胞的后代细胞中该染色体均失活。
Lyon假说虽然可以解释一些问题但不是全部，如人类中的44AXO型个体表现为Turner 综合症、44AXXY表现为Klinefelter综合症。
随着生物学和医学的发展人们已经认识到单条X染色体失活现象是普遍存在的，但失活的染色体上存在失活区和非失活的。
如人类中位于X染色体上的基因，G6PD（葡萄糖-6磷酸脱氢酶）、AHF（抗溶血第Ⅷ因子）等是非失活的，而Xg血型基因是失活的。
巴氏小体的生物学观察，对于优生学中鉴别性别和预防性连锁疾病的发生，以及作为癌细胞核异常主要形态学特征之一鉴定癌细胞，有重要价值[1]。
9人类性染色质小体的制备与观察
人类在受精后的第16天（受精卵分裂到 5000-6000），植入子宫壁时发生lyon化。
剂量补偿：
由于雌性细胞中的两个X染色体中的一 个发生异固缩（也称Lyon化），失去活性， 这样保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染 色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物 的量保持在相同水平上。这种效应称为X染 色体的剂量补偿。
➢ 进一步研究发现，其他雌性哺乳动物（包括人 类）也同样有这种显示性别差异的结构。而且不 仅是神经元细胞，在其他细胞的间期核中也可以 见到这一结构，称之为巴氏小体，也称为X染色 质。大小在1µm左右，呈三角形、卵形、短棒形 等。
研究发现，间期核内X染色质的数目总是 比X染色体的数目少1。
进一步研究表明： X染色质是一条异染 色质化（兼性异染色质）的X染色体，在间 期复制要比其他的染色体晚。
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
实验十 人类性染色质小体 的制备与观察
实验目的 实验原理 实验材料与药品 实验方法 注意事项 实验作业 思考问题
掌握莱昂假说和X染色体剂量补偿的含义。
掌握观察与鉴别X染色质的简易方法，识别 其形态特征及所在部位，为进一步研究人 体染色体的畸变与疾病提供参考依据。
发现
➢ 1949年，Barr在雌猫的神经元间期细胞核中首 次发现一种染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没 有。
达，则产生橙黄色毛斑。
Y染色质
正常男性的间期细胞用荧光染料染色后， 在细胞核内可出现一荧光小体，直径为0.3-1μm左右，称为Y染色质。 Y染色质在间期 也呈现异固缩状态。Y染色体长臂远端部分 为异染色质，可被荧光染料染色后发出荧 光。这是男性特有的，女性细胞中不存在。 细胞中Y染色质的数目与Y染色体的数目相 同。
实验四人类X小体、Y小体检测
X小体、Y小体的形态学特征分析
总结词
X小体和Y小体的形态学特征存在明显差 异。
VS
详细描述
X小体通常较大，形状不规则，而Y小体 则相对较小，形态较为一致。此外，X小 体的荧光强度较强，而Y小体的荧光强度 较弱。这些特征有助于区分X小体和Y小 体。
X小体、Y小体的荧光原位杂交技术检测结果分析
总结词
X小体、Y小体的生物学意义
性别决定
X小体和Y小体的存在是性别决定的关键因素之一。男性具有一个X染色体和一个Y染色体，而女性具有两个X染色 体。X小体和Y小体的形成有助于维持性别比例的平衡。
遗传疾病诊断
通过检测X小体和Y小体，可以对某些遗传疾病进行诊断。例如，某些遗传性疾病与X染色体或Y染色体上的基因 变异有关，通过检测这些变异可以诊断疾病。
学习X小体、Y小体的检测方法
X小体检测方法
利用荧光染色技术对间期细胞进 行染色，观察细胞核中呈现的X小 体的数量和形态。
Y小体检测方法
利用荧光染色技术对间期细胞进 行染色，观察细胞核中呈现的Y小 体的数量和形态。
掌握X小体、Y小体检测在临床上的应用
性别鉴定
通过检测X小体和Y小体的数量和形态， 可以确定个体的性别。
肿瘤诊断
某些肿瘤细胞可能存在X小体、Y 小体的异常表达，通过检测这些 异常表达有助于肿瘤的早期发现 和诊断。
遗传性疾病研究
X小体、Y小体的异常可能与某些 遗传性疾病的发生发展有关，通 过检测这些异常有助于深入了解 遗传性疾病的发病机制。
X小体、Y小体检测的未来发展方向
检测技术的改进
随着科技的发展，未来将有更高 效、更准确的检测方法应用于X 小体、Y小体的检测中，提高检
荧光原位杂交技术检测结果显示，X小体和 Y小体在染色体上的定位不同。