一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片
数字pcr标准
数字pcr标准数字PCR（digital PCR，dPCR）是一种核酸绝对定量技术，它通过将核酸样本分散到大量独立的反应单元中，并分别进行PCR扩增，实现对核酸的绝对定量。
数字PCR技术具有高精度、高灵敏度、高重复性和高可追溯性等优点，因此在生物医学研究、临床诊断、基因组学和农业等领域具有广泛的应用前景。
以下是关于数字PCR标准的详细介绍。
一、数字PCR标准的发展历程数字PCR技术最早由Applied Biosystems公司开发，并作为其专利技术进行推广。
该技术通过将核酸样本分散到大量独立的反应单元中，并对每个反应单元进行PCR扩增，利用泊松分布原理实现对核酸的绝对定量。
随着技术的发展和市场的需求，数字PCR技术逐渐得到广泛应用，并形成了一系列的技术标准和规范。
二、数字PCR技术的原理数字PCR技术的原理是将核酸样本分散到大量独立的反应单元中，每个反应单元中包含一定量的模板核酸、引物和DNA聚合酶等反应成分。
在PCR扩增过程中，每个反应单元独立地进行PCR扩增，最终得到的PCR产物数量符合泊松分布规律。
通过统计PCR产物的数量，可以实现对目标核酸的绝对定量。
三、数字PCR技术的优势数字PCR技术相比传统的定量PCR技术具有以下优势：1.高精度：数字PCR技术通过将核酸样本分散到大量独立的反应单元中进行PCR扩增，可以消除传统定量PCR技术中存在的荧光信号交叉干扰和基线漂移等问题，从而实现高精度的定量。
2.高灵敏度：数字PCR技术对核酸的检测灵敏度可达单个分子水平，比传统定量PCR技术更高。
3.高重复性：数字PCR技术在独立反应单元中进行PCR扩增，可以消除传统定量PCR技术中存在的重复性问题，从而实现高重复性的定量。
4.高可追溯性：数字PCR技术对每个反应单元进行独立定性和定量，可以实现从样本到结果的完整可追溯性，保证结果的准确性和可靠性。
四、数字PCR技术的应用领域数字PCR技术在生物医学研究、临床诊断、基因组学和农业等领域具有广泛的应用前景。
数字pcr组成
数字pcr组成
数字PCR技术是一种高精度、高灵敏的PCR技术，它利用数码技术将PCR产物数量进行数字化，从而实现了基因检测的高通量和高精度。
数字PCR通常由以下几个组成部分构成：
1. 热循环系统：数字PCR热循环系统包含温控器和加热板，用于控制PCR反应体系的温度和时间，实现PCR扩增。
2. 数字PCR芯片：数字PCR芯片是数字PCR的核心部件，它通常由微流控芯片和数字PCR芯片两个部分组成。
微流控芯片用于控制PCR反应体积和反应过程，数字PCR芯片则用于将PCR产物数量数字化。
3. 数字PCR检测设备：数字PCR检测设备是用于检测数字PCR 芯片中PCR产物数量的设备，通常包括荧光检测器和摄像头等部件。
4. 数据分析软件：数字PCR数据分析软件可将数字PCR芯片中获得的PCR产物数量数据进行处理和分析，从而实现基因检测的定量和质量控制。
数字PCR技术的组成部分不同于传统PCR技术，它利用微流控和数字技术实现了PCR产物数量的精准控制和数字化，从而在基因检测和精准医疗等领域具有广阔的应用前景。
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南通微流控芯片数字pcr原理
南通微流控芯片数字pcr原理
微流控芯片数字PCR是一种通过微流控芯片将样品分离成微
小的液滴，然后进行PCR扩增、检测和分析的技术。
其原理如下：
1. 样品的预处理和分离：将需要检测的样品进行预处理，比如提取DNA或RNA，并将其分离成微小的液滴。
在微流控芯片中，液滴可以通过微通道控制，实现精确控制液滴大小和数量。
2. PCR扩增：在微流控芯片中，每个液滴都可以作为一个反
应室，进行PCR扩增。
PCR是一种将DNA模板扩增成数百
万份复制的技术，需要进行多次循环的温度变化。
3. 检测和分析：扩增完成后，可以通过等离子检测器或荧光显微镜等方法对微小液滴中的目标DNA分子进行检测和分析。
通过检测PCR扩增产物的数量和时间，可以确定目标DNA的数量和种类，实现高度灵敏的检测和分析。
通过微流控芯片进行数字PCR技术，可以提高PCR扩增的速
度和灵敏度，并实现精确制备和自动化操作，从而广泛应用于生物医学研究、临床诊断和环境监测等领域。
数字pcr原理
数字pcr原理数字PCR原理。
数字PCR（Digital PCR）是一种基于PCR技术的高灵敏度、高精确度的DNA定量分析方法。
与传统的实时定量PCR相比，数字PCR能够更准确地定量目标DNA的起始量，特别适用于稀有突变体的检测和细胞外DNA的定量分析。
数字PCR的原理基于将DNA样本分割成许多微小的反应单元，每个单元中只包含一份目标DNA分子，通过对单元中目标DNA的扩增和计数，可以准确地确定起始DNA的数量。
数字PCR的实现依赖于微流控芯片技术，通过微流控芯片将DNA样本分割成数以千计的微小反应单元。
在每个反应单元中，目标DNA被扩增至可检测的水平，然后使用荧光探针或染料进行标记，通过荧光信号的检测和计数，可以得到每个反应单元中目标DNA的数量。
通过对所有反应单元的计数结果进行统计分析，可以准确地确定起始DNA的数量，从而实现对DNA的高精确度定量。
数字PCR的原理核心是将DNA样本分割成独立的反应单元，每个单元中只包含一份目标DNA分子。
这种分割可以避免PCR反应过程中的竞争效应，提高了定量的准确性。
另外，数字PCR还具有更高的检测灵敏度，可以检测到非常稀有的突变体或低拷贝数的DNA分子。
这使得数字PCR在肿瘤早期诊断、液体活检等领域具有广阔的应用前景。
数字PCR的原理与传统PCR相似，都是通过DNA的扩增来实现对DNA的定量分析。
但是数字PCR通过微流控芯片技术将样本分割成独立的反应单元，避免了PCR反应中的竞争效应，提高了定量的准确性和灵敏度。
数字PCR已经被广泛应用于医学诊断、生物学研究、环境监测等领域，成为DNA定量分析的重要工具。
总的来说，数字PCR是一种基于PCR技术的高精确度、高灵敏度的DNA定量分析方法，其原理基于微流控芯片技术实现样本的分割和DNA的独立扩增。
数字PCR已经成为生物医学领域中重要的分子生物学工具，为基因检测、疾病诊断、药物研发等领域提供了强大的支持。
随着技术的不断进步和应用的拓展，数字PCR将在生命科学领域发挥越来越重要的作用。
微流控芯片应用场景
微流控芯片应用场景微流控芯片是一种基于微纳米技术和流体力学原理设计的芯片，常常用于实现微小流体控制和化学反应的自动化。
微流控芯片具有大量优秀的特性，如小体积、高精度、快速响应等，在众多应用场景中发挥着重要作用。
医疗与生物学领域微流控芯片在医疗与生物学领域可应用于细胞生长、细胞分析、肿瘤诊断、药物筛选等等。
其应用场景主要包括以下几个方面：1、基于微流控芯片的PCR技术。
芯片上的微通道结构可以实现小分子混合和分离，这使得成功扩增和分离DNA序列成为可能。
2、流式细胞术。
微流控芯片可用于细胞类型、数量、状态的检测，可以实现自动化、高通量筛选，而且不需要大量的样品。
3、朊病毒筛选。
微流控芯片可以筛选不同的病毒突变体，以筛选出最具致病性的病毒。
4、基于微流控芯片的药物筛选平台。
微流控芯片可以模拟复杂的微环境，例如肿瘤周围组织环境，帮助研究员筛选更具有生理活性的化合物。
工业生产微流控芯片可用于各类生产中，该方面主要应用场景有以下几个方面：1、基于微流控芯片的化学反应控制。
微流控芯片中的小管道和微反应器可以实现微水平的混合及反应，其优点包括大幅减少反应液体积和方便的高通量产出。
2、高通量筛选合成材料。
微流控芯片可以通过纳米粒子合成的参数进行微观控制，可以快速高效地分析新型材料的性质，可以挖掘出众多冷门原子组合，并快速生产出可工业化的新型材料。
3、重金属药剂回收。
微流控芯片中的纳米颗粒可以帮助去除水中有害物质，例如有害的化工废水或重金属药剂，将其隔离、收集和浓缩起来，以便后续利用或处置。
能源领域微流控芯片在能源领域可应用于提高能源的利用效率，主要应用场景如下：1、新型电池材料的筛选。
微流控芯片可以快捷、高效地筛选新型电池材料，可以减少研发时间，降低研发成本，为电池行业的研发提供有效的手段。
2、基于微流控芯片的液态固体燃料电池。
微流控芯片可以协调重金属离子流体、钠离子电解质、电解液等等复杂的化学反应，开发出新型的清洁能源。
多种基于微流控芯片的检测方法用于细菌检测
多种基于微流控芯片的检测方法用于细菌检测邵奕霖;徐小平;高菊逸【摘要】致病菌常规检测方法以培养鉴定为主,该方法周期长,培养条件苛刻,难以做到快速检测.微流控芯片具有小型化、高通量、快速、集成、耗材少等优点,近年得到了快速发展并逐步应用于各个领域.利用微流控芯片技术可实现细菌的快速检测,将该技术与其他技术相结合也得到了广泛应用.该文就近些年联合其他细菌检测方法设计的微流控芯片进行了综述,并探讨各种协同方法的优缺点及临床应用前景或价值.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(035)004【总页数】2页(P296-297)【关键词】微流控芯片;细菌;快速检测【作者】邵奕霖;徐小平;高菊逸【作者单位】南昌大学研究生院医学部,南昌330006;香港大学深圳医院,广东深圳518053;香港大学深圳医院,广东深圳518053;香港大学深圳医院,广东深圳518053【正文语种】中文【中图分类】R446.6微流控芯片(microfluidic chip)技术是在微米级通道内操控微量流体的技术，通过微进样技术和对微通道内流体的控制，可将芯片分隔成多个功能模块，包括样品分选室、富集室、反应室、检测室等，也被称为微整合分析芯片(micrototal analytical systems)。
微流控芯片在细菌检测上具有巨大潜力，已发展成多学科交叉的新型研究领域。
目前利用传统检测方法设计制作的芯片包括化学芯片和基因芯片。
现就几种芯片的优缺点综述如下。
细菌悬液经负压吸引通过检测孔时，因细菌体积大小、表面性质的不同产生不同的脉冲信号，经放大、分选后累加记录，可将脉冲信号转化为细菌数量和种类等相关信息。
近些年，电阻抗技术也被应用到微流控芯片上。
Mejri等[1]制作的芯片有3个3 mm×3 mm独立检测室，每个检测室包绕有交错的微金电极，联合红外光谱检测大肠埃希菌，检出限(limit of detection，LOD)达到104 CFU/mL。
无锡微流控芯片数字pcr原理
无锡微流控芯片数字pcr原理无锡微流控芯片数字PCR原理随着基因工程和生物学的不断发展，PCR技术已经成为了这一领域中不可或缺的一种技术手段。
而数字PCR作为PCR的新分支，能够更加准确地定量分析复杂的DNA样本。
无锡微流控芯片数字PCR原理旨在利用微流控技术和数字PCR技术相结合，对生物样品进行快速精确的分析和检测。
1. 微流控技术微流控技术是一种利用微细管道和微小组件实现液体精确控制，进行微分析和微处理的技术。
该技术可以将复杂的分析流程缩小到微小的尺度，实现高通量、高灵敏度、高精度和小样本分析。
2. 数字PCR技术数字PCR技术是一种基于单分子PCR反应的新型PCR技术，能够更准确地定量分析复杂的DNA样本。
数字PCR技术不仅能够避免PCR 反应的扩增性失真，还能够提高检测的灵敏度和特异性。
3. 无锡微流控芯片数字PCR原理基于微流控芯片技术，将数字PCR技术应用到芯片上，可以实现对生物样品的快速精确分析和检测。
具体原理如下：（1）样品进样：生物样品通过微流道进入芯片，由于微流道的尺寸非常小，所以可以避免样品的浪费和排放。
（2）单分子分析：样品在微流道内进行单分子PCR反应，每一条DNA分子被隔离并进行PCR扩增，数字PCR可以精确地测量每一个PCR产物的数量。
（3）信号检测：数字PCR反应产生的信号通过光学检测系统进行检测，并转化为数字信号，从而实现对生物样品的快速、准确定量分析。
（4）数据分析：对数字信号进行数据采集、处理和分析，能够得到样品中每一个DNA分子的绝对数量。
总之，无锡微流控芯片数字PCR技术是一种高通量、高灵敏度、高精度并且小样本分析的技术手段，将微流控技术和数字PCR技术相结合，为生物样品的快速、准确定量分析提供了一条新的途径。
达微基因数字pcr
达微基因数字pcr英文回答：Digital PCR (dPCR) is a powerful molecular biology technique used to quantify and analyze nucleic acids in a precise and sensitive manner. It is a variation of the traditional PCR method, but instead of amplifying thetarget DNA or RNA in a single reaction tube, dPCRpartitions the sample into thousands of individual reactions. Each reaction contains a single molecule or a few molecules of the target nucleic acid, allowing for absolute quantification and detection of rare or low-abundance targets.The main advantage of dPCR over traditional PCR is its ability to provide absolute quantification. Traditional PCR measures the relative abundance of the target nucleic acid by comparing it to a standard curve or reference sample. In contrast, dPCR directly counts the number of target molecules present in the sample, providing an accurate andprecise measurement of the target concentration.To perform dPCR, the sample is first partitioned into a large number of individual reactions, either bymicrofluidic chips or by emulsion droplets. Each reaction contains a template DNA or RNA molecule, along with the necessary PCR reagents. The reactions are then subjected to thermal cycling, which amplifies the target nucleic acid in each reaction independently.After amplification, the reactions are analyzed to determine the presence or absence of the target molecule. This can be done by detecting fluorescence signals from labeled probes or by analyzing the endpoint fluorescence intensity. The number of positive reactions is then used to calculate the absolute concentration of the target molecule in the original sample.dPCR has several applications in research, clinical diagnostics, and biotechnology. It can be used for precise quantification of viral load, detection of rare mutations or genetic variants, copy number variation analysis, andgene expression profiling. It is particularly useful for samples with low target abundance or when accurate quantification is required.In conclusion, dPCR is a powerful and versatile technique for nucleic acid quantification. Its ability to provide absolute quantification and detect rare targets makes it a valuable tool in various fields of biology and medicine.中文回答：数字PCR（dPCR）是一种用于精确和敏感地定量和分析核酸的强大分子生物学技术。
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该数字ＰＣＲ芯片可实现ＤＮＡ单分子反应和核酸绝对定量，具有成本低、灵敏度高、节省时间和试剂以及操
作简单等优点，为数字ＰＣＲ方法在普通实验室的应用提供了一种新途径，可用于癌症及感染性疾病的早期 诊断、单细胞分析、产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究． 关键词数字聚合酶链式反应；微流控芯片；单分子扩增；核酸定量；绝对定量 中图分类号０６５７ 文献标志码Ａ
微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）． １．２数字ＰＣＲ微流控芯片的设计与制作
采用多层软光刻技术制作芯片模具．首先用Ｃｏｒｅｌ ＤＲＡＷ软件设计芯片通道图样，然后用高分辨 率打印机打印到透明胶片上成为掩膜，芯片图样见图１（Ａ）．微流控芯片包括２层ＰＤＭＳ和作为底层 的盖玻片，构成流动层和控制层．流动层模具制作：首先在经六甲基二硅氮烷（ＨＤＭＳ）预处理的干净 硅片上旋转涂覆ＡＺＡ６２０正性光胶，于１１０℃烘烤２０ ｍｉｎ固定，然后覆盖上微通道图样的掩膜，在曝 光机下曝光，显影后再次于２００℃烘烤６０ ｍｉｎ固定，制得的微通道高度约为１２ Ｉｘｍ．将ＳＵ８－２０７５负性 光胶旋转涂覆到制得的微通道模具上，烘烤固定后覆盖微反应室图样的掩膜，并将微反应室和微通道 校准，使其列为一条直线，曝光显影后烘烤固定，制得的微反应室高度约为１５０斗ｍ．控制层模具采用 ＳＵ８－２０７５负性光胶以同上方法制作，制得的控制通道高度约为２５
摘要构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应（数字ＰＣＲ）微流控 芯片．应用多层软光刻技术，以聚二甲基硅氧烷（ＰＤＭＳ）作为芯片材料，盖玻片作为基底制作了具有３层结 构以及微阀控制功能的微流控芯片．芯片的大小与载玻片相当，可同时检测４个样品，每个样品通入芯片后 平均分配到６４０个反应小室，每个小室的体积为６ ｎＬ．以从肺癌细胞Ａ５４９中提取的１８ｓＲＮＡ为样品检测了 该芯片的可行性．将样品稀释数倍后通入芯片，核酸分子随机分布在６４０个小室中并扩增．核酸分子在芯片 中的分布符合泊松分布原理，当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于ｏ．５个／小室时，则每个反应小室包含 ０个或１个分子．经过ＰＣＲ扩增后，有模板分子的小室检测结果为阳性反应，而无模板分子的小室为阴性反 应，最后通过计数阳性反应室的个数，可绝对定量原始待测样品中的目标ＤＮＡ分子拷贝数．实验结果表明，
２结果与讨论
２．１数字ＰＣＲ微流控芯片
制得的微流控芯片（图２）大小与载玻片相等，厚约４ ｍｍ，４个独立的反应区可同时进行４个独立 反应．每个反应区的进样口和出样口以及控制层的
进水口和出水口均设计在芯片的两端，可用细导管
相连．芯片采用ＰＤＭＳ和玻璃材料，透光性良好． 每个微反应室的体积为６ ｎＬ，每个反应区有６４０个 微反应室，可容纳约４斗Ｌ的反应液．反应区中微反
的１８ ｓＲＮＡ作为模板，在该芯片上实现了数字ＰＣＲ反应，并对样品进行了精确的定量检测，为该芯片
在生命科学领域的广泛应用奠定基础．
１
实验部分
ＡｘｙＰｒｅｐＴＭ Ｍｕｈｉｓｏｕｒｃｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
１．１试剂与仪器 Ｋｉｔ（美国Ａｘｙｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司）；ＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（日本
Ｖ０１．３４ ２０１３年３月
高等学校化学学报
ＣＨＥＭＩＣＡＬ
Ｎｏ．３
５４５～５５０
ＪＯＵＲＮＡＬ
ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ
ｄｏｉ：１０．７５０３／ｃｊｃｕ２０１２０９０２
一种可绝对定量核酸的数字ＰＣＲ微流控芯片
朱强远，杨文秀，高一博，于丙文，邱琳，周 超，金伟，金钦汉，牟
颖
（浙江大学工业控制技术国家重点实验室，智能系统与控制研究所， 分析仪器研究中心，杭州３１００５８）
１５０斗ｍ．Ｔｈｅ
ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｉｓ ｃｕｂｏｉｄ ｗｉｔｈ
ａ
ｈｅｉｇｈｔ
ｓｑｕａｒｅ ｓｉｄｅ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｉｓ ２００ Ｉ．ｕｍ．
万方数据
Ｎｏ．３
朱强远等：一种可绝对定量核酸的数字ＰＣＲ微流控芯片
结构尺寸见图１（Ｂ）． １．３数字ＰＣＲ芯片进样 将２ｘ１０６个３．５４９细胞制成悬浮液，用ＡｘｙＰｒｅｐｌＭ
２ ｘＴａｑＭａｎ＠Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），１斗Ｌ
ＩＬＬ
Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，１８ｓＲＮＡ），６
ＲＮａｓｅ—ｆｒｅｅ水，１斗Ｌ连续稀
释的模板（ｃＤＮＡ）和２灿缓冲液［８１［０．２５斗ｇ／此牛血清蛋白（ＢＳＡ）＋０．００１％（质量分数）Ｇｅｌａｔｉｎ＋ ０．０２５％（质量分数）ＴｒｉｔｏｎＸ一１００］，总体积为２０汕．阴性对照组以无ＲＮａｓｅ水代替ｃＤＮＡ模板．
ＴａＫａＲａ公司）；Ａ５４９肺癌细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）；ＳＵ８－２０７５负性光胶
（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．），ＰＤＭＳ（美国Ｄｏｗ Ｃｏｍｉｎｇ公司）．ＭＧＬ９６Ｇ型ＰＣＲ仪（杭州朗基科学仪器有限公 司）；Ｍａｅｓｔｒｏ
Ｅｘ ＩＮ—ＶＩＶＯ ＩＭＡＧＩＮＧ
ＳＹＳＴＥＭ荧光成像仪（美国ＣＲＩ Ｍａｅｓｔｒｏ公司）；ＩＸ７１型荧光倒置显
Ｆｉｇ．１
Ｍａｓｋ
ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ
ｃｈｉｐ（Ａ）ａｎｄ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｏｌｄ（Ｂ）
ｄｒａｗｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ ａｎｄ
ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｈａｎｎｅｌ
Ｔｈｅ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ａｘｉｓ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ ｕｍ ａｎｄ
收稿日期：２０１２－０９－２９． 基金项目：国家自然科学基金（批准号：３１０７０７７２，３１２７０９０７）和教育部博士学科点基金（批准号：２００９０１０１１１０１３６）资助． 联系人简介：牟颖，女，博士，教授，博士生导师，主要从事生命科学新技术、新仪器研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｎ．ｙｉｎｇ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
将配好的ＰＣＲ反应液用注射器通过连接芯片的聚乙烯管注入微流控芯片的反应通道中，反应通 道注满后，向芯片控制通道中注入二次蒸馏水．将控制通道出水孔端的聚乙烯管封闭，在注射泵的作 用下，利用水压和ＰＤＭＳ薄膜的弹性在控制通道和反应通道间形成具有微阀功能的凸起，将反应通道 中的所有微反应室分别封闭，形成有独立空间的平行ＰＣＲ反应室．最后，封闭进样孔和出样孔，将控 制通道的进水孔连接注射泵，通过注射泵保持控制通道水压的稳定．
Ｉ．ｚｍ．
按ＰＤＭＳ单体（Ａ）：ＰＤＭＳ固化剂（Ｂ）质量比为３０：１制备ＰＤＭＳ预聚合物，抽真空除去空气后，旋 转涂覆到控制层模具上，其厚度为４０ Ｉｘｍ，然后置于８０ ｃ｜Ｃ热板上使其凝固．配制Ａ：Ｂ质量比为５：１的
ＰＤＭＳ预聚合物，慢陧倾倒在流动层模具上，厚度为４ ｍｍ，于８０℃烘烤４０ ｍｉｎ，将ＰＤＭＳ层从模具上
ａ ａ
ｈｅｉｇｈｔ ｏｆ ２５／，ｚｍ ａｎｄ ｗｉｄｔｈ ｏｆ １５０ ｕｍ．Ｖｅｒｔｉｃａｌ ａｘｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｌａｙｅｒ ｃｏｍｐｏｓｅｄ
ａ
ｏｆ ｔｈｅ ｏｆ １５０
ａｎｄ ｍｏｃｌ＇ｏｗｅＵｓ．Ｔｈｅ
ｃｈａｎｎｅｌ ｉｓ ｗｉｔｈ
ｈｅｉｇｈｔ ｏｆ １２斗ｍ ａｎｄ ｗｉｄｔｈ ｏｆ
１．４数字ＰＣＲ反应和终点检测
数字ＰＣＲ反应程序：５０℃预热２
进行４０个循环．
ｍｉｎ，９５
ｏＣ预变性１０
ｍｉｎ，９５
ｏＣ变性１０
Ｓ，６０
ｏＣ退火延伸６０
Ｓ，
反应结束后，用荧光成像仪或荧光倒置显微镜分别检测反应结果，成像结果通过ＣＣＤ图像传感器 在计算机上保存，用图像处理软件分析，计数阳性反应小室的数目，从而得到初始模板的分子数目．
Ｍｕｈｉｓｏｕｒｃｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔ提取总ＲＮＡ．
提取的ＲＮＡ用分光光度仪和凝胶电泳分析其质量，然后逆转录合成ｃＤＮＡ分子．将合成的ｃＤＮＡ溶液
用ＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ以连续倍数稀释成梯度浓度的溶液，作为数字ＰＣＲ反应的模板．
数字ＰＣＲ反应体系含１０恤Ｌ
２０ｘＴａｑＭａｎ＠Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
万方数据
高等学校化学学报
心式磁盘一Ｊ、滑动式芯片Ｍ１和集成流路芯片一。等，其中集成流路（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｆｌｕｉｄｉｃ
ｃｉｒｃｕｉｔ，ＩＦＣ）芯片技
术和微液滴芯片技术等已经实现商品化．但这些技术存在芯片制作复杂、操作繁琐且需要特殊的流体 控制系统等缺点，使其商品化的产品成本过高，仪器庞大繁冗且操作复杂，不利于产品的普及．因此， 迫切需要发展新型、简单、便携式的数字ＰＣＲ芯片． 本文采用Ｑｕａｋｅ等。列开发的ＩＦＣ芯片中的微阀技术，以普通盖玻片为基底，用聚二甲基硅氧烷 （ＰＤＭＳ）材料制作了一种可进行数字ＰＣＲ反应的微流控芯片，该芯片操作简便、价格低廉，并兼具微 阵列芯片高通量的特性，具有省时、省力、省试剂的优点，应用领域广泛．以从肺癌细胞Ａ５４９中提取
核酸扩增和定量一直是分子生物学领域的核心技术之一，已应用到分子测序、基因表达分析、基 因突变研究、疾病早期分子诊断、单核苷酸多态性和药物筛选等研究领域，并起到重要作用．尤其是 在癌症以及病原传染病等疾病的早期分子诊断研究中，以核酸扩增为基础的核酸定量检测技术，因其 分析速度快、灵敏度高、高通量及诊断时间短的显著优点，成为疾病早期诊断的主要应用技术之一， 具有广阔的发展空间．目前，应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术是实时荧光定量聚合酶链式反应 （ＰＣＲ），其准确度可达９５％，检测时将未知的目标核酸分子和已知标准样品同时进行扩增，根据加入 的荧光分子探针信号实时观察模板的扩增情况，检测结果以线性的扩增信号形式输出，根据已知标准 样品的扩增曲线来推算未知样品的起始模板拷贝量．因此，荧光定量ＰＣＲ技术是一种相对的核酸定量 方法，其灵敏度和准确度均受到限制．上世纪９０年代，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ等…提出了一种新的核酸定量方法 ——数字聚合酶链式反应（数字ＰＣＲ）技术，解决了这一技术难题．数字ＰＣＲ技术的原理是根据泊松分 布公式将起始待测模板细分为很多小份，使每１份中至多分配到１个核酸分子，在每个小份中进行单 个拷贝核酸分子ＰＣＲ扩增反应，最后计数有扩增反应的小份的数量即可确定目标模板的拷贝数．这种 核酸定量方法实现了对单个ＤＮＡ分子的扩增反应和检测，对于每个模板ＤＮＡ分子的反应结果，以阳 性为“１”、阴性为“０”直接计数，以计数结果计算出模板ＤＮＡ分子的拷贝数，因此数字ＰＣＲ技术是一 种对待测核酸分子进行绝对定量的方法旧ｏ，其灵敏度非常高，且只需要很少的模板量，尤其适用于痕 量、不易得到的待测样品。因此，数字ＰＣＲ技术非常适合用于疾病的早期诊断． 以微电子技术为基础的微流控芯片加工技术的发展为数字ＰＣＲ技术提供了合适的平台，微流控 芯片的微型化、集成化、迅速高效、所需试剂和样品量少以及适于现场检测等优点使数字ＰＣＲ技术具 有更大的发展空间．迄今，已有报道的数字ＰＣＲ平台有微反应室阵列芯片旧Ｊ、微液滴和微乳滴［４］、离