第九章 内皮祖细胞
第九章内皮祖细胞内皮祖细胞（EPC）是一类能循环、增值并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。
广义上认为EPC包括从血液血管干细胞分化为成熟内皮细胞的过程中所有一系列细胞。
第一节内皮祖细胞的分类与来源一分类从外周血中分离单细胞进行体外培养，3--5天后出现纺锤体形细胞，在2---3周生长达到高峰，在第4周死亡，称为早期EPC；另一种细胞在第2---4周出现，成鹅卵石形，在4---8周呈指数生长，可存活12周，称为晚期EPC。
早期EPC主要存在于骨髓中，主要表面标记是CD133（AC133）、CD34、VEGFR-2晚期EPC强表达所有内皮系标记VE-cadherin、FL T-1内皮一氧化氮合酶、CD31等。
二来源EPC的来源主要有一下几种1.血液血管干细胞根据（1）造血干细胞（HSC）血细胞成分血岛（卵黄囊的腹侧）血管内皮前体细胞血管内皮细胞（原始毛细血管网）(2)原始的HSC和EPC享有共同的细胞表面标志CD34、AC133、血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2）(3)HSC存在的部位如骨髓、外周血、新生儿脐带血、胎儿肝、胎儿脾均已证实含有EPC。
2.髓系祖细胞髓系祖细胞是单核细胞和巨噬细胞定向分化的前体细胞。
然而，许多实验表明，在血管生成的培养条件下，髓系CD34-/CD14+单核细胞能够表达许多内皮细胞的特异标志，并可在体外形成网状结构。
成熟的CD34-/CD14+外周血单核细胞在VEGF诱导下也能分化为内皮细胞样细胞，这些细胞同时表达内皮细胞标记。
把这些细胞和CD34+细胞一起注入体内时，发现他们能够结合到新生血管的管壁中去。
这一实验表明不仅CD34+细胞能分化成内皮细胞，CD34-/CD14+单核细胞能够分化为有生理功能的血管内皮细胞，并可作为EPC的来源。
3.多潜能成体祖细胞许多成体组织存在少许MAPC。
在细胞因子的诱导下，MAPC可在体外分化为内、中、外各胚层，在特定组织中定向分化为相应的干细胞。
目前，成体造血组织骨髓中已被证实存在MAPC，体内外研究证实MAPC细胞可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞。
心脏组织残留的MAPC也成功分离，研究显示此类细胞具有向内皮细胞分化的潜能。
第二节内皮祖细胞的分离和鉴定EPC可以从骨髓、外周血、脐静脉血及胎肝中分离出来。
EPC最早是作为CD34+单个核细胞从成人外周血中分离出来的。
一、内皮祖细胞的分离主要是：免疫磁珠分选法：用包被CD34单抗的免疫磁珠吸附法从外周血中分离CD34+细胞，分离得到的CD34+细胞较纯，但量少。
近来用CD133抗体，得较纯的EPC，单操作复杂、昂贵。
（2）密度梯度离心法从脐血外周血分离单个核细胞，然后用直接贴壁筛选法来分离内皮祖细胞，并添加VEGF、ECG、bFGF等促内皮生长因子的特殊内皮细胞培养基进行扩增。
操作简单，分离不纯。
（3）CD133+KDR+双荧光细胞分选法，可得纯度较高的EPC。
二、内皮祖细胞的鉴定（一）EPC的形态EPC在培养7-10天后，变成纺锤形内皮细胞样的形态特征：典型的EPC 为梭形或多角形，核呈椭圆形。
成群细胞呈现“鹅卵石”样排列。
(二) EPC的表面标记表面标记是指细胞表面具有的一些与众不同的生物大分子，主要是蛋白质，它可以用来区分不同种类的细胞。
至今仍未发现能同时将EPC与造血干细胞及成熟血管内皮细胞完全分开的特意细胞表面标记，且不同时期的EPC的表面标记也不同。
1.CD34和VEGFR-2（1）CD34（被认为是分离纯化EPC的合适标志物之一，但CD34+细胞所占的比例小，而且不是EPC的唯一标识，如成熟内皮上也表达CD34）（2）VEGRF-2(作为血管系统最早出现的细胞标记，是EPC高富集性分子标记)2 .CD133或AC133（可以特异性区分EPC和内皮细胞的表面标志---人AC133干细胞抗原。
CD133表达消失的同时出现VWF，可能为EPC分化为成熟内皮的分界）3.FGFR-1（用CD34和FGFR-1能分离出更多具有特异性内皮细胞抗原的细胞）（三）EPC的功能鉴定平滑肌细胞为长梭形，细胞核成扁圆形，成群的细胞表现为“峰与谷”样排列。
平滑肌细胞标志为平滑肌肌动蛋白、平滑重链和Calponin。
只要目标细胞群最终分化出内皮细胞或平滑肌细胞，就可以肯定为EPC。
第三节内皮祖细胞的培养、增值和分化一、内皮祖细胞的培养培养方法尚无定论，常规同时用多种生长因子促进细胞的生长分化，但价格昂贵，势必限制EPC的研究和应用。
EPC对培养液的要求高，必须用特殊配方培养液。
一般EPC所用的培养液是EGM-2，少数情况下应用IMDM、RPMI1640、长期培养液、Medium199和条件培养液。
EPC的培养需要VEGF、bFGF（碱性纤维生长因子）等多种刺激因子存在，可能还需要许多未知因子。
二、内皮祖细胞的增值正常情况下，EPC的数量极少，外周血中为每毫升2-3个，脐血中则要高3.5倍，在含有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等的培养条件下可以大量增值扩增。
与成熟血管内皮细胞相比，EPC作为血管内皮细胞的前体细胞具有迟发性高增值的潜能。
（例子）三、内皮祖细胞的分化（一）诱导分化内皮细胞胚胎干细胞、成体干细胞分化需要一定的微环境。
EPC也同样如此，相同的培养液加不同的刺激因子可产生不同的分化结果，而相同的刺激因子在不同的培养液里造成的分化结果却可能相同。
（例子）其中必不可少的关键因素是VEGF。
一般认为VEGF通过细胞膜上的VEGFR-2受体，激动蛋白激酶B，再通过三磷酸肌醇激活后续的各种细胞内信号，启动细胞的生长分化。
血浆VEGF水平与循环内皮祖细胞数量明显相关。
其他促使内皮祖细胞向内皮细胞分化不可缺少的因素有碱性纤维生长因子、上皮生长因子、肝细胞生长因子及胰岛素样生长因子等。
（二）诱导分化平滑肌细胞诱导分化平滑肌细胞文献极少。
一科学家取青年健康人外周血，通过密度梯度离心和CD34VE-cadherin免疫磁珠法分离出CD34+、VE-cadherin+细胞，现在EGM-2培养液中扩增3周，然后加入PDGF-BB再培养，2周内就分化出典型的平滑肌细胞。
仅用重力梯度离心法分离单核细胞后用相同的方法培养、诱导细胞分化出典型的平滑肌细胞，所得结果相同。
说明PDGF-BB是诱导刺激EPC向平滑肌细胞分化的关键因子。
第四节影响内皮祖细胞的数目和活性的因素生理条件的改变对EPC的影响似乎不大，而在一些外在因素的刺激下或一些病理条件下，EPC的数目及活性会变化。
一、机械、物理损伤因素1组织缺血与血管损伤2、缺血、缺氧3、剪切力二、细胞因子对内皮细胞生长有影响的生长因子很多，以VEGF和FGF最重要。
1、血管内皮生长因子VEGF通过与EPC的酪氨酸激酶受体VEGFR-2的结合直接发挥促进EPC 动员的生物学效应、加强体外EPC分化、促进活体的心血管形成。
VEGF 除了直接促进EPC的动员，还能促进其他生长因子（例如GM-CSF）的释放，后者尤其能动员肢体缺血患者增加循环的EPC数量。
2、基质细胞衍生因子-1SDF-1是一种趋化因子，在干细胞的流动及迁移起了重要作用。
Y amaguchi等给无胸腺裸鼠建立后肢缺血模型，肌肉内注射SDF-1，荧光镜检显示，SDF-1处理组荧光标记EPC在缺血肌肉局部聚集增加，在处理28天后，毛细血管密度也增加。
3、促红细胞生成素促红细胞生成素刺激外周血内皮祖细胞增生。
在缺血性心脏病患者中，应用促红细胞生成素后血中内皮祖细胞数量增多，且与血浆促红细胞生成素水平成正比，体外培养证实可分化成内皮祖细胞的细胞数量明显增多。
4、血管内皮抑制剂血管内皮抑制素为胶原蛋白水解产物，是一种内生血管抑制因子，在体内有潜在的抗肿瘤和抗血管形成的作用。
、EPC对其敏感度，血管内皮抑制素能诱导EPC凋亡使其数量减少。
其他生长因子，包括血管生成素、成纤维细胞生长因子和SDF-1也可以促进EPC的动员和募集；EPC上存在的转录因子、组织缺氧介导因子-1（HIF-1）可以调节SDF-1基因的表达。
SDF-1结合循环细胞上的CXCR4降低缺血组织氧张力，HIF-1介导SDF-1表达，可增加CXCR4+祖细胞对缺血组织粘附、迁移、归巢。
三、药物因素1.血管紧张素受体拮抗剂2.他汀类药物3.葛根素4.重组人EPO激活EPC的Akt蛋白激酶途径5.大剂量阿司匹林（抑制）第五节内皮祖细胞的作用一、促血管新生和维持内皮功能1、EPC参与出生后的治疗性血管发生2、显著提高毛细血管的密度，促进足血流恢复3、补充循环EPC可以作为治疗系统硬化性患者缺血的策略4、提示一种新的治疗肺动脉高压的方法5、EPC促进重新内皮化，限制动脉粥样硬化二、基因治疗理想的导向载体EPC还是基因治疗理想的导向载体，它能定向移动到血管生成部位并整合到血管壁中。
由于内皮细胞是最接近于血流的一层细胞，因此由EPC携带并释放出的蛋白质很容易通过血流扩散到全身从而广泛发挥作用。
----------------------------------------------------------------------------------------------------许多问题尚待解决----------------------------------------------------------------------------1.生长因子定义：具有刺激细胞生长活性的细胞因子。
一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。
存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。
通常培养细胞的生长需要多种生长因子顺序的协调作用，肿瘤细胞具有不依赖生长因子的自主性生长的特点2.外周血外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到外周血液中，再在从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞称为外周血干细胞.3.再循环干细胞（circulating stem cell pool）循环干细胞能够分化为成熟肝细胞和皮肤与胃肠道的上皮细胞。
4.血岛：blood island 鸟类和哺乳类胚胎发生的早期，卵黄囊壁上的间充质细胞聚集形成的一种岛状结构，可分化出血管和血细胞。
5无颗粒细胞：（没有查到无颗粒细胞的概念，但是这里有无颗粒白细胞的资料，大家看一下，联系着理解一下）无颗粒白细胞：把细胞浆中不含大量颗粒的白细胞命名为无颗粒白细胞，无颗粒白细胞无细胞质颗粒，但有圆形细胞核，包括单核细胞和淋巴细胞。
【附】颗粒细胞：卵泡中卵母细胞四周有一层菱形或扁平细胞围绕，在卵泡开始发育、卵细胞成长的同时，周围的菱形细胞变为方形，并由单层增生成复层，因其细胞浆内含有颗粒，故称为颗粒细胞。
内皮祖细胞的研究进展
内皮祖细胞的研究进展【关键词】内皮祖细胞・新生血管化，生理性内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，在生理和病理条件下能够修复损伤的血管内皮细胞，对维持血管内皮细胞的完整性极其重要［1］。
1997年，Asahara等人首次分离并证实成年人外周血中存在着能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞，并在体内证实了其生成血管的能力［2］。
近年来，内皮祖细胞移植在心脑血管疾病，创伤愈合等血管类疾病的治疗中展现出广泛的应用前景。
1 EPC的来源与识别EPC存在于各种成年动物和人的骨髓和外周血中，主要存在于骨髓。
在某些生理、病理状态下，EPC可从骨髓释放，并在外周血中运行。
近几年，人们从脐带血中分离出EPC，并成功地诱导其分化为血管内皮细胞。
脐带血具有取材方便，富含早期干细胞等优点，可为EPC的研究提供更理想的细胞来源。
不同培养时间的内皮祖细胞可能呈椭圆形、长梭形或纺锤形，在形态上无法与其它细胞区分开来，主要靠细胞表面标志来识别。
目前将CD34、CD133、Flk1、cKit、Sca1、DiIAcLDL、vWF、VEGFR2等作为EPC主要的细胞表面标志［3、4］。
体外研究表明，CD34+、CD133+、VEGFR2+的EPC经VEGF、bFGF等诱导分化后，CD133和CD34表达逐渐减弱，并开始表达血管内皮细胞表面特有的分子标志如CD31、UEA1、vW 因子、VE钙黏素等，最终转化为成熟的血管内皮细胞。
CD34+、CD133+、 VEGFR3+的EPC 体外诱导分化后，可形成表达淋巴管内皮特异性标志：LYVE1和 pdodplanin的淋巴管内皮细胞［5］。
2 EPC在治疗性血管生成中的研究现状EPC 促进血管形成无需依赖原有的血管系统，其机制主要有两个方面：一是内皮祖细胞能直接分泌VEGF等细胞因子，通过旁分泌的方式促进局部缺血组织的血管新生；二是内皮祖细胞通过归巢、整合于受损的血管丛，进而直接分化、发育为新生血管［6］。
内皮祖细胞的研究进展
内皮祖细胞的研究进展
内皮祖细胞具有自我更新和多向分化的潜能。
研究人员已经成功地将内皮祖细胞分化为多种细胞类型，如内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞以及骨细胞等，并且这些分化的细胞具有功能性。
此外，内皮祖细胞还具有促进血管生成和修复的能力。
这些特性使得内皮祖细胞在心血管疾病、组织损伤和器官再生方面具有潜力。
在临床应用方面，内皮祖细胞已经被用来治疗一些疾病，如冠心病和外周动脉疾病。
研究表明，内皮祖细胞的移植可以促进血管生成、改善血液循环，并且对于心肌再生和修复有积极的影响。
此外，内皮祖细胞还被应用于组织工程学中，用于构建人工血管和修复器官缺损。
然而，内皮祖细胞的研究还面临着一些挑战和限制。
首先，目前对内皮祖细胞的分离、纯化和扩增方法仍然不够成熟。
其次，内皮祖细胞的命名和鉴定标准不统一，使得研究结果的复现性存在困难。
此外，内皮祖细胞的长期安全性和效力仍需要进一步研究。
综上所述，内皮祖细胞具有重要的研究价值和临床应用潜力。
尽管目前的研究还存在一些挑战和限制，但随着技术的不断进步和对内皮祖细胞更深入的研究，相信内皮祖细胞将在 regenerative medicine 和疾病治疗领域发挥更大的作用。
人外周血来源内皮祖细胞与成熟血管内皮细胞生物学性状
人外周血来源内皮祖细胞与成熟血管内皮细胞生物学性状人体血液循环系统是一个高度分化的器官系统，由心血管系统和血液组成。
对于心血管疾病和其他几种具有血管造血功能的疾病，重塑受损或缺陷的血管结构是治疗的一个关键因素。
人的外周血中含有多种来源和有分化能力的前体细胞，已被广泛地研究用于血管再生和组织修复。
本文将介绍人外周血来源的内皮祖细胞和成熟血管内皮细胞的生物学性质。
内皮祖细胞和血管内皮细胞概述内皮是血管内膜的一层细胞，是血管的劳动力和防御系统。
其中，血管内皮细胞是血管内的核心细胞。
在正常健康条件下，血管内皮细胞能够维护正常的血管成分和血液流行状况。
然而，一旦出现血管功能障碍，例如心血管疾病，癌症和一些遗传障碍等，血管内皮细胞会发生功能损失和细胞凋亡，这导致血管系统不稳定，甚至出现严重问题。
内皮祖细胞是一类具有诱导分化为成熟血管内皮细胞的分化潜力的前体细胞。
与成熟的细胞相比，内皮祖细胞是一类未成熟和具有较高的增殖和自我更新的细胞。
正因为这些特性，内皮祖细胞已被广泛研究用于治疗心血管疾病和一些其他疾病。
人外周血中的内皮祖细胞被认为是一种重要的来源。
本文将继续介绍人外周血来源内皮祖细胞的特性和应用。
内皮祖细胞的来源和特性内皮祖细胞可以来源于多个人体部位，如骨髓、外周血、脂肪组织、肌肉等。
其中，外周血是一种非侵入性的来源，已经成为研究中关于内皮祖细胞最常用的来源。
内皮祖细胞被分为EPC（内皮祖细胞）和LPC（全血管内皮祖细胞）。
EPC在外周血中非常罕见，而LPC是最常见的类型。
内皮祖细胞可以通过两种不同的方式存在于外周血中，即粘附方式和非粘附方式。
在显微镜下，这些内皮祖细胞可以通过表达血管内皮生长因子受体（VEGFR）和内皮细胞标志物CD31，CD34，VE-cadherin和von Willebrand因子（vWF）来表征。
内皮祖细胞还表达非血管内皮标志物，如胶原和Vimentin。
内皮祖细胞的功能是生成成熟的内皮细胞和血管重建。
人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定
人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定目的：研究人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定方法。
方法：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，用EGM-2培养基在多聚赖氨酸包被的培养板中进行诱导培养，动态地观察贴壁细胞的生长状况，免疫组织化学技术检测培养细胞表面标志物的表达。
结果：人外周血单个核细胞经体外培养至第2天，呈贴壁生长，细胞形态为大小相近的圆球体；第4天一些细胞开始出现尾状物，形态呈蝌蚪样改变，部分细胞聚集形成细胞簇；至第7天细胞形态变长，呈梭形改变，细胞间相互围绕呈环形，并有集落出现，免疫组织化学染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表达均呈阳性。
结论：运用本实验方法可以成功实现人外周血内皮祖细胞的分离、培养和扩增。
标签：内皮祖细胞；外周血；细胞培养内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，亦称血管母细胞（angioblast），EPCs不仅参与胚胎血管生成，而且也参与出生后的血管新生过程。
近些年来人们对EPCs在血管形成、心脑血管疾病和创伤愈合等方面的作用进行了广泛的研究[1]，EPCs移植技术已成为治疗心脑血管疾病的一种新兴的方法[2]，具有广阔的临床应用前景。
但由于EPCs的来源有限，目前的培养方法尚不能满足基础研究和临床治疗的需要，在本实验中，笔者研究从来源相对广泛的人外周血中分离培养EPCs，为EPCs的应用提供一种便捷有效的分离方法。
1 材料和方法1.1 材料：主要试剂和仪器：内皮细胞培养基（Endothelial Cell Growth Medium-2，EGM-2）（Lonza公司）。
人淋巴细胞分离液（天津灝洋生物制品有限公司）。
鼠抗人CD133单克隆抗体、血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2）（北京博奥森生物技术有限公司）。
内皮祖细胞与缺血性脑血管病
万方数据・５４６・垦区堕堂篮痘苤盔呈塑生！旦筮！！鲞筮！翅壁』鱼型塑燮！垡邑』坦Ｙ２Ｑ塑，№！：！Ｚ，№：ＺＣｓＦ）、基质细胞衍生因子一ｌ（ｓ仃ｏｍａｌｃｅｌｌ—ｄｅｒｉⅦｄ缸ｔｏｒ一１，ＳＤＦ—１）、胎盘生长因子（ｐｌａｃｅｍａｇｒｏｗｔｈ加ｔｏｒ，ＰＧＦ）、胰岛素样生长因子一ｌ受体（ｉ１１ｓｌｌｌｉｎ－ｌｉｌ（ｅｇｒｏｗｔｌｌｆ配ｔｏｒ—ｌｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＧＦ一１Ｒ）等也具有调节ＥＰＣ增殖和移行的作用心刊。
释放入循环系统后，口Ｃ能选择性聚集和整合进入受损血管、缺血组织和肿瘤部位，而很少或几乎不出现在非缺血部位。
在后肢缺血模型动物巾，口Ｃ主要出现在缺血后肢的新生血管中，而几乎不出现在健侧后肢；在脑缺血模型动物中，日ｃ只出现在缺血侧大脑半球，而不出现在健侧大脑半球【４Ｊ。
口ｃ组织趋向性的原因是：口Ｃ在移行过程中受到很多趋化因子、细胞因子和受体等的影响，包括ｓＤＦ一１、Ｂ２一整合素和组织蛋白酶Ｌ【５’１等。
此外，图１早期和晚期ＥＰｃ表面标志的比较Ｐ．选择素配体也町介导口ｃ向内皮聚集０７Ｉ。
１．３ＥＰＣ的表面标记和细胞检测方法由于外周血中的即Ｃ是干细胞在分化为内皮细胞过程中的未成熟细胞，因此，它同时具有干细胞和内皮细胞的部分结构和功能特性。
在细胞发育过程中，干细胞逐渐失去原有特性而获得内皮细胞特性，故ＥＰＣ在不同阶段具有不同的表面标记旧１（图１）。
目前，循环库中的ＥＰｃ被分为３种细胞亚型：ＣＤ３４＋／ＣＤｌ３３’衄Ｒ＋、ＣＤ３４一／ＣＤｌ３３＋／ｌ①Ｒ＋和ＣＤ３４＋／ＣＤｌ３３＋／ＣＤＫＤＲ＋，其中ＣＥＢ４＋／Ⅺ）Ｒ＋细胞是循环ＥＰｃ的主要组成成分（约占８８％）归Ｊ，并被认为是辨认ＥＰＣ的最合适的表型（图２）。
ＥＰｃ的识别和检测主要依赖其功能和表面特征（包括表面标记）。
目前，广泛用于ＥＰＣ检测的方法主要有２种：细胞培养法和流式细胞法¨引。
前者是将外周血分离得到的单核细胞在适合ＥＰｃ生长的特定环境中进行培养，通过观察细胞簇是否硅示出内皮细胞特性而辨别ＥＰｃ；后者是先使荧光抗体结合ＥＰｃ表面抗原，再用流式细胞仪检测荧光标记的ＥＰｃ数量。
内皮祖细胞在肺动脉高压的作用
野百合碱可损伤肺动脉血管内皮细胞，诱导肺 动脉血管壁的重构，野百合碱诱发的肺动脉高压模 型是常用的肺动脉高压模删之一。人们已观察到， ＥＰＣｓ能积极参与该类肺动脉高压的肺血管重构， 外源性ＥＰＣｓ对此类肺动脉高压也有着积极的治疗 作用。在野百合碱导致的大鼠肺动脉高压模型中， 新生内膜中能稳定地检测到骨髓来源的细胞。提示 骨髓来源的细胞町以参与到损伤后的动脉新生内膜 中心”。在其他学者的研究中也证实，骨髓来源的 ＥＰＣｓ可以修复野百合碱导致的肺损伤，代偿微血 管的结构与功能；ＥＰＣｓ能进入远端肺小动脉，并插 入内皮层，利于维持微血管结构的完整性；使用 ＥＰＣｓ治疗能预防右心室压力的升高，调节．肺动脉 高压（肺血管阻力下降１６％）；使用转导。肾上腺髓质 素ＤＮＡ的ＥＰＣｓ能更为显著地改善肺』ｌｌＬ管阻力（肺 血管阻力下降３９％），而使用转导ｅＮＯＳ编码基因 的ＥＰＣｓ则能逆转肺动脉高压，并能显著地改善生 存率心８１ ２…。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等使用经气管镜局部注射的 方法，对野百合碱导致的狗肺动脉高压模型进行自
由于干、祖细胞潜在分化的多向性，多种干、祖 细胞在体外内皮细胞培养条件下均可向内皮细胞方 向分化，从而导致了ＥＰＣｓ选择标准的多样性。 Ａｓａｈａｒａ等最早使用ＣＤ３４来分离鉴定ＥＰＣｓ［１］，但
Ｄ（）ｌ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４３６Ｘ．２００９．０２２．０１２ 摹金项目：国家自然科学基金资助项目（３０７７０９４０） 作者单位：１０００２０首都医科大学附属北京朝阳医院呼吸与危 重症医学科首都医科大学呼吸病学系北京呼吸疾病研究所（万钧、 王辰）｝１０００６９北京，首都医科大学基础医学院生理学教研室（王 军） 通信作者：王军．Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇ＿ｊａｎ＠ｃｃｌｒｔｕ．ｅｄｕ．ＣＵ
内皮祖细胞的分离和培养
内皮祖细胞的分离和培养实验原理内皮祖细胞(endo thelial prog enitor cells, EPCs)存在于骨髓、脐血和外周血，是血管内皮的前体细胞，参与胚胎时期的血管发生和出生后的血管新生，有促进组织器官, 尤其是缺血组织器官内皮细胞(endothiel cell, EC)修复、建立侧支循环和恢复血供的作用。
EPCs对培养体系要求很高，必须要有特异性生长因子血管内皮生长因子诱导和纤连蛋白辅助贴壁下才能够保持良好的生长状态和增殖活性。
外周血中所含内皮祖细胞极低，本次试验选用骨髓来分离内皮祖细胞。
实验材料1.材料来源:SD小鼠，4周龄，雄性，体重80g2.手术器械:解剖剪、解剖镊和止血钳3.清洗液:PBS和不含Ca2＋、Mg2＋的HBSS4.培养液:DMEM添加10％FBS、10万IU/L青霉素和100mg/L链霉素；含有8％肝素纳（500IU/ml）的PBS操作步骤1.取材:2～3w大鼠，脱颈，取股骨和胫骨。
2.冲骨:D-PBS冲洗骨髓，收集骨髓冲洗液，离心（100rpm，10min），弃上清，加DMEM混悬。
3.配细胞分离液:Percoll。
4.A液: Percoll原液和1. 5 mol NaCl（9:1），比重为1.124。
5.B液:A液和0.9% NaCl（6:4），比重为1.076。
6.梯度离心:缓慢将细胞混悬液1：1加于Percoll液上面，离心（2000rpm，20min），观察细胞分层。
7.单形核细胞培养:吸出含有单形核细胞的液层，用0.9% NaCl混悬，离心（100rpm，10min），弃上清，加适量培养液，接种于培养皿，37℃、0.5%CO2条件下培养24h。
8.吸取上层未贴壁单形核细胞，离心（1000rpm，10min），弃上清，加适量培养液，接种于培养皿，37℃、0.5%CO2条件下培养，3～5d传代。
注意事项1.取材前现配Percoll 液，4℃放置备用。
内皮祖细胞鉴定方法
大鼠骨髓EPC的鉴定：①EPC培养约2周后达到80% ～90%融合，以0.25 %胰酶+0.01%EDTA消化，传代至24孔板中，待细胞贴壁完全后用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色鉴定。
细胞在含Dil-ac-LDL(10μg/mL)的培养液中避光孵育10 h，然后以2% 的中性甲醛固定10min，PBS液漂洗后再加FITC-UEA-1(10μg/mL)避光孵育1 h。
PBS液漂洗后在荧光显微镜下观察，显示红色荧光的为ac-LDL阳性细胞，显示绿色荧光的为UEA-1阳性细胞，显示双荧光阳性(黄色)的细胞被认为是EPC，随机计数10个非重叠视野，计算双阳性细胞比例。
同时以大鼠主动脉内皮细胞为阳性对照，大鼠主动脉平滑肌细胞为阴性对照。
2、流式细胞仪检测细胞表型。
取培养14天的EPC细胞1×10的6次方进行流式细胞仪检测，分别检测CD34+、CD133+、vWF+、Flk-1+细胞所占的比例。
需要一定数量培养EPC过程中EPC的显微镜下照片。
综述人血内皮祖细胞
陈君柱人血中内皮祖细胞研究现状马良龙综述黄惠民审校上海第二医科大学附属上海儿童医学中心胸心外科200127摘要：人循环血液中存在内皮祖细胞，可以分化成内皮细胞和/或平滑肌细胞，其主要功能是参与血管新生。
目前，确定内皮祖细胞还没有一个统一的标准，相对认可为内皮祖细胞的是CD34、AC133和FLK-1等标志阳性细胞。
内皮祖细胞在缺血性疾病治疗、血管组织工程、靶向药物治疗、肿瘤治疗等方面有广泛应用前景。
本文总结近几年有关其来源、鉴定、分化、功能、应用等方面的文献。
关键词：内皮祖细胞血管新生组织工程干细胞具有自我更新和多向分化潜能，分胚胎干细胞和成体干细胞。
胚胎干细胞为全能干细胞，可以诱导分化成体内几乎所有类型细胞。
而成体干细胞为多能干细胞，只能在一定刺激因子和特定的微环境下分化成几种细胞或具有特定功能的组织、器官。
成体干细胞存在于骨髓、脐带血、外周血以及胎肝中。
由于受到伦理、法律及宗教文化等多方面问题的限制，胚胎干细胞的研究开展受到很大影响。
而成体干细胞研究不存在这些问题，发展较快。
目前干细胞临床应用最广泛和成熟的是骨髓移植和外周血干细胞移植，主要应用于血液病和各种恶性肿瘤引起的恶性贫血、免疫力低下等。
其它方面的应用多处于实验研究阶段。
在心血管外科，干细胞在组织损伤和缺损修复中的作用、在构建组织工程材料的应用是目前研究的重点。
文献中多应用endothelial progenitor cells或angioblast/hemangioblast及endothelial procursor来描述最后发育成内皮细胞的前体细胞（1,2,3,4,5,6），一般翻译成内皮祖细胞、成血管母细胞、血液成血管细胞和内皮前体细胞。
干细胞和祖细胞的特性为：干细胞具有自我更新和多向分化能力，具有“永生”特性，祖细胞只能在一定条件下分化成一种或两种特定细胞，没有自我更新能力，只能由干细胞的分化来补充其衰老死亡的细胞，属于过渡阶段的一种细胞，它不一定具有所有成熟细胞的标志，而且带有部分其它类型细胞的标志。
内皮祖细胞的研究进展
EPCs’ Development
Tie receptor and ligand：受体酪氨酸激酶家族
receptor • Tie-1 (Tie) • Tie-2 (Tek)
Tie-2 ligand：Angiopoietin (Ang，血管生成素 ) • Ang-1：血管内皮化 • Ang-2：血管周围细胞和内皮细胞分离
这种方式最早发生在胚胎期的血管生成，直接由 EPCs或更早来源的血管母细胞（angioblast）长成， 是血管从无到有的过程。最近证据表明，EPCs参 与的血管发生亦参与了出生后机体局部缺血组织 的修复。
Vasculogenesis和Angiogenesis是血管发育过 程中的两个阶段，但在中文翻译时出现了意思 重叠和相近、不便于区别的问题。
EPCs’ Development
Tie receptor and ligand：受体酪氨酸激酶家族
Tie-2缺陷的胚胎不能建立血管结构的完整性 Ang-1缺陷鼠也表现为血管生成缺陷
EPCs’ Development
Ephs family
Erythropoietin producing hepatocyte receptor (Eph) Ligand: ephrins (Eph A、B) Eph B可调节 Ang-1 和 Tie-2的表达
Department of Pathophysiology Hongmei TAN Nov, 2008
Definition
They are circulating, bone marrow-derived cells that are functionally and phenotypically distinct from mature endothelial cells They can differentiate into endothelial cells in vitro, as assessed by expression profiles and functional characteristics They can contribute to in vivo vasculogenesis and / or vascular homeostasis