流感病毒神经氨酸酶的表达及其在药物筛选中的应用
流感病毒神经氨酸酶抑制剂的合理设计与筛选
流感病毒神经氨酸酶抑制剂的合理设计与筛选摘要流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的上呼吸道疾病，每年影响数百万人的健康，造成比较严重的经济和社会问题。
但是到目前为止，人类对流感病毒一直缺乏安全有效的控制手段，这使得抗流感病毒药物研究成为当前药学研究的一个热点。
随着病毒学研究的进展，对流感病毒复制和感染过程的机理研究取得了重大的突破，在此基础上提出了一些可作为抗流感药物研究的靶标，比如：血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白MZ以及核酸内切酶等。
本文以其中的一种靶标化合物即神经氨酸酶为研究对象，对其抑制剂做出合理的设计及筛选，为研究与合衬抗流感病毒的药物提供一个较为合理的方向。
关键词：流感；流感病毒；神经氨酸酶；定量构效关系1、立项依据1.1、流感的危害以及防治现状流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的呼吸道传染病，具有传染性强、流行面广、发病率高等特点，在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。
流感感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的心、肾等多种脏器衰竭并能导致死亡。
流感可以通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，人员和车辆往来是传播本病的重要因素。
有数据表明，每次流感爆发期会使全球人口的近10%感染致病。
仅在20世纪，流感的大流行就有三次，每次均使25%~35%的人感染致病，死亡率超过2%。
迄今为止，世界上已发生过五次流感的大流行和若干次小流行，造成数十亿人发病，数千万人死亡，严重影响了人们的生活和社会经济的发展。
而预防和治疗流感给人们造成了沉重的经济负担，并导致劳动力的下降和人力资源的紧张。
然而面对己对人类健康、社会经济造成严重破坏的流行性感冒，人类却一直缺乏有效的手段。
1.2、有神经氨酸酶抑制剂预防与治疗流感的现状NA抑制剂是目前探索抗流感化学治疗药物研究中取得的突破性进展。
它可以有效地阻断流感病毒的复制过程。
与其它类型的抗流感病毒药物相比，NA抑制剂具有更高的疗效及更好的安全性和耐受性，并对所有的流感病毒亚型均有效，也很少出现病毒的抗药性。
耐药性甲型流感病毒H3N2神经氨酸酶免疫原性的研究
耐药性甲型流感病毒H3N2神经氨酸酶免疫原性的研究摘要：为了确定耐药性甲型流感病毒h3n2神经氨酸酶的抗原性质较野生型甲型流感病毒是否发生改变，利用原核表达方法在大肠杆菌中大量表达并纯化野生型甲型流感病毒h3n2的红细胞凝集素（ha）和神经氨酸酶（na）；取ha和na免疫后的小鼠血清分别对野生型和突变型甲型流感病毒h3n2进行western blotting、elisa 以及中和抗体检测。
结果表明，野生型甲型流感病毒以及第119位氨基酸单点突变型甲型流感病毒对ha和na免疫后的小鼠血清都有很好的免疫反应性，而第222位氨基酸单点突变和双点耐药突变型甲型流感病毒对免疫血清的免疫反应性要低很多。
该研究首次确定了甲型流感病毒h3n2的野毒株与耐药突变株的神经氨酸酶的抗原性质存在很大的差异，进一步表明耐药突变株病毒除了具有抗药物活性之外也具有逃逸机体所产生的抗体攻击的能力，可为将来新一代甲型流感病毒h3n2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供重要参考。
关键词：甲型流感病毒h3n2；耐药性；神经氨酸酶；点突变；免疫原性中图分类号：r392.7 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）03-0613-05病毒通常会采用不同的策略来逃逸机体的免疫攻击，因此研究病毒逃逸机制以及设计合理的方法来抑制病毒的逃逸，是目前疫苗研究的主要手段。
其中病毒一个重要的逃逸机制就是遗传突变，改变其自身表面主要抗原的空间表位，从而使机体免疫系统不再识别并产生作用，达到躲避机体免疫的目的[1-5]，使得免疫系统和疫苗无效，病毒得以大量繁殖。
甲型流感病毒h3n2表面有两个主要的糖蛋白：红细胞凝集素（hemagglutinin，ha）和神经氨酸酶（neuraminidase，na）。
这两个蛋白编码基因都具有不同程度突变功能，通过引入新的突变，形成新的亚型病毒株来躲避机体免疫系统。
ha通过结合细胞膜上的唾液酸受体从而介导病毒内吞进入细胞[6]。
新型抗病毒药物的筛选与评价
新型抗病毒药物的筛选与评价在当今全球健康面临诸多挑战的时代，病毒感染引发的疾病持续威胁着人类的生命与健康。
从常见的流感病毒到严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型（SARSCoV-2），病毒的不断变异和传播给医疗领域带来了巨大的压力。
因此，新型抗病毒药物的研发至关重要，而其中的筛选与评价环节则是确保药物有效性和安全性的关键步骤。
新型抗病毒药物的筛选，犹如在茫茫大海中寻找珍贵的珍珠，需要精准的策略和方法。
首先，科研人员通常会从大量的化合物库中进行初步筛选。
这些化合物库可能包含天然产物、合成化合物以及已有的药物类似物等。
通过高通量筛选技术，可以在短时间内对成千上万种化合物进行测试，以发现那些可能具有抗病毒活性的“苗子”。
除了化合物库，基于靶点的筛选也是一种重要的策略。
了解病毒复制和感染过程中的关键靶点，如病毒的蛋白酶、聚合酶、受体等，然后针对这些靶点设计特异性的抑制剂或拮抗剂。
例如，针对流感病毒的神经氨酸酶，已经成功开发出了一系列有效的抗病毒药物。
在筛选过程中，细胞模型和动物模型的应用不可或缺。
细胞模型可以模拟病毒在细胞内的感染和复制过程，便于观察药物对病毒的抑制效果。
而动物模型则更能反映药物在体内的代谢、分布和药效，为后续的临床试验提供重要参考。
当初步筛选出有潜力的化合物后，接下来就是全面而细致的评价阶段。
药物的药效学评价是重中之重，这包括确定药物的抗病毒活性、有效浓度范围、作用时间等。
例如，通过测定药物处理后病毒的滴度变化、病毒基因的表达水平，以及感染细胞的病变程度等指标，来评估药物的抗病毒效果。
同时，药物的药代动力学特性也需要深入研究。
药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程直接影响其疗效和安全性。
了解药物的血浆蛋白结合率、组织分布情况、代谢途径以及半衰期等参数，有助于优化给药方案，提高药物的治疗效果。
安全性评价同样不容忽视。
药物可能会引起各种不良反应，如肝肾功能损害、免疫系统异常、心血管毒性等。
通过细胞毒性试验、动物急性和慢性毒性试验等方法，对药物的安全性进行全面评估，以确保在治疗疾病的同时不会对患者造成严重的损害。
流感治疗中奥司他韦的最新临床研究
流感治疗中奥司他韦的最新临床研究流感是一种极为常见的呼吸道疾病，由流感病毒引起。
每年流感都会导致大量人群感染，给社会带来重大负担。
在对抗流感病毒的治疗中，药物奥司他韦近年来在临床研究中取得了令人鼓舞的进展。
首先，奥司他韦是一种神经氨酸酶抑制剂类药物，在阻断病毒复制过程中发挥着重要作用。
一项最新的临床研究表明，奥司他韦可有效抑制多种流感病毒株的生长，包括目前广泛传播的甲型H1N1流感病毒。
这一发现为奥司他韦在流感治疗中的应用提供了坚实的科学依据。
其次，研究人员还发现，奥司他韦对于高危人群的治疗效果尤为显著。
高龄人群、免疫系统受损者和患有慢性疾病的患者往往更容易受到流感的侵袭，症状也更加严重。
然而，通过临床试验的数据分析显示，奥司他韦对于这些高危人群的治疗效果不亚于其他治疗方式，甚至在某些方面表现更为显著。
这意味着奥司他韦有可能成为治疗高危人群流感的首选药物。
另外，奥司他韦具有出色的抗病毒作用和较低的耐药性。
研究人员发现，在奥司他韦治疗后的一段时间内，流感病毒的复制速度明显减慢，病毒株的数量也大幅减少。
而与其他抗病毒药物相比，奥司他韦抗病毒效果的持久性更佳，病毒对其的耐药性较低。
这一特点使得奥司他韦成为流感治疗中的热门选择。
值得一提的是，奥司他韦在临床应用中的安全性也受到了广泛关注。
研究结果显示，奥司他韦在正常剂量下的治疗无明显不良反应，耐受性良好。
然而，对于儿童、孕妇和一些存在特殊情况的患者，如肝肾功能损害者等，还需要更加严格的监测和使用指导。
总体而言，奥司他韦在流感治疗领域的最新临床研究表明，它是一种安全有效的药物。
在抑制流感病毒复制、减轻临床症状以及缩短疾病持续时间方面，奥司他韦展现出了巨大的潜力。
然而，需要进一步开展更大规模的临床试验，以验证奥司他韦在流感治疗中的疗效，同时深入研究其对不同人群的作用机理和安全性。
相信未来，奥司他韦会在流感治疗中发挥更加重要的作用，降低流感给社会和个体带来的负担，并为全人类的健康作出贡献。
神经氨酸酶抑制剂抗流感病毒的研究进展_陈宝龙_邓旭_曾光尧_郭虹_周应军
陈宝龙，邓旭，曾光尧，郭虹，周应军* （ 中南大学药学院，长沙 410013）
摘要： 神经氨酸酶（ NA） 是流感病毒表面一种蘑菇云状四聚体结构的包膜糖蛋白，其抑制剂对高致病性流感病毒的各亚型 均具有抑制作用，且其安全性和耐药性良好，可用于流感病毒的预防和治疗。笔者在归纳总结近年来该领域国内外文献的基 础之上，对神经氨酸酶及其抑制剂的分类、构效关系以及国内外研究现状进行总结，有助于我们更好地利用现有条件设计并 合成出活性更好、选择性更高的抗流感药物。 关键词： 流感病毒； 神经氨酸酶抑制剂； 分类； 构效关系 doi： 10. 11669 / cpj. 2015. 01. 002 中图分类号： Ｒ965 文献标志码： A 文章编号： 1001 － 2494（ 2015） 01 － 0007 － 08
2 神经氨酸酶抑制剂 2. 1 唾液酸类神经氨酸酶抑制剂
目前，随着新型流感病毒的潜在威胁和流感病毒耐药株 的不断出现，使抗流感药物的效果不尽如人意，因此，研发口
·8· Chin Pharm J，2015 January，Vol. 50 No. 1
服生物利用度高、耐药性好的抗流感药物迫在眉睫。天然存 在的唾液酸本身就是一种弱的神经氨酸酶抑制剂，早期神经 氨酸酶抑制剂的研究主要是模拟唾液酸苷酶催化反应过渡 态中对底物水解唾液酸类似物的筛选。而通过对唾液酸类 似物的结构修饰有望得到高效、低毒、低耐药的抗流感药物， 故通过对其构效关系进行总结，以期促进新型抗流感药物的 研发（ 图 3） 。 2. 1. 1 C-2 位的修饰 C-2 位的羧基与神经氨酸酶的 S1 区 域（ 正电荷区域） 形成盐桥，是必需的活性基团，但羧基的存 在也使得分子极性增大，降低了其口服的生物利用度。长链 烷氧烷基酯引入扎那米韦的 C-2 位（ 7） 不仅提高了其口服生 物利用度，而且降 低 了 毒 性。最 近 两 个 课 题 组［6-7］ 先 后 报 道 了一种基于共价结合新机制的神经氨酸酶抑制剂化合物 8， 其晶体结构研究表明它的 C2 位与神经氨酸酶中重要的 Tyr406 残基羟基形成共价键结合，故对 A、B 型流感和耐药菌株 均具有较好的抑制作用。动物实验数据亦表明，其抗流感活 性可以与扎那米韦相媲美。在另一项研究中，氟苯取代 C2 的化合物 9 具有可以与扎那米韦相媲美的活性［8］。化合物 10 是扎那米韦的膦酸酯衍生物，它对包括 H274Y 突变体的 5 种神经氨酸 酶 抑 制 剂 均 显 示 出 比 扎 那 米 韦、奥 司 他 韦 高 出 3 ～ 6倍的纳摩尔级抑制活性［9］。 2. 1. 2 C-3 位的修饰 在未发表第一类神经氨酸酶亚型的 晶体结构之前，唾液酸的 C-3 位一直被认为是没有修饰改造 价值的。但是 150-空腔发现后，研究人员为了使抑制剂与新 发现的 150-空腔匹配，对唾液酸衍生物进行了一系列的修饰 改造。如 Bhatt 等［10］设计了一系列 C3 位取代的化合物，其 中化合物 11 采用了二氢吡喃环的构象，其活性增强了约 32 倍； 然而当使用甲氧基、O-乙酰基取代 C-3 位时，化合物的活 性又明显降低，这就说明 C3 位，也就是 S2 活性位点不适合 与较大的疏水性基团发生相互作用。随后，Ｒudrawar 等［11］ 合成了一系列的 C3 位取代的化合物，其中 C3 位未被取代的 化合物 12 对 N1 和 N2 型神经氨酸酶的抑制作用无选择性，
抗病毒药物的研发与应用
抗病毒药物的研发与应用引言随着全球传染性疾病的不断爆发，抗病毒药物的研发和应用变得尤为重要。
在抑制病毒复制、控制感染传播以及提高患者康复率方面，抗病毒药物起到了至关重要的作用。
本文将介绍抗病毒药物的研发过程以及其在各种传染性疾病中的应用。
一、抗病毒药物的分类1. 直接击败病毒：核苷类似物类药物核苷类似物是一类直接阻断病毒复制过程中逆转录酶活性的药物。
它们通过模拟自然核苷酸而具有竞争性地与逆转录酶结合，从而阻击了逆转录酶对自然基因组RNA拷贝成DNA的活动。
这类药物包括了广谱抗HIV-1活性较高的嘌呤核苷反转录酶抑制剂拉米夫定等。
2. 阻断受体和涵奥反应：利用香豆素衍生物香豆素衍生物是一类新型抗病毒药物，主要通过阻断宿主细胞蛋白的进一步合成或受体活性来抑制病毒复制。
这些药物能够干扰涵奥反应的进行，从而减缓病毒在感染过程中的复制效率。
3. 增强机体免疫力：免疫调节剂为了提高机体抵抗病毒的能力，科学家还开发了免疫调节剂。
这类药物通过增强机体免疫系统对病毒的识别和清除能力来防治传染性疾病。
目前广泛使用的干扰素就是一种有效的免疫调节剂。
二、抗病毒药物的三个关键阶段1. 药物筛选和发现药物筛选是一个耗时且费力的过程，但却至关重要。
科学家们需要通过大量实验样本筛选出可能具有抑制特定病毒活性的化合物。
随着技术进步，高通量筛选方法被广泛应用于加速药物发现进程。
2. 药物研究和开发一旦发现了具有潜在抗病毒活性的化合物，科学家们需要进行临床研究和开发。
这个阶段涉及到药物分子修饰、药代动力学和药效学的评估，以确定其安全性和有效性。
3. 临床试验与上市经过多年的研究、开发和测试，候选药物最终会进入临床试验阶段。
分为不同的阶段（如I期、II期和III期）依次测试安全性、有效性以及剂量等方面。
成功通过所有临床试验并获得批准后，药物才能上市销售。
三、常见传染性疾病抗病毒药物应用案例1. HIV/AIDS治疗目前，针对人类免疫缺陷病毒（HIV）感染造成的艾滋病已经有了较好的治疗方法。
抗流感病毒的主要药物有哪些？其作用机制是什么？使用的原则是什么？
抗流感病毒的主要药物有哪些？其作用机制是什么？
使用的原则是什么？
(1)神经氨酸酶抑制剂。
作用机制是阻止病毒由被感染细胞释放和入侵邻近细胞，减少病毒在体内的复制，对甲、乙型流感均具活性。
在中国上市的有两个品种，即奥司他韦和扎那米韦。
大量临床研究显示，神经氨酸酶抑制剂治疗能有效缓解流感患者的症状，缩短病程和住院时间，减少并发症，节省医疗费用，并有可能降低某些人群的病死率，特别是在发病48小时内早期使用效果尤其明显。
(2)M2离子通道阻滞剂。
作用机制是阻断流感病毒M2蛋白的离子通道，从而抑制病毒复制，但仅对甲型流感病毒有抑制作用。
包括金刚烷胺和金刚乙胺两个品种。
神经系统不良反应有神经质、焦虑、注意力不集中和轻度头痛等，多见于金刚烷胺；胃肠道反应有恶心、呕吐，大多比较轻微,停药后可迅速消失。
此两种药物易发生耐药。
抗流感病毒药物的使用原则是：坚持预防隔离与药物治疗并重、对因治疗与对症治疗并重。
应在发病36小时或48小时内尽早开始抗流感病毒药物治疗。
虽然有资料表明发病48小时后使用神经氨酸酶抑制剂亦有效，但是大多数研究对早期治疗疗效更为肯定。
【2017年整理】神经氨酸酶抑制实验、动物接种及组织中病毒的定量
神经氨酸酶抑制实验、动物接种及组织中病毒的定量樊玉磊•一、神经氨酸酶抑制试验（NI test）实验原理：NA与胎球蛋白作用可释放出唾液酸，亚砷酸钠溶液可以终止唾液酸酶的活性，硫代巴比妥酸溶液与游离的唾液酸以一定比例结合可以产生粉红色。
实验步骤：1. 依次在1-9的试管中加入10倍稀释的N1～N9亚型的血清25μl，第10管加入25μl ND血清做对照。
（做两排）2. 把尿囊液用PBS做10×，100×稀释，分别加入2排试管中，每管加入25μl。
3. 用Para 膜封盖管口，37˚C作用一小时。
4. 然后加入Fetuin溶液（冰冻化开的）50μl，37˚C作用2小时或过夜。
（最好过夜）5.再加入过碘酸钠溶液50μl，振荡，室温下静置20分钟。
6.加入亚砷酸盐溶液500μl，并振荡至颜色消失。
7.再加入硫代巴比妥酸溶液（TBA）1.25ml，并振荡。
8.沸水中煮15分钟，观察结果。
9.判定：粉红色表明抗血清无抑制作用；无色者表明血清有抑制作用，由此判定亚型。
溶液配制：1. PB, pH 5.9A.0.4 M 磷酸二氢钠（NaH2PO4）: 称27.6 g NaH2PO4溶于500 ml去离子水中。
B.0.4M 磷酸氢二钠（Na2HPO4）: 称28.4 g Na2HPO4溶于500 ml去离子水中。
取81 ml溶液A，19 ml溶液B混匀配成0.4 M buffer，pH 5.9。
室温保存。
2. 胎球蛋白（Fetuin）：胎球蛋白0.5g，PB，pH 5.9 20 ml，去离子水20 ml；分装成5ml，-20˚C保存。
3. 过碘酸盐溶液: 过碘酸钠4.28 g，去离子水38 ml，加热溶解，室温冷却后62ml 85％正磷酸混匀, 室温避光保存。
4. 亚砷酸盐溶液：亚砷酸钠10.0 g，无水硫酸钠7.1 g，去离子水100 ml，加热溶解，室温冷却后加0.3 ml浓硫酸，室温保存。
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2009, 29 (5)
杨令芝 等 : 流感病毒神经氨酸酶的表达及其在药物筛选中的应用
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( Invitrogen ) ; CCK28 ( Dojindo, Japan ) ; 黑 色 96 孔 板 ( greiner cellstar) 。 1. 2 仪 器 超级酶标仪 ( Synergy HT, blo2tek, USA ) 1. 3 方 法 1. 3. 1 H5N1流感病毒神经氨酸酶的克隆与表达 重 组质粒的构建 :将 A /V iet Nam /1194 /2004 ( H5N1)毒株 神经氨酸酶的基因序列经过密码子优化 , 使其适合哺 乳动物细胞内高水平表达 [11 ] 。一种保持其原有氨基酸 序列不变 (奥司他韦敏感型 ) ,一种将 274 位的组氨酸 突变为酪氨酸 (奥司他韦耐药型 ) ,基因序列由人工合 成 ( TaKaRa) ,分别命名为 NA s和 NA r,通过 B am H I和 X ba l I酶切 ,酶切产物连接到用相同酶切的 pcDNA4 / TO 质粒中 ,连接产物转化到 TOP10 感受态细胞后 ,涂 布 Amp icillin抗性平板培养 14 ～18 小时 ,挑取单个菌 落 ,经过菌落 PCR 鉴定并抽取质粒酶切鉴定后 ,对克隆 的神经氨酸酶基因进行测序 ( TaKaRa) 。重组质粒鉴定 正确后进行表达鉴定并在 T2REx293 细胞中建立稳定 细胞株 。 稳 定 细 胞 株 的 建 立 : 采 用 lipofectam ine 2000 ( Invitrogen ) 将 重 组 质 粒 NA s 和 NA r 及 空 载 体 pcDNA4 / TO 分别转染到 T2REx293 细胞 , 48 h 后将细 胞按 1 ∶12 传代并加入 200 μg /m l Zeocin 进行克隆筛 选 。每 3天换液 ,维持相同浓度的 Zeocin,直至单个稳 定细胞克隆形成 ;然后挑取单克隆 ,扩大培养后用四环 素诱导表达并 W estern blotting鉴定 。阳性克隆扩大培 养冻存 ,或继续培养用于药物筛选 。细胞培养基为含 10%胎牛血清 ( Hyclone) , 100 μg /m l青霉素 , 100μg /m l 链霉素的高糖 DM EM 培养基 ( Hyclone) , 在 37℃, 5% CO2 条件下培养 。 神经氨酸酶的表达 : 100 mm 培养皿中接种稳定细 胞株 3 ×106 个细胞 ,经 1μg /m l四环素诱导 24h,用 1m l 上样缓冲液裂解 (不含还原剂 ) ,经 PAGE 电泳分离后 进行蛋白转印 ,转印膜用兔抗流感病毒神经氨酸酶的 多克隆抗体和 HRP标记的羊抗兔 IgG二抗进行免疫印 迹分析 。 1. 3. 2 H5N1流感病毒神经氨酸酶活性的鉴定 神经 氨酸酶活性鉴定 :将 3 ×106 个稳定细胞接种 100mm 培 养皿 , 24 h后加入 1 μg /m l四环素诱导 ,继续培养 24 ～ 36 h,收取细胞用 1m l含 0. 1% Triton2X100的 PBS裂解 细胞 。制备 H1N1流感病毒 (A /W S /33)鸡胚培养的尿 囊培养液 1 m l ( 0. 1% Triton2X100) 。用含 0. 1% Tr2′22 ( 422methylumbelliferyl ) 2α2D 2N 2 acetylneuram inic acid (MUNANA , Sigma) ; 22N 2吗啡林 2 乙磺酸 (MES , Sigma) ;天然产物 (海洋微生物发酵产 物 )及中药提取物由本院黄志伟研究员和陈小平研究 员提供 ;黄芩甙和黄芩素 (西安小草植物科技有限责任 公司 ) ; 兔 抗 流 感 病 毒 神 经 氨 酸 酶 的 多 克 隆 抗 体 ( p rosci) ; A /W S /33 和 A /V ictoria /3 /75病毒株 (本实验 室保存 ) ; T2REx293 cell line ( Invitrogen) ; pcDNA4 / TO 质 粒 ( Invitrogen ) ; TPCK2胰 蛋 白 酶 ( Sigma ) ; Zeocin
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 29 No. 5 2009
经氨酸酶的二聚体形式 (图 1a) 。 2. 2 稳定细胞株表达 H5N1 流感病毒神经氨酸酶的
活性鉴定 在研究中 , 1 个 100mm 培养皿的 NA s或 NA r稳定 细胞 (长满单层 , 约 7 ×106 个细胞 ) 经诱导后配制成 50m l酶液仍具有很好的酶活性 ,其 S /B (信号背景比 ) 分别为 47. 9和 34. 6,因此可用于神经氨酸酶抑制剂化 合物的筛选 。通过神经氨酸酶活性测定方法 ,测得 NA s 和 NA r的荧光强度均值分别为 10947 和 7901, 结合 W estern blot结果 (图 1a) ,利用 Quantity one分析 , NA s 和 NA r的表达量约为 1. 1∶1,表明 NA r可能由于 274位 的组氨酸突变为酪氨酸后 ,其酶活性比 NA s有所降低 。 图 1b 显示 NA s对奥司他韦敏感 , NA r对奥司他韦耐 药 。同时通过奥司他韦抑制实验 ,用 NA s和 NA r稳定 细胞制备 和 全 病 毒 制 备 的 酶 液 测 得 羧 酸 奥 司 他 韦 的 IC50值见表 1。
X100的 PBS将上述两种酶液按 5 倍梯度稀释 ,制备不 同浓度的神经氨酸酶液 ,不表达神经氨酸酶的细胞和 正常鸡胚尿囊液作为阴性对照 。参考 Su 等 [12 ]的神经 氨酸酶活性测定方法 ,取 30 μl酶液 ,加入反应底物 (终 浓 度 33 mmol /L M ES 缓 冲 液 , 4 mmol /L CaCl2 , 20 μmol /L 底物 MUNANA ) ,动力法在 360的激发光和 460 的发射光下测定荧光强度 。选取在 30m in内荧光强度 呈直线上升的稀释度作为药物筛选的酶液浓度 。 奥司他韦抑制活性的测定 : 将羧酸奥司他韦 ( GS 4071即奥司他韦的活性形式 )用水倍比稀释 ,取 10 μl; 加入合适稀释度的酶液 30 μl;加入 60 μl反应底物 ,室 温反应 15 m in, 加 入 终 止 液 150 μl ( 14 mmol /L 的 NaOH 溶液 ,含 83%的乙醇 ) ;混匀后在 360的激发光和 460的发射光下测定荧光强度 。以上反应均在黑色 96 孔板中进行 。 1. 3. 3 天然提取物及中药成分的筛选 用上述奥司 他韦抑制活性的测定方法 ,如果中药成分水溶性不好 , 可用 DMSO 溶解和倍比稀释 , 相应的对照也用 DMSO 稀释 。药物筛选时奥司他韦用作阳性对照 。 1. 3. 4 黄芩素 、黄芩甙抑制流感病毒噬斑实验 配制 含 0. 9%的琼脂 ,将 5. 4 ×1025 pfu每细胞的病毒接种到含 有单层 MDCK细胞的十二孔板中 ,感染 1h后 ,在单层细 胞上覆盖含不同浓度药物营养琼脂培养基 。 72 h 后细胞 用甲醛固定 15m in,结晶紫染色 20m in,观察噬斑。 1. 3. 5 中药成分抑制流感病毒复制的 IC50 按 2 × 104 个细胞 /孔将 MDCK细胞接种 96 孔板 ; 2 ×10 - 3 pfu 每细胞流感病毒 (A /W S /33 和 A /V ictoria /3 /75 ) 感染 液 : 0. 3% BSA , 1 μg /m l的 TPCK2胰蛋白酶 , 100μg /m l 青霉素 , 100 μg /m l链霉素的高糖 DMEM 培养基 ;待细 胞长满单层 ,加入含流感病毒的感染液 , 37℃, 5% CO2 条件下感染 3 h;去掉感染液并用 PBS洗细胞 2 次 ,加 入 100 μl含不同浓度化合物的病毒感染液 , 37℃, 5% CO2 条件下培养 ,观察细胞状态 ,待病毒感染孔 (不加 化合物 )的细胞完全死亡后用 CCK28测定细胞活力 。 1. 3. 6 数 据 分 析 数 据 用 GraphPad Prism Dermo 分析 。
H 5N 1 亚型禽 流 感 病 毒 虽 然 目 前 只 能 通 过 禽 类 传 染给人 ,但这种病毒一旦与人类流感病毒株发生基因 重组 ,就可能跨越种属界限 , 变成人传染人的流感病 毒 ,严重威胁人类的生命健康 [1～3 ] 。因此预防和控制禽 流感疫情的爆发是目前的首要任务 。 流感病毒神经氨酸酶 ( neuram inidase, NA ) 是流感 病毒表面的一种糖蛋白 ,由病毒 RNA 第六节段编码 , 具有糖苷外切酶活性 ,它可以裂解细胞表面流感病毒 受体末端的唾液酸残基 ,使子代病毒颗粒从感染细胞 膜上释放 ,促进流感病毒在呼吸道扩散 ,与病毒的宿主 嗜性及毒力有关 [4, 5 ] ,因此神经氨酸酶是抗流感药物研 发的重要靶标 。目前临床上使用的神经氨酸酶抑制剂 扎那米韦和奥司他韦在流感的预防和治疗中发挥了重 要作用 。但是扎那米韦和奥司他韦在临床上的使用有 一定的局限性 ,如扎那米韦的口服利用度低 ,体内分布 容积小 ,肾脏清除快 ,只能作为局部用药 ; 奥司他韦在 使用过程中 ,临床上出现了大量耐药病毒株 [6, 7 ] 。这使 得设计合成或从化合物库中筛选既对敏感株又对耐药 株有效的新型神经氨酸酶抑制剂成为当前研究的热点
摘要 A 型流感病毒 H5N1 神经氨酸酶奥司他韦敏感型及耐药突变型基因经优化后 ,克隆于 pcDNA4 / TO 表达载体 ,并转染 T2REx293建立稳定细胞株 ,经四环素诱导能特异表达神经氨酸酶 , 其活性被特异性抑制剂奥司他韦所抑制 。利用该稳定细胞株制备的神经氨酸酶 ,对 3000多种天 然产物和中药提取物进行了筛选 ,结果显示黄芩甙和黄芩素对奥司他韦敏感型神经氨酸酶和耐 药型神经氨酸酶具有相似的抑制作用 。该神经氨酸酶制备方法安全 、简便 、稳定 ,有利于建立神 经氨酸酶抑制剂的高通量筛选方法 。 关键词 流感病毒 神经氨酸酶 神经氨酸酶抑制剂 黄芩甙 黄芩素 中图分类号 Q786