酶工程实验指导
《酶工程》课后知识题目解析
《酶工程》课后知识题目解析第一章酶工程基础1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学①酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。
②比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。
③酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。
⑤酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
2.说说酶的研究简史酶的研究简史如下：(1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科医生Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。
(3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
3.说说酶工程的发展概况I.酶工程发展如下：①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod 提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。
“酶工程”_暑期科研实践_实习_报告_总结 2100字 - 总结范文
三一文库（）〔“酶工程”_暑期科研实践_实习_报告_总结 2100字 - 总结范文〕“酶工程”暑期科研实践总结报告生物科学与工程学院生物工程2班黄义林20xx30742333这次暑期科研实践，我和李洋、黄文潘都参加了有张俊辉师兄所负责的酶分子改造的项目，实际参加实验的时间是7月13至29号，以及8月16至19号。
在此之前，我们还参加了有郑穗平老师和林影老师讲授的关于酶的发展、现状以及前景的讲座，以及内容为负责各个项目的师兄对其项目讲解的培训。
参加实践前的讲座和培训都让我对酶的发展概况、研究方向有了更深刻全面的认识。
实验中，张俊辉师兄让我们从实验的开头开始，逐步学习实验过程中各阶段的实验操作，同时对专业知识进行讲解，让我们更好地掌握实验操作的原理。
在实验流程中，我们的操作都没有出现能直接导致实验失败的失误，但实验最后并没有得到想要的产物，原因应该是多方面的，也和我们的实验操作有很大关系。
实验没有得到很好的成果，但在实践过程中，我学习和掌握了一些基本实验操作技能及操作规范，并对实验室内的规章制度有了更多的了解。
下面说一下我在实验中学到的知识和其他心得体会。
首先是酶分子改造实验的思想：获得待改造酶分子的三维结构后，对其进行分析，从而确定可能改善酶某一方面性能的突变位点，通过反编译获得改造后的酶的基因，把这段基因再表达出来，就得到改造后的酶分子。
思想比较直接，但是实际操作却比较迂回，因为某些步骤看起来不复杂，但在现实中要实现就没有那么简单，比如要确定突变位点和突变的方向，目前的理论对蛋白质结构和功能的研究还达不到可以直接指导酶分子改造的那个层次，所以在改造的时候需要结合理性突变和随机突变，即理性确定突变位点，然后在那个位点进行全突变，或者增加突变位点；要获得反编译后的酶的基因，直接合成成本太高（1bp 要几块钱），所以需要对原来的基因进行操作（设计引物，通过PCR对酶基因进行全突变）；对改造后的酶的基因进行表达，需要利用基因工程技术，我们在实际操作中是先把基因和质粒连接，先转化大肠杆菌以增殖质粒，再从大肠杆菌中提取质粒，转化毕赤酵母进行最终的表达；因为设置多个突变位点以及每个突变位点都有二十种氨基酸，所以需要进行大量的筛选（筛选量随着突变位点的增长而呈指数增长）；基因既看不见有摸不着，在实验过程中需要对每一步的成果进行检测，比较多的就是依靠跑胶来检测DA分子的长度，确定是否得到目的基因，与突变后的酶基因进行连接的质粒上面要有抗生素抗性标记，转化后的大肠杆菌或毕赤酵母要用含抗生素的平板进行培养，以筛选出成功转化的菌落。
酶工程第6章酶的结构与功能
3．X-光衍射分析法
用X射线衍射研究蛋白质的构象时，蛋白质 必须结晶。用波长很短的X射线（λ=0.154nm）照 射蛋白质晶体，发生散射，底片曝光后，得到衍 射图，再经计算机处理，绘出电子密度图，从中 构建出三维分子图像。
通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。
肌红蛋白的X射线衍射图
部 分肽链的电子密度肌红蛋白分子中 图
某些常用的修饰剂
鉴别化学修饰剂是否已经 引入酶活性中心的标准
a．酶活性的丧失程度与修饰的程度成正比。 b．底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。
分析化学修饰结果时 应注意的问题
对化学修饰实验得出的结论应非常慎重，因为 可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近，由于 空间位阻使得底物无法进入活性中心，从而表现出 酶失去活性。活性中心往往有多个与底物结合的基 团，修饰其中的一个往往不能使酶失去活性，可能 导致结合力减弱，也可能改变被结合底物的专一性。
木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的 咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜 蛋 白 酶 共 有 212 个 氨 基 酸 ， 有 His81 和 His159 两 个 His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白 酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白 酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少 一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验 中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基， 因此知道了这两个基团之间的距离在 5 以内。这个 结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。
第六章 酶的结构和功能
一、酶的活性中心 二、酶活性中心化学基团的鉴定 三、组成酶活性中心的重要化学基团 四、酶促化学修饰和酶活性调节 五、酶的空间结构与功能的关系 六、酶催化作用的机制 七、羧肽酶A催化作用的机制
酶工程实验报告三( 纤维素酶最适反应pH值的测定)
实验方式 小组合作
小组成员 XX XX XX XX
掌握酶最适 pH 值的测定方法及原理。
2、 实验仪器、试剂和溶液：
A 2 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅(4台)、试管架（1个）、1ml移液管（1 根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、 1000ml容量瓶（1个)、洗耳球（1个）、标签（若干）等。
本科学生实验报告
学号 104120440 姓 名
孙永升
学院 生命科学学院 专业、班级 10 生物技术
实验课程名称
酶 工 程 <实验>
教师及职称
李俊俊 <讲师>
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期
填报时间 2013 年 月 24 日
云南师范大学教务处编印
1
实验名称 实验三 纤维素酶最适反应 pH 值的测定
5 实验处理
A 5 葡萄糖标准曲线如 图 1：
OD540nm值
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
y = 0.7023x - 0.0747
葡萄糖标准曲线
R2 = 0.9992
系列1 线性 (系列1)
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
葡萄糖浓度(mg/ml)
图 1 标准曲线 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程 y=kx-0.0747，k=0.7023， R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。式中 Y 表示表示测定的吸光度（OD）值，X 表示还原糖的浓度, 0.0747 表示补偿参数。
pH 与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的 最适情况下，选用一系列变化的 pH 环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
《酶的作用和本质》教案
一、教学目标1. 让学生了解酶的作用和本质,掌握酶的基本特性。
2. 培养学生通过实验观察和数据分析来探究酶的作用和本质的能力。
3. 引导学生认识酶在生命科学和生物技术领域中的重要应用。
二、教学内容1. 酶的作用:介绍酶的作用机制和类型,通过实例讲解酶在生物体内的应用。
2. 酶的本质:介绍酶的化学本质和结构特点,探讨酶的催化机制。
3. 酶的特性:介绍酶的催化活性、特异性、稳定性和调节性等基本特性。
4. 酶的测定:介绍酶活性测定的方法和技术,以及相关实验操作。
5. 酶的应用:介绍酶在工业、医药、环保等领域的应用,以及酶工程的相关知识。
三、教学方法1. 采用讲授法,系统讲解酶的作用和本质,酶的特性,酶的测定和应用等方面的知识。
2. 采用实验法,组织学生进行酶活性测定实验,培养学生的实验操作能力和实验观察能力。
3. 采用案例分析法,引导学生分析酶在实际应用中的具体实例,提高学生的实际应用能力。
四、教学准备1. 教材、课件和参考资料。
2. 实验器材和试剂:酶标板、酶活性测定试剂盒、pH试纸等。
3. 视频资料:酶的作用和应用的相关视频。
五、教学过程1. 导入新课:通过问题引导,让学生思考酶的作用和本质是什么,引出本节课的教学内容。
2. 知识讲解:系统讲解酶的作用和本质,酶的特性,酶的测定和应用等方面的知识,结合实例进行讲解。
3. 实验操作:组织学生进行酶活性测定实验,引导学生掌握实验操作步骤和注意事项。
4. 实验观察和数据分析:引导学生观察实验现象,分析实验数据,探讨酶的作用机制和本质。
5. 案例分析:分析酶在实际应用中的具体实例,让学生了解酶的应用价值。
六、教学评估1. 课堂问答：通过提问学生对酶的作用和本质、酶的特性、酶的测定和应用的理解，评估学生对知识的掌握程度。
2. 实验报告：评估学生在酶活性测定实验中的操作技能、实验观察和数据分析能力。
3. 作业完成情况：评估学生对课堂所学知识的巩固和应用能力。
七、教学拓展1. 邀请相关领域的专家或企业代表进行讲座，分享酶在实际应用中的经验和案例。
酶的专一性实验报告
酶的专一性实验报告酶的专一性实验报告引言：酶是一类生物催化剂，能够加速化学反应的进行，而不被消耗。
酶具有高度的专一性，即只对特定的底物起作用。
本实验旨在探究酶的专一性，并通过实验验证酶对底物的选择性。
实验材料和方法：实验所需材料包括：淀粉溶液、淀粉酶溶液、葡萄糖试剂、碘酒、试管、试管架、显微镜等。
实验步骤如下：1. 准备试管，标记为A、B、C。
2. 在试管A中加入淀粉溶液。
3. 在试管B中加入淀粉溶液和淀粉酶溶液。
4. 在试管C中加入淀粉溶液和葡萄糖试剂。
5. 将试管A和B放入恒温水浴中，保持温度恒定。
6. 分别在试管A、B和C中加入碘酒，观察颜色变化。
7. 使用显微镜观察试管A和B中的淀粉颗粒。
结果与讨论：通过观察实验结果，我们可以得出以下结论：1. 在试管A中，淀粉溶液与碘酒反应后呈现蓝黑色，表明淀粉存在。
2. 在试管B中，淀粉溶液与淀粉酶溶液反应后，颜色变为红褐色，表明淀粉酶催化了淀粉的降解。
3. 在试管C中，淀粉溶液与葡萄糖试剂反应后，颜色变为橙黄色，表明淀粉被转化为葡萄糖。
从实验结果可以看出，淀粉酶对淀粉具有专一性，能够催化淀粉的降解，而对其他底物如葡萄糖则无作用。
这说明酶对底物的选择性是由其空间构象和活性位点的特定结构所决定的。
此外，通过显微镜观察试管A和B中的淀粉颗粒，可以发现试管B中的淀粉颗粒明显减少，而试管A中的淀粉颗粒基本未变。
这进一步证明了淀粉酶对淀粉的降解作用。
实验结果的验证和应用：为了验证实验结果的准确性，我们可以进行对照实验。
在对照实验中，可以将试管B中的淀粉酶溶液替换为其他酶溶液，如蛋白酶溶液或脂肪酶溶液。
观察结果发现，只有淀粉酶能够催化淀粉的降解，其他酶对淀粉没有作用。
酶的专一性在生物学和医学领域有着广泛的应用。
通过研究酶的专一性，可以深入了解生物催化的机制，为药物研发和生物工程提供指导。
例如，通过研究特定酶对特定底物的选择性，可以设计出高效的药物靶向传递系统，减少药物对健康组织的损害；还可以利用酶的专一性，开发出高效的酶工程方法，用于生物催化合成和废水处理等领域。
蛋白质与酶工程实训报告
2014-2015学年第二实践学期蛋白质与酶工程综合实训报告专业：生物技术班级： B1204*名：***学号： **********指导教师：***二○一五年七月六日100g/LZnSO4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 蒸馏水 3 3 3 3 3 0.5 mol/L NaOH 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分摇匀，室温下静放5min，过滤，另取5支中试管，同上编号，按下表加入试剂滤液（mL） 1 1 1 1 1 蒸馏水（mL） 2 2 2 2 2 显色液（mL） 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 迅速摇匀，用分光光度计在420 nm 下测定各管A 值。
5支试管在420 nm 下各管A 值分别为0.294、0.278、0.254、0.243、0.180三、实验结果:以尿素终浓度1/C为横坐标，1/A（1/v）为纵坐标作图，然后依1/C找出对应1/A点，将各点连线并延长与1/C轴相交，得- 1/Km ，计算出Km（以x×10-nmol·L-1表示）。
1/C 100 150 200 2501/A 1.01 1.02 1.08 1.12Km值代表酶的亲和力，km值越大亲和力越小，反之则越大。
三、实验结果：测得糖浆液重：45.5g实训三、不同浓度果胶酶对澄清果汁收得率的影响所需药品与仪器：药品：桃子、果胶酶溶液、抗坏血酸溶液、明胶、活性炭。
仪器：榨汁机、水果刀、PH试纸、温度计、定性滤纸、量筒、烧杯、刻度试管、恒温水浴器等。
一、实验原理桃汁中存在的果胶，有很强的保护胶体的作用，能保持稳定的浑浊度，同时，果胶溶液粘度大，如果不加处理，过滤是困难的，而且即使过滤之后，在果汁中所存在的果胶和其它高分子物质，在贮藏中，由于分解、与金属离子结合及其他作用，也会产生凝固沉淀，因此，在过滤之前，必须先进行澄清，常用的澄清方法主要有自然澄清法和热处理法、冷冻法、酶法、加澄清剂法、离心分离法、超滤法等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
广东省高教厅重点实验室——现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007年11月编者的话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设《酶工程实验技术》课程。
该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修“酶工程与蛋白质工程”。
本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，具体如下：为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。
本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。
编者2006年11月实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。
而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。
本方法有快速、简单易行等优点。
图1 产淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、试剂和仪器1、菌的来源取不同地点的表层土壤。
2、试剂：RBV-Starch（Sigma）, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, 2 mol/L NaOH 无菌水和琼脂粉等。
3、器皿250mL三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200µL移液枪、200µL枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。
4、仪器设备高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。
四、实验操作步骤1、器皿的消毒：培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121℃下灭菌20 min，取出备用。
2、培养基的配制与灭菌培养基的组成为：RBV-淀粉（1.2 %, w/v），NaNO3(0.2%, w/v), K2HPO4( 0.2 %, w/v) , MgSO4·7H2O （0.1%, w/v）, KCl(0.1%, w/v), 琼脂（2% , w/v）, 调PH至6.0左右。
在三角瓶中，121℃灭菌20 min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。
（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀，影响菌落的观察。
）3、土样的采集及稀释于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。
4、富集称取5.0 g混合土样和0.5 g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。
5、菌种的初筛称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌水至5mL，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL转移至另一刻度试管中，加入9mL无菌水，摇匀；从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀。
如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释液。
用移液枪分别吸取稀释100和1000倍的样品液50 µL，加入至已凝固的培养基表面，用涂抹棒涂布均匀。
将涂过样的培养皿倒置放置，于30℃培养箱里培养，观察菌落透明圈的出现情况。
（一般30h 后即可出现一些透明圈）。
6、菌株的纯化于超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成）用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分离能形成透明圈的单菌落。
并在斜面培养基中保存。
图 2 平板划线分离法示意图五、结果处理与分析1、菌落产生透明水解圈的观察用直尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的直径大小，求平均值，并计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。
表 1 不同菌落产淀粉酶能力的比较菌落编号菌落直径（mm）透明圈直径(mm) 透明圈直径/菌落直径菌落形态特征2、侯选菌落的形态观察：观察并描述分离所得菌株的菌落形态，以大致了解产酶菌株属于那一类菌。
3、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是请分析原因。
六、注意事项1、进行无菌操作前，将接种所需用具放于台面铁架上，对超净工作台即周围环境进行75％酒精喷雾，使灰尘沉降，打开紫外灯照射灭菌30min，操作前，用75％酒精喷手杀菌。
（在本实验中省去此步）。
2、操作应尽量靠里，在酒精灯的火焰旁工作。
3、实验过程中避免说话、走动。
4、每次涂板后涂布棒皆要用火焰灼烧灭菌，冷却后再涂下一块板。
实验二、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离一、目的学习和掌握亲和层析法分离纯化酶的基本原理和方法。
二、原理许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。
如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合，特异性的抗体一抗原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。
均属于专一性而可逆的结合，这种分子之间的结合能力叫做亲和力。
亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。
所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。
它具有分离快速，纯化效率高。
特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。
因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。
磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。
磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。
溶菌酶（Lysozyme, EC.3.2.17）广泛地存在于动物、植物和微生物中，其中鸡蛋清中的含量较为丰富。
鸡蛋清溶菌酶的相对分子质量为14.6 KD，由129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白，含有4个S-S键，在中性及偏酸性条件下结构较为稳定。
溶菌酶能催化水解细菌细胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，几丁质（又称甲壳素）则是这类细胞壁多糖的类似物，因此可利用溶菌酶与甲壳素间的特异结合来分离纯化溶菌酶。
三、材料、试剂及仪器1、材料● 新鲜鸡蛋清：取自市售的鸡蛋。
● 亲和层析介质：几丁质磁性凝胶介质（自制）。
● 溶壁微球菌（Micrococcus Lysodeikticus）（Sigma公司）2、试剂● 0.15N HAc ：吸取18mL冰乙酸，定容至1000 mL。
● 10%的HAc：吸取100mL冰乙酸，用蒸馏水定容至1000 mL。
● 0.2mol/L NaHCO3溶液：称取16.8g NaHCO3，溶解，定容到1000mL。
● 5mmol/L NaHCO3溶液（含0.2 mol/L NaCl）：先将0.2mol/L NaHCO3稀释40倍，再于每升溶液中加入NaCl 11.688g。
● 5mmol/L NaHCO3溶液（不含NaCl）：将0.2mol/L NaHCO3稀释40倍。
● 10mmol/L NaHCO3溶液：将0.2mol/L NaHCO3稀释20倍。
● 1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.2）：Na2HPO3·12H2O 4.7752g，KH2PO4 7.2576g，溶解，定容至1000mL。
● 考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝溶于50mL 90%乙醇，加入85%磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL，过滤。
● 2 mol/L NaOH ：称取80g的NaOH定容至1000 mL。
●0.1mol/L pH 7.8磷酸缓冲液(内含0.5mol/L NH4Ac)：称取32.78 g 的Na2HPO3·12H2O，1.33 g的NaH2PO4·2H2O, 38.54 g的NH4Ac溶解后，定容至1000mL.3、仪器分部收集器、分光光度计、恒温水浴器、恒流泵、电子天平、强力电动搅拌器、抽滤装置。
四、操作步骤（一）、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离1. 亲和层析介质的再生和平衡：用3-4个床体积的5mmol/L NaHCO3（含NaCl）溶液淋洗亲和层析介质即可。
（若发现介质上有太多杂蛋白和一些微生物污染，可用0.5mlo/L的NaOH淋洗亲和层析进行在位清洗）2.蛋清提取液的制备：取一个新鲜鸡蛋的蛋清，用5mmol/L NaHCO3 （不含NaCl）液搅匀并稀释至400mL，双层尼龙布过滤，取滤液。
（测定酶液总体积，并留1.0 mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。
3.酸和热变性：用10%的HAc将稀释后蛋清的pH值调至4.5，60℃水浴15分钟，双层尼龙布过滤，取滤液，用2 mol/L的NaOH将上清的pH值调回至7.0（边缓慢加入NaOH边搅拌，以免局部溶液pH值过高和将pH值调过头），（测定酶液总体积，并留1.0 mL样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。
4.开放吸附：向步骤3的上清液中加入上述平衡好的磁性凝胶介质，于烧杯中用玻棒缓慢搅拌30 min（见图1-1）。
（尽量缓慢地搅拌，以免破碎凝胶颗粒）。
在此步骤中溶菌酶被亲和吸附到凝胶介质上。
5.介质的磁性回收及洗涤：用带环型条纹塑料外套的圆形铁氧体磁铁作为外磁场收集亲和介质，此时介质被吸附于塑料外套的表面，取出塑料外套中的磁铁将吸附于塑料外套的表面的介质悬浮于10mmol/L NaHCO3溶液中，缓慢搅拌洗涤介质，磁性回收，如此洗涤介质2次（见图1 –2,3）。
将洗涤后的介质装柱（测柱径及层析床的高度），再用pH 7.8 含0.5mol/L NH4Ac 的0.1mol/L 磷酸钠盐缓冲液(以下称溶液B)洗涤至流出液的A280< 0.05时，再用10mmol/L NaHCO3溶液20mL洗涤以替换柱子中的溶液B，以便下一步的洗脱操作。