免疫化学技术
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术是一种用于研究细胞中蛋白质和其他分子的方法，它是由多种技术组合而成，包括免疫染色，蛋白质印迹，荧光免疫染色，荧光激活细胞排序，流式细胞术等。
它可以用来研究细胞中的蛋白质组成，结构，功能，信号转导和其他活动。
免疫细胞化学技术的主要步骤是：第一步，从细胞中提取蛋白质；第二步，用特异性抗体进行免疫染色；第三步，检测染色的蛋白质组成；第四步，用荧光技术进行检测和定量分析。
免疫细胞化学技术的优点是可以快速、准确、灵敏地检测细胞中蛋白质的分布和组成，可以用来对细胞中蛋白质的结构，功能，信号转导，代谢和其他活动进行详细的研究。
它还可以用来鉴定和确认细胞内的病毒，细胞外的病原体，细胞表面的抗原，细胞内的酶和其他分子。
免疫细胞化学技术已经在生物医学研究中应用广泛，用于研究疾病的发病机制，诊断疾病，发现新药物，评价治疗效果等。
它在肿瘤学，神经病学，免疫学，病毒学，心血管病学，营养学，遗传学等领域发挥了重要作用。
总之，免疫细胞化学技术是一种重要的研究细胞中蛋白质组成，结构，功能，信号转导和其他活动的研究方法，具有快速，准确，灵
敏，定量，多种技术组合等优点，已经在疾病的研究，诊断，治疗，药物发现等多个领域得到广泛应用。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原的关键技术
说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原
的关键技术
免疫组织化学技术是一种基于免疫学原理的实验技术，适用于检测组织和细胞内蛋白质抗原。
其关键技术包括以下几个方面：
1. 抗原表位的选择：选择合适的抗原表位对于正确识别目标抗原至关重要，通常需要根据已知的抗原序列设计合适的抗原表位。
2. 抗原修复处理：组织标本或细胞病理部分常常因为常规处理方式而导致抗原失活、免疫组织化学染色效果受阻，因此，要使用抗原修复处理方法，如热解或酶解等，来恢复抗原的免疫原性。
3. 抗原特异性抗体的使用：使用特异性抗体与目标抗原发生特异性结合，通常用于检测和定位特定的抗原。
4. 免疫组化染色：将标本与特异性抗体反应后，通过适当的染色方法，如荧光染色、酶染色或放射性标记等方法，来进行成像和信号检测。
5. 图像分析和数据处理：通过数字化成像技术和计算机软件处理技术，对免疫组织化学染色的图像数据进行定量分析和计算，以实现更精确的数据表达和研究结果。
临床分析中的免疫组织化学技术进展
临床分析中的免疫组织化学技术进展免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）作为一种重要的临床分析方法，在肿瘤诊断、治疗和预后评估等方面发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和应用的广泛推广，免疫组织化学技术逐渐成为临床医学中的一项必备技能。
本文将从技术原理、应用领域和进展方面对免疫组织化学技术进行综述。
一、技术原理免疫组织化学技术是利用抗体与相应抗原结合的特异性反应来检测组织或细胞中特定分子的存在与定位。
其基本原理是将组织切片经过特定的预处理步骤后，使用专门的免疫反应试剂盒，将抗体与待检测的抗原发生特异性结合，并通过染色反应来显示抗原的分布情况。
免疫组织化学技术的核心在于选择合适的抗体，其中包括一抗和二抗。
一抗与待检测的抗原结合后，通过与二抗反应生成复合物，再使用染色试剂可使复合物形成染色沉积物。
通过显微镜观察染色沉积物的颜色和分布情况，可以得出待检测抗原在组织中的表达情况。
二、应用领域免疫组织化学技术已广泛应用于肿瘤学、病理学、免疫学等临床领域。
在肿瘤诊断中，可以通过检测特定标志物的表达来帮助鉴别不同类型的肿瘤，指导临床治疗。
例如，通过检测ER、PR、HER2等标志物的表达情况，可以为乳腺癌患者提供更精确的治疗策略。
在病理学中，免疫组织化学技术可以帮助鉴别病变的类型和性质。
通过检测特定抗原的表达情况，可以确定病变是否来源于肿瘤细胞、病毒感染等。
此外，免疫组织化学技术还可以在肾脏病变、风湿疾病等方面提供重要的诊断依据。
免疫组织化学技术在免疫学研究中也起着重要作用。
通过检测特定免疫细胞或分子的存在与定位，可以揭示机体对疾病或外界刺激的免疫应答过程，对于研究免疫学机制具有重要意义。
三、进展方向随着科学技术的不断进步，免疫组织化学技术也在不断发展和完善。
主要体现在以下几个方面。
1. 抗体的选择和特异性改进。
随着对不同抗原的研究深入，筛选和改进抗体的方法不断提升。
目前，已有多种技术可用于获得高特异性的抗体，如单克隆抗体和人工合成抗体等。
免疫组织化学技术的特点
免疫组织化学技术的特点免疫组织化学技术是一种在生物学和医学领域中广泛应用的重要方法，它能够在细胞和组织水平上对特定蛋白质、抗原等生物分子进行定位、定性和定量分析。
这项技术具有许多独特的特点，为疾病的诊断、治疗和科学研究提供了有力的支持。
一、高特异性免疫组织化学技术的核心在于抗体与抗原的特异性结合。
所使用的抗体是针对特定抗原表位设计和制备的，因此能够高度特异性地识别和结合目标抗原。
这意味着在复杂的细胞和组织环境中，该技术可以准确地检测到我们感兴趣的特定分子，而不会与其他相似或无关的分子发生交叉反应。
这种特异性使得免疫组织化学能够在细胞和组织中精准地定位特定的蛋白质、激素、受体等生物标志物，为疾病的诊断和研究提供准确的信息。
例如，在肿瘤诊断中，通过使用针对肿瘤特异性抗原的抗体，可以明确肿瘤细胞的来源和类型，区分良性和恶性肿瘤，以及确定肿瘤的分化程度和侵袭性。
对于神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，特定的抗体可以检测到大脑组织中异常积累的蛋白质，如β淀粉样蛋白和tau 蛋白，为疾病的诊断和研究提供重要依据。
二、高灵敏度免疫组织化学技术具有很高的检测灵敏度。
即使目标抗原在样本中的含量很低，通过适当的抗体标记和检测方法，也能够被检测到。
这对于检测微量的生物分子，尤其是在疾病早期或病理变化轻微的情况下，具有重要意义。
现代免疫组织化学技术不断发展和改进，采用了更加灵敏的检测系统，如增强化学发光法、荧光染料标记等，能够进一步提高检测的灵敏度。
同时，优化的样本处理和抗原修复方法也有助于充分暴露抗原，提高检测的准确性和灵敏度。
在临床实践中，高灵敏度的免疫组织化学技术可以帮助早期发现肿瘤的微小转移灶，监测疾病的进展和治疗效果。
在科研领域，它能够检测到细胞内低丰度的蛋白质表达变化，揭示生命活动中的细微调节机制。
三、定位准确免疫组织化学技术能够在细胞和组织的微观结构中准确地定位目标抗原。
通过将抗体与显色剂或荧光标记物结合，可以直观地观察到抗原在细胞内的分布位置，如细胞核、细胞质、细胞膜等。
免疫组织化学技术的应用
免疫组织化学技术的应用免疫组织化学技术概述免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理进行生物分子检测和定位的技术。
它采用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，在组织切片中检测和定位某一特定分子。
原理免疫组织化学技术利用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，即对一种特定抗原有高度选择性的抗体与组织样品中的该抗原相结合产生可见的信号。
这种信号可以是产生光学、荧光或颜色改变等形式。
应用1.生物医学研究：免疫组织化学技术可以检测组织中特定蛋白质的分布和表达，是研究生物医学领域中蛋白质分子组学的基础技术之一。
2.临床诊断：免疫组织化学技术可以应用于肿瘤诊断、流行病学调查等领域。
通过检测某些肿瘤标志物、细胞表面分子和内分泌指标等，可以帮助医生进行正确诊断。
3.药物制剂：免疫组织化学技术可以帮助研究药物分布和作用机制。
例如，在研究心血管药物时，可以用抗体检测受体的表达和分布，从而了解药物作用机制和药效。
优点1.高度特异性：免疫组织化学技术可以准确地检测特定分子，避免了其他分子的干扰。
2.高灵敏度：可以检测极微量的分子，并精确定位其位置。
3.多样性：可以应用于不同分子种类的检测和定位，有很大的应用前景。
局限性1.抗体交叉反应：某些抗体可能对多种分子有交叉反应，导致误判。
2.样品制备：样品的制备和处理对结果产生影响，需要更加严格的标准化。
3.价格昂贵：用于免疫组织化学技术的抗体相对价格较高，加上试剂盒和设备的购买，成本较高。
结论免疫组织化学技术作为一种重要的实验室技术，具有广泛的应用前景。
这种技术可以在细胞和分子层面上全面解析生物体的结构和功能，是生物医学领域中不可或缺的技术之一。
免疫组织化学技术的操作步骤1.标本制备：首先需要采集组织样本，处理后制成组织切片。
2.抗体处理：挑选合适的抗体，经过处理（如荧光标记、酶标记等），制成特定的抗体试剂。
3.特定抗原检测：在组织切片上滴加特定抗体试剂，进行特定抗原的检测。
4.反应信号检测：根据抗体的标记方式，进行相应信号的检测。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
图 2-1-2
免疫动物用的双向注射器
(二）百日咳毒素法 每小鼠 100ng 百日咳毒素与抗原同时静脉注射。 (三) 霍乱毒素法 与抗原同时口服，每小鼠用量为 100-500ng.
实验要点及说明
１． 用前要确定抗原－佐剂复合物是稳定的：乳剂滴置冷水中不分散； ２． 福氏完全佐剂如注入皮下或滴入眼，十分有害； ３． 在第一次免疫后或免疫增强剂注射后，一般抗体的滴度峰在 10-30 天期间 出现，注意在此期间进行监测。
基本原理
Sepharose 是琼脂糖凝胶颗粒的商品名，可与抗体连接制成亲和层析载体。 Sepharose 需先经活化后再与蛋白质连接。经溴化氰（CNBr）活化来制备亲和层析 载体是最常用的方法。琼脂糖、交联琼脂糖和聚丙烯酰胺都可以被 CNBr 活化而作 为与蛋白质结合的固相载体。抗体通过赖氨酸残基上的ε-氨基与活化了的载体以共 价键连接。连接后形成的亲和层析载体，可吸附相应的抗原从而分离提纯抗原或带 有特异抗原决定簇的抗原片段。本文主要介绍 CNBr 活化的 Sepharose 4B 与抗体的 连接。
203
5.
如不具备蠕动泵及部分收集器，则可利用重力手动收集 0.5-2ml/管，通过紫 外分光光度计测定 280nm 的吸收度。 6. 在用低 pH 溶液洗脱时，有抗体可能从介质上脱离。因此，IgG 的重链及轻链 可能污染洗脱组分。
参考文献
1. Guesdon, JL. and Avameas, S. (1976) Polyacrylamide-agarose beads foe the preparation of effective immunoabsorbants. J Immunol. Meth. 11, 129-133 2. Ternyck, T. and Avameas, S. (1972) Polyacrylamide-protein immunoabsorbants prepared with glutaraldehyde. FEBS Lett. 23, 34-28 （ 朱正美 ） 附：抗体-Sepharose 4B 亲和层析柱的制备
试剂及仪器
待固相化抗体 聚丙烯酰胺或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶小珠（有市售商品） 25%戊二醛（电镜级） 含待纯化抗原的混合物 1 mol / L 磷酸钾缓冲液，pH 7.4 (见附录 1) 含 0.1 mol / L 甘氨酸的 0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （见附录 1） PBS （见附录 1） PBS + 0.01 mol / L HCl + 叠氮钠（ 叠氮钠为有毒试剂） 洗脱缓冲液： 0. 2 mol / L HCl + 甘氨酸缓冲液 ，pH 2.8 再生缓冲液： 0.2 mol / L HCl + 甘氨酸缓冲液 pH 2.2 1mol/L 磷酸氢二钾
操作步骤
204
1. 纯化的抗体对结合缓冲液透析过夜（4°C）； 2. 加 10ml CNBr-Sepharose 4B 到 10ml 抗体溶液中。放在摇床或振荡器上，轻轻 振摇过夜（4°C）。( 图 2-1-1 )；
图 2-1-1 CNBr 活化的 Sepharose 4B 与抗体 交联示意图
3.
202
1． 将层析柱与蠕动泵及部分收集器连接，如无此类设备可用手工操作（则参见后 列说明）； 2． 将含待纯化抗原的混合物缓慢上样（大约 10ml/h）,如果混合物的体积大于柱 体积，可将混合物过柱后再循环上样； 3． 在室温或 4℃孵育 1-2h，参照抗原的稳定性来选择温度； 4． 在 4℃，用 PBS 洗柱。直至其流出液 A280nm < 0 .05。 （三）抗原洗脱 1． 在 4℃，用 0.2 mol / L pH 2.8 HCl-甘氨酸缓冲液洗脱抗原，按 1-2ml/管收 集洗脱液。测定每一管的 A280nm； 2． 当 A280nm < 0.05 时，先后用 0.2 mol / L pH 2.2 HCl-甘氨酸缓冲液及含 0.1g/L 叠氮钠的 PBS 洗柱； 3． 含有抗原组分的各管，每管按 100-200μl / ml加入 1 mol / L K2HPO4 ,以中 和其酸性； 4． 用 SDS-PAGE 或功能检测法（如 RIA, ELISA）检测，以确定各管有无抗原的存 在； 5． 将含有抗原的各管合并，在 4℃对 PBS 透析。如果需要，可对抗原液进行浓 缩。
207
参考文献
Moncada,C., Torres, V. And Israel,Y. (1993) Simple method for the preparation of emulsions for immunolization. J. Immunol. Meth. 152, 133-140 （朱正 美） 三．小分子肽抗原与载体蛋白交连
基本原理
增强抗体的应答尤其是对于剂量小或抗原性低抗原的应答，最常用的方法是与 抗原同时注入合适的佐剂。当佐剂含有细菌组分时，可起到增加对有效抗原的摄 取、延长抗原的存在时间及非特异性的增强免疫系统的反应的作用。 佐剂的选择对抗体的亚型及应答性有影响。一般的规律是，在小鼠应用百日咳 杆菌毒素或氢氧化铝会增加过敏性抗体类型：IgG1及IgE。相反，应用完全福氏 （Freund’s）佐剂会增强IgG2a同工型的应答，而含霍乱毒素的佐剂会增强IgA的应 答。 对于小分子糖半抗原的处理参见第六篇第一章。
质控实验
1. 在抗体固相化后，将洗脱液过滤，测定蛋白质总量（方法见附录 4），计算抗 体的固相化偶联率，通常偶联率应大于 80%。 2. 洗脱抗原的纯度，可用 SDS-PAGE 测定。
实验要点及说明
1. 实验需要采用重蒸馏水，以免水中化合物含有游离氨基的干扰。不然，固相化 的洗脱过程中氨基可能与醛基反应。 2. 如果醛基活化的凝胶，活化后不能及时应用，可放在含 0.5% 戊二醛的 0.1 mol / L 磷酸缓冲液（pH7.4）中，4℃保存，可稳定保存数周。 3. 经纯化的单克隆或多克隆抗体，均可用来制备含抗体的介质。每 ml 的聚丙烯 酰胺或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶小珠，可结合 1-3mg 抗体。 4. 采用低pH的缓冲液以洗脱抗体，是最有效的方法，但如此酸性条件不适于被纯 化的抗体，则可用含吸水性能的浓盐溶液（如 4 mol/L MgCl2 , 3 mol/L KSCN）。
对照实验
抗体与 CNBr - Sepharose 4B 的结合量可通过结合前后蛋白量的变化来确定。
实验要点及说明
1. 抗体样品不得含有其它带氨基的化合物。
2.
3.
在交联时某些单克隆抗体活性会明显丧失。如果抗体的活性在交联过程中剧烈 下降，则应在扩大交联之前停止反应或选用其它方法（例如用戊二醛活化的载 体）。 抗体的交联是不定向的，如果赖氨酸残基含在抗体结合位点中，会导致其失去 抗原结合能力。
试剂及仪器
• • • • • • 纯化的抗体（50-100mg 溶于 10ml 柠檬酸缓冲液）。 CNBr 活化的 Sepharose 4B（有商品供应），凝胶沉淀体积 10ml。 结合缓冲液：0.1mol /L 柠檬酸钠缓冲液,pH6.5 (见附录一)。 洗脱缓冲液：0.1mol /L 柠檬酸钠缓冲液,pH6.5 含 1mol/L 的 NaCl。 2 mol /L 乙醇胺 透析袋 (MW CO 10 000)
参考文献
Cuatrecasas,P.(1970) Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads J.Biol.Chem.245,3059-3065. （夏泉） 二．免疫前抗原准备及增强其抗原性的方法
加 1ml 2 mol /L 乙醇胺溶液（封闭 CNBr-Sepharose 4B 残余的活性基团）， 继续振摇 1 小时（4°C）； 4. 将抗体- Sepharose 4B 装到适当的层析柱中。用两倍柱体积的结合缓冲液洗 柱，接着用两倍柱体积的洗脱缓冲液洗，最后用两倍柱体积的 PBS 洗。凝胶在 使用和保存时，须始终保持在液面以下，不得干燥； 5. 抗体- Sepharose 4B 加叠氮钠（0.2g/L）后 4°C 储存。
试剂及仪器
佐剂（有商品化佐剂，或自制佐剂） 注射器（小鼠用 1ml，家兔用 2-5ml） 针头 （小鼠用 25-G, 家兔用 30-G） 聚乙烯塑料管 双向注射器装置（见图 2-1-1）
操作步骤
206
（一）氢氧化铝法 1. 溶解 30g硫酸铝铵（NH4Al (SO4)2.12H2O）于 360ml蒸馏水中； 2. 慢慢加入 150 ml 1N NaOH； 3. 在室温放置 30 min； 4. 以蒸馏水洗沉淀 3 次； 5. 制成 50-60mg/ ml 悬液，在４℃保存； 6. 以每小鼠１mg 与抗原同时注射； 7. 溶于盐水的抗原与佐剂（不完全或完全佐剂，仅完全佐剂含有结核分支杆菌） 可用上述特殊的双向注射器设备混匀； 8. 每小鼠的注射总量一般为 0.2ml 皮下注射，或 0.05ml 足掌注射，注意勿将抗 原乳剂用于静脉注射； 9. 也可用其它脂类或矿物油来代替上述佐剂，制成水－油、或油－水乳剂再加入 或不加细菌细胞壁成分，用于免疫小鼠或家兔。
第二篇 免疫化学技术
第一章 抗血清制备
第一节
一．抗体亲和层析纯化法
抗原纯化及制备的基本方法
基本原理
在生物化学研究及生物技术工程中，免疫亲和层析广泛应用于从复杂混合物中 纯化蛋白质。应用固相化的抗体，通过常规的一步法可将抗原纯化 1000-10000 倍。用固相化抗体纯化抗原的方法可分为三个主要步骤： 抗体的固相化； 抗原与含抗体的介质结合； 洗脱抗原。 如果有所需的免疫亲和介质，根据下面的纯化蛋白质的操作步骤，可方便的应 用于多种的抗原纯化。
基本原理
为了得到抗小分子肽的抗体，可通过载体蛋白与其交联来加强其免疫源性。此外， 当应用固相化短肽进行固相免疫试验（如 ELISA,RIA）时，由于 6-16 肽一般和塑料表面 的结合不够满意，也需用肽-载体蛋白复合物进行包被。曾用多种交联方法来制备肽-载 体蛋白复合物，以下介绍其中应用广泛的戊二醛和羰二亚胺交联两种方法。戊二醛主要 与蛋白分子的赖氨酸残基反应、也与α-氨基及半胱氨酸的巯基反应。羰基二亚胺则主要 与α-氨基、ε-氨基及羰基反应，其次也与巯基和酚羟基反应。