链霉菌基因转移的方法
链霉菌基因转移的方法
作者：吴胜， 夏焕章
作者单位：沈阳药科大学生物制药系,沈阳,110016
刊名：
中国生物工程杂志
英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY
年，卷(期)：2002,22(1)
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本文链接：/Periodical_swgcjz200201021.aspx。
链霉菌的分子育种策略
链霉菌的分子育种策略摘要：现在链霉菌的选育已经进入分子育种阶段。
其过程包括利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控，进而进行抗生素的修饰、改造；将整个次生代谢产物合成基因簇转移到易于工业化操作的宿主系统中，引入抗性基因、调节基因和引入血红蛋白基因；利用基因筛选程序，筛选含有特定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物；利用基因组重排技术对出发菌株进行处理等。
链霉菌接合转移体系研究的提出为分子育种打开了一个新的方向。
系统改变基因结构可产生一个完整的突变株文库，从而构建大规模生产不同抗生素的工程菌。
关键词：链霉菌，分子育种，基因Method of Streptomyces’s molecular breeding Abstract:Now The breeding of Streptomyces has entered the stage of molecular breeding. The process includes: Using genedisruption, knockout, replacement mutation technology tounderstand gene function, expression, regulation and control and then have the, modification of antibiotics. The secondarymetabolite biosynthesis gene cluster is transferred to the easy industrial operation of the host system, introducing theresistance gene, gene regulation and introducing the hemoglobin gene;Use of genetic screening programs, screening of specific types of compounds containing the gene producing strain, and obtained the corresponding secondary metabolites;Use of genome shuffling on the starting strain processing and so on . the conjugative transfer system research of Streptomyces has openeda new direction for molecular breeding System changes in genestructure can produce a complete mutant library, so as toconstruct the mass production of different antibioticengineering bacteria.Key words: Streptomyces；molecular breeding,；DNA链霉菌是一类细胞壁类型为I型、革兰氏阳性、好气的最高等的放线菌。
利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因
利用CRISPR-Cas9技术定点突变链霉菌rpsL基因链霉菌(Streptomyces)是活性产物的重要来源,其次级代谢产物应用广泛,可作为抗真菌药物、抗病毒药物、抗肿瘤药物、抗高血压药、免疫抑制剂以及抗生素等。
近年来从链霉菌发现新化合物的几率不断下降。
但是基因组学研究结果显示链霉菌含有编码20个或更多潜在次级代谢物的基因,其中仅一部分在发酵过程中表达,说明链霉菌含有大量沉默基因,在新化合物发掘和新药研发方面仍有巨大潜力。
本文期望通过CRISPR-Cas9技术靶向链霉菌rpsL基因引入K88E和P91S突变,改变核糖体稳定性,激发链霉菌自身次级代谢物合成潜能,即通过核糖体工程打开链霉菌次级代谢产物的合成途径。
在模式菌株天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 1147中K88E和P91S 突变是激活效果较为明显的两种突变。
CRISPR-Cas9技术在链霉菌中的应用是相对新颖的课题,最早的见刊文献在2014年年末。
建立高效、普遍适用的基因组编辑系统对于后续唤醒沉默基因及优化菌株都具有极其重要的意义。
本文首先针对链霉菌建立了一套CRISPR-Cas9系统,人工合成了 pCas9-1质粒,对11株海绵共附生链霉菌进行遗传操作。
测试了质粒含有的热敏元件pSG5 rep、筛选标记阿布拉霉素抗性基因(acc)和硫链丝菌素抗性基因(trs),结果显示均能正常工作,并对各培养、筛选、质粒清除等条件进行了优化。
利用该质粒定点突变链霉菌rpsL基因没有获得阳性结果。
然后由pCas9-1质粒衍生出两种不同的质粒,分别命名为pCas9-2和pCas9-3。
这三种质粒含有相同的sgRNA(用于靶向同一位点)和相同的同源重组(HR)模板,区别在于sgRNA和Cas9元件的启动子不同。
利用这两种质粒再次对海绵共附生链霉菌开展操作,依然没有阳性结果。
之后针对陆生链霉菌S.coelicolorAS4.242操作,pCas9-2质粒成功实现了定点突变,阳性率在50%以上,且多次重复显示该系统能稳定工作。
基因位于染色体上的方法
基因位于染色体上的方法基因是指生物体内控制遗传特征的一段DNA序列。
它们位于染色体上，并通过遗传方式传递给后代。
在本文中，将介绍一些基因位于染色体上的方法。
1. 人类基因组计划：人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）是一个国际合作的科学研究项目，旨在确定人类遗传组成中的所有基因，并了解这些基因的功能。
该计划使用了基因座标系（Genome Coordinate System），通过对许多人的基因进行测序和比较，确定了每个基因位于染色体上的具体位置。
2. 链霉菌发酵法：链霉菌发酵法（Streptomyces fermentation）通过将链霉菌培养在适当的培养基中产生链霉菌素，然后通过组织培养和染色体置换等方法，将链霉菌素与目标基因染色体连接起来。
这样，就可以通过链霉菌的发酵产物来确定目标基因位于染色体上的位置。
4. 荧光原位杂交（FISH）：荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是一种常用的染色体检测方法，可以用来确定基因位于染色体上的位置。
该方法通过标记具有特定序列的探针，并将其与染色体样品进行杂交，然后使用荧光染料进行可视化。
通过观察标记染色体的荧光信号，可以确定目标基因位于染色体上的位置。
5. 倒位杂交：倒位杂交（Inversion Hybridization）是一种通过杂交实验确定基因位于染色体上的方法。
该方法使用带有特定标记的DNA探针与染色体进行杂交，并通过测试两者之间的杂交信号来确定基因位于染色体上的位置。
6.基因测序：基因测序是一种直接测定DNA序列的方法，也可用于确定基因位于染色体上的位置。
通过对染色体样本进行测序，可以得到基因序列信息，并通过与参考序列进行比对，确定基因位于染色体上的位置。
总结来说，基因位于染色体上的方法有很多种，包括人类基因组计划、链霉菌发酵法、阵列比较基因组杂交、荧光原位杂交、倒位杂交和基因测序等。
链霉菌基因实验操作
链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/28 16:09:31 来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?501051010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-5*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
链霉菌(Streptomyces TE66 ) MalQ基因克隆与原核融合表达
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(6):1024~1028*基金项目：江西省教育厅项目(赣财教[2004]18号 18)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.博士， 副教授， 主要从事食品生物技术研究。
Tel:07918329081;Email ：<shuixingw@>. 收稿日期:2007618 接受日期:2007719·研究论文· 链霉菌( ST66) 基因克隆与原核融合表达 *王水兴 1 **，付金衡 1 ，龚 珩 2 ，郭 勇 3 ， 夏慧玲 1， 韩林强 1(1. 南昌大学中德联合研究院， 南昌 330047； 2.九江学院医学院， 九江 332005；3. 华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510641) 摘要：利用PCR 方法获得 ST66基因， 将该基因插入原核表达载体 pTrcCKS 中， 对质粒所含外源片段双向测序， 并经 BLAST 比较分析， 发现其与GenBank 中报道的 基因的同源性高达97%。
重组质粒 pTrc 转化大肠杆菌（ ）Top 10F'， 经IPTG 诱导后以融合蛋白形式表达，SDSPAGE 电泳显示 基因与(CTP:CMP3deoxyDmannooctulosonate cytidylyltransferase or CMPKDO synthetase)基因表达的融合蛋白在目标位置约 106kD 处有明显条带。
经薄层层析分析粗酶液处理的麦芽三糖溶液， 证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。
关键词： 麦芽糖转糖基酶； 基因克隆； 融合表达；大环糊精； 基因中图分类号:S188 文献标识码: A 文章编号:10061304(2007)06102405Cloning and Fusion Expression of the Gene fromWANG Shuixing 1 **， FU Jinheng 1 ， GONG Heng ２ ， GUO Yong 3 ， XIA Huiling 1 ，HAN Linqiang1The gene was amplified fromby PCR,cloned into pTrcCKS and sequenced. sequence was analyzed by BLAST and displayed high similarity (97%)to gene ofreported in GenBank.Therecombined plasmid pTrcwas transformed intoTop 10F'and induced by IPTG.gene and(CTP:CMP3deoxyDmannooctulosonate cytidylyltransferase or CMPKDO synthetase)gene fusion protein (molecular weight ： about 106 kD)could be detected by SDSPAGE gel electrophoresis.The crude enzyme was demonstrated having 4glucanotransferase activity with thin layerchromatography.amylomaltase;gene clone;fusion expression;cycloamylose;gene环状糊精是淀粉经酶降解而产生的，可以与疏 水客体分子形成包合物，极大的改变了客体分子的 物理化学特性，包括改变客体分子的水溶性、稳定性、 挥发性以及药物分子的药效和口感等（Siegal ，1997； Sata ， 2001），甚至用于包埋去除一些 有害物质（Rao ， 2000），在化学上用作催化剂（Granados and Rossi ， 2001）。
接合转移
实验原理：质粒的转移性
• 细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。 接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从 供体向受体转移的过程。 • 质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有 完整的编码转移酶的 tra 基因，质粒能自主地从一个细胞 转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体 DNA 向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。 如大肠杆菌的 F 质粒。 • 有些质粒不含 tra 基因，但含有质粒转移起始位点oriT， 虽不能自主转移，但能被其他一些含完整 tra 基因的质粒 所诱动，这类质粒又被叫做可诱动质粒。
Hale Waihona Puke 实验产物 • 接合转移子: Streptomyces lividans ZX1 /pSET152
实验准备工作
菌株准备（教师做）： 1. 供体准备
a) 培养E. coli S17-1/pSET152：接种到液体LB培养基5ml + Apr 50μg/ml, 37℃震荡培养过夜。第二天扩大培养至 50ml LB+Apr 50μg/ml。 b) 浓缩：每 50ml 的培养物浓缩到 5ml ，每 1.5ml 的离心管分 装1ml。
2. 准备链霉菌S. lividans ZX1的孢子
将链霉菌孢子用 TSB 清洗两遍，再用 TSB 悬浮，每 1.5ml 的 离心管分装100ul。（需要现做现用）
操作步骤（第一天）
1. 清洗E. coli S17-1(pSET152），以除去残留的抗生素。 每组同学取 1支装有 1ml 浓缩的 E. coli S17-1(pSET152 ）， 用无菌水清洗。先将1ml的菌液用12000 rpm/min，离心1 min， 然后迅速到超净工作台倒去上清液。加入 1ml 的无菌水，在 振荡器上将菌体打散混匀后，同样用12000 rpm/min，离心1 min。重复以上操作三次，最后将菌体用1ml的无菌水悬浮。 2. 孢子 每组同学拿一支准备好的孢子放入 50℃水浴锅进行热激处 理 10min 。然后转入 37℃水浴温浴培养 0.5-1 小时（预萌发）。 将预萌发好的孢子用LB培养基清洗三次，最后用100ul LB悬 浮。预萌发过程每四组找一个同学倒平板。 第一、三、五、七组的第一个同学融化 1瓶250ml的培养基， 倒平板10-11皿，供8个同学使用。
阿扎霉素F产生菌链霉菌211726基因转移系统的建立
阿扎霉素F产生菌链霉菌211726基因转移系统的建立马艳玲;刘富来;张敏;孙宇辉;洪葵【摘要】The objective of this study is to establish the gene transfer system of strain Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F,which can be used for genetic manipulations such as gene knock-out and expression of foreign genes. Intergeneric genetic transfer system of Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F was constructed by conjugating integrative plasmid pSET152 with pIB139. Results showed that 25 mg/mL apramycin may be used to efficiently screen conjugants. PCR verification revealed that exogenous plasmid was successfully integrated in the chromosomal DNA of Streptomyces sp. 211726. The continuous passage culture experiment demonstrated that transformed pSET152 and pIB139 of conjugants were stably inherited.%旨在建立阿扎霉素F产生菌链霉菌211726的基因转移系统，以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。
金色链霉菌接合转移体系的构建_方志锴
1
1． 1
材料与方法
材料
1．1．1
菌株与质粒 大肠杆菌 Top10 为基因克隆受体菌， 大肠杆菌 ET12567 （ pUZ8002 ） 为接合转移供体 菌， 金色链霉 菌 （ Streptomyces aureofaciens ） J13 为 接 合 转 移 受 体 菌， 以 上 菌 株 均 由 本 实 验 室 保 存． 质 粒
金色链霉菌对抗生素的敏感性试验
表1
Table 1 抗生素 卡那霉素 大观霉素 安普霉素
1）
为确定接合转移系统的筛选标记以选择合适的 载体， 考察了金色链霉菌对链霉菌筛选常用的 3 种 氨基糖苷类抗生素的敏感性（ 表 1 ） ． 从表 1 可见， 金 色链霉菌对所试抗生素均敏感， 其中卡那霉素对其 最小抑制浓度为 25 μg · mL ， 安普霉素的最小抑 －1 制浓度为 12． 5 μg · mL ． 故本研究确定以卡那霉 素抗 性 基 因 neo 为 筛 选 标 记． 该 结 果 也 证 明 了 pSET152 载体上安普霉素抗性基因 aac（ 3 ） Ⅳ的可用性． 2．2 接合转移质粒 pNEO152 的构建
相应的酶切位点：
） ； JH4： 5'-GATATC GTCGACAGATCTAACGCGACCTCCCGTCTCG3' （ EcoRV， Bgl Ⅱ） ； N1： 5'GAT 3' （ XhoⅠ GGTACC ACGTAGAAAGCCAGTCCG3' （ Kpn ） ； N2： 5'GCA CTCGAG AGAACTCCAGCATGAGATC3' （ Xho ）． Ⅰ Ⅰ 1．2．3 金色链霉菌的接合转移
福建农林大学学报（ 自然科学版） Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （ Natural Science Edition）
微生物菌株产生链霉素抗性基因的扩散分析研究
微生物菌株产生链霉素抗性基因的扩散分析研究链霉素是一种广谱抗生素，广泛用于人畜兽医领域，但随着其广泛使用，链霉素抗性菌株也逐渐出现，给人畜兽医的治疗带来了一定难度。
链霉素抗性基因的扩散使得治疗链霉素感染的药物选择更加有限，因此对其扩散进行研究对抗击其扩散具有重要意义。
1.微生物菌株产生链霉素抗性的原因链霉素抗性通常是由链霉素合成酶（MLS）类基因造成的，该类基因能够破坏链霉素的生物活性。
通常情况下，链霉素抗性菌株可通过两种途径产生，一种是通过内源性基因突变而形成，常见于肺炎链球菌；另一种是通过水平基因转移，常见于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等。
水平基因转移是指不同菌株间以及不同物种间的基因交换。
在这个过程中，基因可通过转移元件如整合子、质粒和转座子等，在不同菌株间传播，并且快速演化。
由于这些转移元件广泛存在于不同的细菌中，使链霉素抗性基因极易扩散。
2.链霉素抗性基因扩散的机制链霉素抗性基因在不同细菌中的扩散主要有三种机制：水平基因转移，基因突变和基因扩增。
（1）水平基因转移水平基因转移是链霉素抗性基因在细菌间的主要扩散途径。
其中质粒是常见的转移元件之一。
许多链霉素抗性基因经常被编码在质粒中，包括ermB、ermC、ermF 和 msrA等。
质粒在不同菌株间的传输速度极快，因此很容易导致链霉素抗性基因发生水平转移。
此外，整合子和转座子也是途径之一。
（2）基因突变基因突变是指链霉素抗性基因在细胞内的变异引起生物学性质的变化。
在细胞的多代历程中，由于DNA复制发生错误，有极小的几率导致颠倒突变或单核苷酸多态性（SNPs）。
这种突变机制也可导致同时感染的细菌群中的基因互相抵消。
（3）基因扩增基因扩增是指在一些细菌中，通过复制、插入、重组等机制使得链霉素抗性基因增加并向后传递。
例如，啤酒酵母菌在链霉素抗性中，通常以反平行方向复制，进一步扩大链霉素抗性。
3.扩散的影响链霉素抗性基因在微生物群落中的扩散不仅导致临床表现上链霉素抗性的出现，还会影响到微生物系统本身。
螺旋链霉菌遗传操作系统-接合转移体系的建立
中国生物工程杂志China Biotechn〇l〇gy，2021，41 (2/3) :45-52D O I：10. 13523/j.c b.2010009螺旋链霉菌遗传操作系统-接合转移体系的建立王优蓓1郭思妤1常碧博2叶蕊芳1花强&(1华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室上海200237)(2河南天方药业股份有限公司驻马店463000)摘要背景：螺旋链霉菌（Sfreptomyces spiraTnyceiiciM)为国内螺旋每素（s p i ram y cin，S P M)的生产菌，但目前工业生产中螺旋链霉菌利用遗传操作进行基因改造还没有成功报道。
目的：建立螺旋链霉菌遗传操作系统，利用遗传改造的方法改变S P M的组分比例，降低S P M的分离成本。
方法：以大肠杆菌（Esc/ieric/iia c o h E T12567/p U Z8002)为供体，螺旋链霉菌为受体进行接合转移实验，建立螺旋链霉菌接合转移的遗传操作系统，并对影响接合转移效率的培养基种类、抗生素覆盖时间、供受体比例等条件进行优化。
结果：螺旋链霉菌不适合利用孢子进行接合转移，利用菌体进行接合转移时ISP4培养基为接合转移的最适培养基，供受体比例为103: 1得到的接合子数量最多，接合转移效率为丨.93 x l O—4，S P M中三种组分百分含量变化显著。
结论：实验首次建立了螺旋链霉菌接合转移的方法，利用菌体进行接合转移操作，简化了实验操作过程，并且利用C R I S R P/C a s9基因编辑系统成功阻断3-0-酰基转移酶基因，并在该位置导入cpC31整合位点a«B,为后续螺旋链霉菌的基因改造奠定了基础。
关键词螺旋链霉菌菌体接合转移螺旋霉竞中图分类号Q815螺旋霉素（spiramycin，S P M)是一种大环内酯类抗 生素,对革兰氏阳性菌具有明显抑制作用，并对某些革 兰氏阴性菌以及较难治疗的衣原体、支原体、弓形虫、隐孢子虫在某种程度上也具有抑制效果[1]。