熊果苷的研究

熊果苷的制备研究

周烽

【摘要】：熊果苷(Arbutin)化学名称为对羟基苯-B-D-吡喃葡萄糖苷(p-Hydroxyphenyl-β-D-gl ucopyranoside),最早发现于熊果叶中。熊果苷最初应用于药物中,有抗菌消炎的作用。自上世纪80年代,研究发现熊果苷作为酪氨酸酶的竞争抑制剂,能抑制黑素形成过程中关键酶酪氨酸酶的活性,因此有美白的效果。日本资生堂公司首先将熊果苷应用于美白化妆品中,目前国内外也有多家厂商将熊果苷添加于美白类化妆品中。熊果苷有很大的市场应用前景。本文对熊果苷的合成及其检测作了研究,主要内容如下: 1)建立了熊果苷高效薄层色谱(TLC)定性分析方法。薄层层析硅胶GF254为固定相,乙酸乙酯—甲醇—水(7-2-1,v/v/v)为展开剂,熊果苷和氢醌的R_f值分别为0.56和0.67。2)建立了化妆品和酶反应体系中熊果苷含量的反相高效液相色谱(HPLC)定量分析方法。建立了一套有效的萃取膏霜类化妆品中熊果苷的预处理方法,主要采用了氯仿—饱和氯化钠溶液(2:1,v/v)超声振荡萃取。高效液相色谱条件为固定相Apollo C18分析柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇—磷酸缓冲液(pH6.0)—冰醋酸(10:90: 1,v/v/v),检测波长为254nm。熊果苷的保留时间为5.2min,氢醌的保留时间为7.9min,达到基线分离。熊果苷的线性方程为A=175543X+1763.1,r~2=0.9959,线性范围为0.01～1g/L,最小检测限为24ng,加样回收率为96.15%;氢醌的线性方程为A=16772X-3380.8,r~2=0.9957,线性范围为0.01～1g/L,最小检测限为21ng。3)进行了以NaHCO_3为催化剂利用相转移催化反应合成熊果苷的中间体五乙酰熊果苷的研究。通过相转移催化剂溴化四丁基铵(TBAB),合成了关键中间产物五乙酰熊果苷,避免使用了昂贵及对环境污染严重的金属盐催化剂。整个反应的收率达到37.5%。4)对合成得到的熊果苷样品进行了结构鉴定研究。对样品的红外光谱、电喷雾质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱进行分析研究,对上述图谱的特征峰均作了较好的归属。5)进行了糖苷水解逆反应生物催化剂的筛选研究,首次发现杏仁糖苷酶可

【关键词】：熊果苷相转移催化糖苷酶合成

【学位授予单位】：南京工业大学

【学位级别】：硕士

【学位授予年份】：2005

【分类号】：O626.1

【DOI】：CNKI:CDMD:2.2005.129304

【目录】：

?摘要4-6

?ABSTRACT6-11

?第一章绪论11-25

? 1.1 熊果苷概述11-13

? 1.1.1 熊果苷及其资源分布11

? 1.1.2 熊果苷的应用11-13

? 1.2 熊果苷制备方法概述13-17

? 1.2.1 天然产物提取法14

? 1.2.2 植物组织培养法14-15

? 1.2.3 化学合成法15-16

? 1.2.4 酶转化法16-17

? 1.3 非水相中糖苷酶催化的研究进展17-23

? 1.3.1 非水介质中的酶催化17-21

? 1.3.2 糖苷酶的研究进展21-23

? 1.4 本课题的研究目的及意义23-24

? 1.5 本课题的主要研究内容24-25

?第二章熊果苷定性定量分析方法的研究25-33

? 2.1 熊果苷薄层色谱定性分析方法的建立25-27

? 2.1.1 实验部分25-27

? 2.1.2 实验结果与讨论27

? 2.2 化妆品中同时检测熊果苷和氢醌HPLC定量分析方法的建立27-32 ? 2.2.1 实验部分28-29

? 2.2.2 实验结果与讨论29-32

? 2.3 酶反应体系中熊果苷以及氢醌含量的HPLC分析方法32-33

? 2.3.1 实验部分32

? 2.3.2 实验结果与讨论32-33

?第三章相转移催化法合成熊果苷33-45

? 3.1 相转移催化33-34

? 3.1.1 相转移催化简介33-34

? 3.1.2 相转移催化反应在有机合成中的应用34

? 3.2 相转移催化合成熊果苷的实验过程34-37

? 3.2.1 仪器和药品34-35

? 3.2.2 实验操作及结果35-37

? 3.3 实验讨论37-39

? 3.4 产物的谱图分析39-45

? 3.4.1 熊果苷的红外图谱39-40

? 3.4.2 熊果苷的氢谱40-42

? 3.4.3 熊果苷的碳谱42-43

? 3.4.4 熊果苷的质谱43-45

?第四章酶法催化合成熊果苷的探索45-60

? 4.1 酶源的获得45-48

? 4.1.1 从微生物中提取粗酶液45-48

? 4.1.2 从苦杏仁种子中提取粗酶粉48

? 4.2 β-葡萄糖苷酶活性测定48-49

? 4.2.1 实验过程48-49

? 4.2.2 实验结果与讨论49

? 4.3 β-葡萄糖苷酶的热稳定性49-51

? 4.3.1 实验过程49-50

? 4.3.2 实验结果与讨论50-51

? 4.4 β-葡萄糖苷酶对有机溶剂的耐受性51-52 ? 4.4.1 实验过程51

? 4.4.2 实验结果与讨论51-52

? 4.5 酶法催化合成熊果苷52-58

? 4.5.1 材料与方法52

? 4.5.2 实验过程52-54

? 4.5.3 结果与讨论54-58

? 4.6 本章结论58-60

?第五章总结与展望60-63

? 5.1 本研究的主要结论60-61

? 5.2 今后工作展望61-63

?参考文献63-68

?成果68-69

合成熊果苷的色谱指纹图谱分析

摘要：建立了合成熊果苷的高效液相色谱-紫外光谱-质谱指纹图谱,发现熊果苷产品中主要存在两种杂质:原料对苯二酚和副产物,并对它们进行了定量分析。根据样品指纹图谱的整体相似程度估算了熊果苷杂质组成和含量的整体波动程度,据此可以方便准确地控制产品质量的一致性和稳定性。

关键词：熊果苷，对苯二酚，高效液相色谱，紫外光谱，液相色谱-质谱联用

中间体的生产是发展精细化工的基础,中间体在精细化学品市场占有超过60 %的份额,而为高端精细化学品度身定制的中间体具有相当高的利润率。中国正在成为世界上中间体的重要生产基地。中间体参与国际市场竞争的最重要的砝码是质量,产品质量未能得到有效的控制,一个重要的原因就是产品分析测试水平低下,造成时好时坏,影响客户的下游生产。为此,作者提出借鉴中药指纹图谱的经验,以杂质组学( Impuritomics) 的研究方式,建立精细化工中间体的色谱指纹图谱(Chromatographic fingerprint) ,作为控制中间体质量的一个关键指标。其定义为:精细化工中间体色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴别和测定手段。借助中间体中的杂质组学,控制中间体中杂质的种类及其含量,保证原料、中间产物和最终产品质量的一致性和稳定性,并符合法规或协议。其基本属性是“整体性”和“明确性”。本文是精细化工中间体色谱指纹图谱构建策略的一个实例。

熊果苷(对羟基苯- β- D - 吡喃葡萄糖苷, p -hydroxyphenyl - β- D - glucopyranoside ,arbutin) 是从植物中分离得到的一种成分,具有镇咳、利尿、抗菌、消毒等生物活性。近年来还发现熊果苷能有效抑制皮肤细胞中的酪氨酸酶,从而显著地减少皮肤中的色素沉积,可以祛除色斑和雀斑。目前,以熊果苷作为化妆品添加剂是一个新的热点,但从植物中提取熊果苷工艺复杂、产率低、成本高。以葡萄糖和对苯二酚为原料,用人工合成的方法制得的熊果苷克服了以上缺点。熊果苷的应用非常广泛,定量测定熊果苷的方法有较多报道,但测定熊果苷中对苯二酚及其它杂质含量的方法未见报道,而杂质的分布和含量同样是决定产品质量的重要因素。酚类物质对人体有很大的危害,由于渗透性强,可以通过皮肤、呼吸道粘膜、口腔等多种途径进入人体,并深入到内部组织,侵犯神经中枢,刺激骨髓,严重时可导致全身中毒和致癌,长期接触酚类物质还会出现皮肤疡痒、皮疹、贫血、记忆力减退等症状。因此国际市场上对熊果苷中对苯二酚的残留量有着严格的限制。用高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV) 定量测定了熊果苷样品中对苯二酚的含量,同时,用液相色谱-质谱联用(LC-MS) 的方法初步推断出熊果苷中一种主要未知杂质的可能结构式。通过对10 个不同批号熊果苷产品中杂质的测定,数据分析和统计,从而建立了熊果苷色谱,并利用相似度计算方法(欧氏距离) 对产品进行质量评价,可用于指导合成和纯化,控制产品质量。

1 实验部分

1. 1 仪器与试剂

Waters Alliance 2695 型高效液相色谱仪,配备真空脱气机,四元梯度泵,自动进样器,996 型二极管阵列(PDA) 检测器。色谱分离系统的控制和记录由Waters Millinium32色谱工作站完成。

Agilent 1100 LC-MSD 系统,配备电喷雾离子源(ESI) 在线真空脱气机,二元高压梯度泵,恒温自动进样器,二极管阵列检测器。系统的控制和记录由Agilent 化学工作站完成。

熊果苷对照品和样品(江苏鑫源生化科技发展有限公司) ;对苯二酚为分析纯;甲醇为色谱纯;冰乙酸为分析纯;高氯酸为优级纯;水为娃哈哈纯净水。

1. 2 操作条件

HPLC-色谱柱: Waters 公司的SymmetryC18(5μm ,4. 6 ×250 mm) ;流动相:甲醇/ 水/ 乙酸水溶液(体积浓度为1 %) = 5∶45∶50 ;流速:0. 8 mL/ min :柱温:30 ℃;检测波长:287 nm;进样量:10μL 。

LC-MS-正离子模式ESI( + ) ;扫描范围(m/ z) :50～600 ;传输电压:70 V ;干燥气(N2) 流速:10 L/ min ;喷雾气(N2) 压力:68. 78 kPa ;温度:350 ℃: 毛细管电压:400 V。

2 结果与讨论

2. 1 样品的色谱图和质谱图

在样品的色谱图(图1) 中,通过标准品对照可知峰2 为熊果苷,峰3 为对苯二酚。用液—质联用确定峰2 为熊果苷(图2) ,峰1 为未知杂质,对苯二酚的质谱峰没有出现,是因为酚类物质在正离子ESI 模式下响应很小的缘故。

2. 2 样品中对苯二酚含量的测定

准确称取对苯二酚标准品10 mg于10 mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,得标准储备液(浓度为1. 0 mg/ mL) 。分别精密移取储备液适量用水配成标准溶液系列(浓度为0. 000 04～0. 01 mg/ mL) ,各取10μL 进样。以峰面积为纵坐标对浓度作图,得线性良好的标准曲线,相关系数为0. 999 92 ,回归方程为A (area) = - 638. 430 7 + 1. 494 98 E7 C。当信噪比S/ N = 3 时,测得对苯二酚的最低检测限为0. 000 02mg/ mL 。准确称取5 份熊果苷样品约10 mg ,分别置于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,制成5 份样品溶液。每份溶液分别取10μL 各进样5 次,单份溶液分析结果见表1。5 份熊果苷样品中对苯二酚的平均含量为0. 012 7 % ,相对标准偏差(RSD) 为4.6 %。

2. 3 样品中未知杂质的鉴定

按质谱图(图2) ,对应于色谱图1 中峰2 的分子离子峰[M + NH4 ] + , [M + Na ] + , [M + K] + 分别为290.

1 ,295. 1 ,311. 0 ,说明该物质的相对分子质量为27

2 ,即熊果苷:对应于色谱图1 中峰1 的分子离子峰[M+ NH4 ] + , [M + Na ] + , [M + K] + 分别为452. 1 ,457. 1 ,474. 0 (图3) ,可知该未知杂质的相对分子质量为434 ,根据熊果苷的合成路线推断它的分子式为C18H26O12 (可能的结构式有多种,比如图4 中的a ,b ,c ,d) ,其中a ,b ,c 是葡萄糖分子在反应前先二聚或转型后二聚得到二糖,再与对苯二酚反应得到的产物,这些产物在文献中均已有报道,它们在化妆品中的功效与熊果苷类似,甚至更强; d 是由两个葡萄糖分子分别与对苯二酚分子中的两个羟基反应生成的产物,在文献中尚未见有报道。限于熊果苷样品中该未知杂质的量极低,我们尚不能判断其准确结构,但这对指纹图谱的建立没有影响。

2. 4 熊果苷的指纹图谱

2. 4. 1 不同批号熊果苷样品的指纹图谱的比较不同批号的10 个熊果苷样品的色谱指纹图谱如图5 所示,从图中可以看出,熊果苷样品的图谱较为相似。我们从中选出3 个共有峰作为其特征峰(见图1) ,其中峰1 可依据质谱鉴别,相对分子质量为434 (图3) ,峰3 对苯二酚则借助紫外光谱(图6 - b) 定性。这些峰在所有的样品都有,但也存在差异,见图5。

2. 4. 2 相似度计算

图1 中的主峰(峰2) 是熊果苷,我们主要考虑杂质峰的差异,对10 个批号熊果苷样品的两个杂质峰进行积分,得到峰面积。对苯二酚的百分含量通过对照品由外标法得到,而峰2 代表的杂质(C18H26O12) 由于没有标准物质,用其峰面积与主峰面积之比( %) 表示,然后据此计算欧氏距离相似度,结果见表2。

在满意相似度的基础上,再进行其它指标的测定,可以确保产品质量的稳定性和一致性。

2. 5 高效液相色谱条件选择

2. 5. 1 流动相的选择

考虑到熊果苷和对苯二酚在结构上都有酚羟基,在水溶液中容易离解导致峰型畸变,无法分离,用1 %的乙酸溶液或0. 2 %的高氯酸溶液抑制其离解,效果均比较好,峰形比较尖锐,但由于高氯酸难挥发,不适合做液相色谱—质谱联用,而乙酸做液-质联用不存在这个问题,因此本实验在流动相中选用乙酸而不用高氯酸。经过试验,当V甲醇∶V 水∶V1 %水溶液= 5∶45∶50 时,各成分能在适宜时间内得到清晰的分离。

2. 5. 2 检测波长的确定

对照熊果苷和对苯二酚的紫外吸收图,考虑到待测对苯二酚的含量较低,选择对苯二酚吸收较强的波长287 nm 作为检测波长。

3 结论

本文建立了用高效液相色谱测定合成熊果苷中对苯二酚含量的方法,还通过LC-MS 联用技术得到了熊果苷中未知杂质的分子式,并初步推断了它的可能结构式。本方法操作简单,结果准确可靠,适合同时测定熊果苷及其中对苯二酚和其他杂质的含量,进而建立了熊果苷的指纹图谱。

精细化工中间体指纹图谱可以被视为产品质量的一个特征性指标,如果一个样品指纹图谱出现了严重偏离,显示产品质量出现了问题,其它的质量指标就可以不用再去测试,指纹图谱在精细化工中间体质量控制方面具有不可替代的地位。

嗜麦芽黄单胞菌固定化细胞催化合成α-熊果苷

王秀捧

【摘要】：α-熊果苷，是一种新兴的无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质。它比β-熊果苷美白效果更好，更安全。本论文探讨利用嗜麦芽黄单胞菌BT—112(Xanthomona s maltophilia BT—112)，采用发酵法、游离细胞法、固定化细胞方法三种不同体系生物合成α-熊果苷，并对三种方法的反应转化率及产物α-熊果苷的浓度进行了比较。利用嗜麦芽黄单胞菌BT—112催化合成α-熊果苷的方法具有原料简单，反应条件容易控制，反应周期短，产物纯度高，生产过程中不使用有毒有害的有机溶剂等优点，因此具有重要的工业化意义。本论文系统地对上述三种反应体系反应条件进行了优化，得出结论(以1L反应体系为基准)：通过对发酵法产α-熊果苷反应条件的研究，确定了发酵法产α-熊果苷最佳反应条件为：反应温度为35℃，对苯二酚浓度为48mmol·L~(-1)，蔗糖与对苯二酚的摩尔比为2：1，反应时间为48h，反应转速为180 r·min~(-1)，最高反应转化率为91.2％；研究游离细胞催化法生产熊果苷的反应条件，确定了最佳反应条件为：温度25℃，对苯二酚浓度30mmol·L ~(-1)，蔗糖和对苯二酚摩尔比为20，反应时间为40h，转速为160r·min~(-1)，细胞浓度为8 5g·L~(-1)，缓冲溶液浓度为pH8.0、25 mmol·L~(-1)的磷酸缓冲溶液，最高反应转化率为86. 7％；探讨固定化细胞生产α-熊果苷的固定化条件和固定化细胞转化对苯二酚为α-熊果苷的反应条件，得出最佳固定化条件为：海藻酸钠浓度为50 g·L~(-1)，细胞浓度为120 g·L~(-1)，钙离子浓度为20 g·L~(-1)。最佳反应条件：温度为22℃，缓冲液pH为7.0，反应时间为3 6h，固液比为15：35，增效剂为曲拉通—100，浓度为0.85g·L~(-1)；对苯二酚浓度为40 m mol·L~(-1)，最高反应转化率为89.8％。

熊果苷研究及应用进展

[关键词]：熊果苷,止咳平喘,抗炎,抗氧化

健康网讯：

熊果苷（atbutin）是从多种种属植物分离得到的天然活性物质，化学名为4-羟苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（简称熊果苷）。其具有止咳平喘及皮肤增白作用，在临床应用广泛。近年来由于其良好的美白效果，受到了国际医疗美容行业的普遍关注。现就其研究及应用情况作一综述。

1 熊果苷的来源及制备方法

1.1 植物提取从植物中提取的一般为β-熊果苷。早在1930年就有报道，厚叶岩白菜叶中含有熊果苷，以后相继在乌饭树、熊果和梨树的叶中发现熊果苷。近几年，国内外研究者陆续从以下植物不同部位中分离得到熊果苷：如蔷薇科植物Pyrus baugaeana的气生部分；药用植物鸡树条的果实、树皮、叶和根；菊科兔耳风属植物杏香兔耳风；蔷薇科腺肋花楸属植物黑果腺肋花揪；大戟科黑面种属植物喙果黑面神；木樨科植物女贞的叶；蕨类卷柏的全草；菊科大丁草属植物毛大丁草；虎耳草科岩白菜属植物秦岭岩白菜的根状茎；茜草科植物鸡矢藤的全草；玄参科腹水草属植物爬岩红；杜鹃花科植物越桔的叶；百合科菝挈属植物黑叶菝挈。

1.2 生物转化法生物转化法是利用生物体中的酶体系将原料进行转化，生成特定的产物。细胞或组织培养都可用于熊果苷的转化。采用长春花细胞悬浮培养体系转化氢醌生成熊果苷，具有较高的转化率，每升细胞悬浮液可得到9g纯的熊果苷。采用高密度的萝芙木碱细胞悬浮液，熊果苷积累量可达18g/L。 DVSkOVa在五味子培养液中加入引导物熊果苷及对苯二酚，利用植物体进行生物转化生成更多的熊果苷。国内有人采用人参毛状根培养体系将外源氢醌转化为熊果苷，能获得熊果苷占干物质量的13%的人参毛状根，转化率89%。也可应用悬浮培养转基因西洋参冠瘿组织生物合成熊果苷，其摩尔转化率最高为 88.4％，产物量达到63.69mg/瓶。

1.3 酶合成法糖基转移酶和糖苷酶可以用于合成熊果苷。研究表明：蔗糖磷酸化酶可以将蔗糖中的葡萄糖基转移至氢醌上，立体专一性的生成α-熊果苷。Iqbal采用新的酶促反应介质，每克反应混合物可得到0.488的熊果苷，产率可达65%。酶法合成符合环保要求，对于合成α-熊果苷独具优势，因此吸引了许多研究者的兴趣，相信今后会有更多新的成果应用于实际。

1.4 有机合成法熊果苷化学合成的一般程序是由葡萄糖和氢醌在适当的保护后，进行糖苷化反应，然后脱保护而得。根据反应中糖基给体的不同，可以分为两类合成方法：①以糖基溴苷为给体的合成方法 (Koenigs-Know法)；②以酰基为给体的合成方法 (Helferic h法)。早期熊果苷合成法的缺点是要使用大量的银盐。彭师奇等在碱性条件下以丙酮和水做溶剂，可不使用昂贵的银盐。姚斌以五乙酰葡萄糖、对苯二酚为起始原料进行合成，降低了成本，产率达到40.8%。wang以四-O-苯基-α-D-葡萄吡喃糖三氯亚氨逐乙酸酯为糖基供体，与对苯二酚在三甲硅烷基三氟甲基磺酰化物的催化下高度立体选择性地生成4-羟苯基-2,3,4,6-四-0-苯基-α-D -葡萄吡喃糖苷，脱保护后即成α-熊果苷。

2 熊果普的生理活性及作用机理

2.1 抗炎、抑菌作用熊果叶具有抗炎、抑菌作用，传统上用于治疗尿路感染，其中熊果苷是其主要药效成分。

2.2 镇咳、祛痰、平喘作用熊果苷灌胃可增加动物气管分泌、延长氨水引咳潜伏期、咳嗽次数减少、气管酚红排泌量明显增多。200mg/kg剂量能延长哮喘潜伏期；20mg/ml剂量能极显著地对抗豚鼠离体气管条的收缩。在抗炎、祛痰、镇咳三种作用中，熊果苷的镇咳效果尤其好。但到目前为止，其抗炎、止咳、祛痰的机理尚未见报道。

2.3 美白作用国内外绝大多数学者均报道熊果苷具有美白活性，其美白机理为熊果苷对酪氨酸酶产生竞争性及可逆性抑制，从而阻断多巴及多巴酿的合成，进而抑制黑色素的生成，达到美白效果。但熊果苷不影响酪氨酸酶的表达和合成。熊果苷细胞毒性很低，其不

影响人黑色素瘤细胞生长的最高浓度为 100mg/ml。在此浓度下，5d后20%黑色素合成受到抑制，且抑制作用呈剂量依赖性。

也有其他学者经研究后得出与上述不同的结论。这种差异可能与熊果苷使用浓度及试验条件有关，并有待于进一步证实。如Nakajima研究表明，熊果苷在浓度0.5～8mM范围内能够使培养的人黑色素瘤中的色素增加，但这种黑色素的增加不是通过增强酪氨酸酶活性来介导的，其机理尚在探讨中。宋琦如报道熊果苷在浓度10～l00μg/ml具有明显的细胞毒性，可抑制细胞增殖和黑素合成，其美白机制与酪氨酸酶活性改变的关系不大，可能与损伤细胞膜和抑制黑素合成有关。

α-熊果苷是β-熊果苷的差向异构体，其化学名为4-羟苯基-α-D-毗喃葡萄糖苷。α-熊果苷能够显著降低黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性，使黑色素降至对照组的76%。205mg剂量能够使皮肤黑色素降至对照组的40%，而且不影响细胞的生存活性。α -熊果苷抑制强度为β-熊果苷的10倍。

2.4 抗氧化作用董钦采用体外培养人脐静脉内皮细胞ECV2304观察熊果苷对细胞的保护作用。结果表明熊果苷可以抵御H2O2所致ECV2304细胞氧化应激损伤。

3 熊果苷的体内代谢

给健康志愿者口服熊果叶（主要成分是熊果苷）的提取物水溶液，可见尿中排泄出对苯二酚葡萄糖苷酸、对苯二酚硫酸盐及对苯二酚。约超过半数的熊果苷在服用后4h内主要以对苯二酚葡萄糖苷酸和对苯二酚硫酸盐的形式从尿中排泄出来。75%的熊果苷在服用后24h 内被排泄出去。

给两组健康志愿者口服由熊果叶提取物制成薄膜衣片和水溶液。薄膜衣片组尿中有相当于熊果苷总量 64.8％的对苯二酚被排泄出来，水溶液组有66.7%被排泄出来。两组的主要药动学参数如下，C max= 1.6893,1.1250mmol/ml；t max=3.60、4.40h；薄膜衣片组相对于水溶

液组的生物利用度为103.3%。两组的代谢物成分未见差异，均为对苯二酚、对苯二酚葡萄糖苷酸、对苯二酚硫酸盐。

4 熊果苷的分析检测方法

4.1 高效液相色谱法Thongchai采用此法测定了几种皮肤美白剂和药用植物提取物中的熊果苷。分析条件:ODS Hypersil C18柱；流动相，水：甲醇:0.1M盐酸 (89:10:1，v/ v/v)；检测波长，222nm;线性范围0.5～ 30.0μg/ml；检测限0.02μg/ml。证明该方法是一种快速、简单常规的分析方法。张婷采用该法测定熊果苷凝胶中熊果苷的含量。分析条件：甲醇：水(20:80)，检测波长282nm，苯酚为内标物，线性范围，5～160μg/ ml。Lin采用在线微渗析取样联合高效液相检测美白化妆品中的熊果苷。将探针放入化妆品中，探针长度l0mm，渗析流速5μl/min，线性范围在0.1～20mM, 检测限为15μM。同非在线方法相比，在线方法更简便、可靠，减少样品的前处理及有机溶剂的使用，对于商业用化妆品来说，可作为常规分析方法。

4.2 分光光度法方法1：在熊果苷溶液中定量加入高碘酸和碘酸盐，在pH8.0时，过量的高碘酸能够使碘游离出来，通过测定游离碘的含量，求出未反应的高碘酸的含量，即可求出熊果苷的含量。线性范围在25～ 125μg/ml，最低检测限为25μg/ml，方法回收率为 100.86%。方法2：在熊果苷溶液中定量加入三氯化铁溶液，溶液即变为黄绿色，此时可进行分光光度测定，进而求出熊果苷含量。

4.3 薄层扫描法用于测定不同种鹿衔草中高熊果酚苷的含量。点样量在1.004～20. 08μg范围内线性关系良好。回收率为97.33%, RSD为1.70%。该方法灵敏、简便、准确，可借鉴应用到熊果苷的检测上。

4.4 毛细管电泳法陈瓒光采用该法测定鸡矢藤中熊果苷含量。电泳条件：毛细管2μm～id×60 cm，缓冲溶液Tris-H3B03（15:5 mmol/L），位差（2:0 cm）虹吸进样10.0s，

分离电压18.0 kV。检测条件：三电极系统直流恒电位安培检测，检测电位0.8 V（vs.SCE）。线性范围在1×10g/ml～200×1Og/ml,检出限 0.3×10-6g/mL。

5 熊果苷与其他常用美白剂美白活性及毒性比较

5.1 与美白化学物质比较熊果苷和维生素C钠盐 (VC～Na)（浓度分别为0.05～0.3 mmol/L，0.10～ 2.40mmol/L）均对黑色素有抑制作用，并有一定的细胞毒性。同曲酸、BL～99、氢醌酯相比，熊果苷对细胞生长的抑制作用最弱。在实际使用时建议熊果苷以低于70μg/ml的剂量为宜。几种合成的姜酚类化合物对酪氨酸酶的抑制活性均大于熊果苷。总体来说，与化学物质比较熊果苷对细胞的毒性最低。

5.2 与美白中药及有效成分比较经报道，多数中药提取物与熊果苷相比美白活性略高。熊果苷、18α-甘草酸双胺盐及氢醌的美白活性与细胞毒性，结果发现 3种化合物均显示有抑制黑素生成的作用。氢醌浓度超过5μmol/L时能明显抑制细胞增殖，其细胞毒性远远大于其他两种物质。熊果苷与甘草黄酮均对酪氨酸酶活性有抑制作用，且呈浓度依赖性，但甘草黄酮比熊果苷毒性低。

芦荟苦素（IC50约0.5g/L）比熊果苷（IC50约0.8g/L) 美白活性高，而毒性比熊果苷略高。10μg/ml浓度的桂枝提取物对黑色素的抑制作用强于20μg/ml浓度的熊果苷，其机理是通过抑制酪氨酸酶mRNA的表达其氧化活性。川芎、威灵仙、桂枝、麦门冬、白果、藁本、红花、白苏叶的醇提物，五倍子的水提物对黑色素的抑制作用强于相同浓度熊果苷。其中五倍子、威灵仙、白果、川芎在共培养中作用效果更为显著。与熊果苷相比，裙带菜和昆布的海藻多糖对黑色素细胞活力几乎无影响，而熊果苷对黑色素的抑制作用高于海藻多糖。

6 熊果苷的衍生物合成及活性

Sugimoto K通过糖苷化反应合成了两种熊果苷-α-配糖体，分别是4-羟苯基-β-麦芽糖苷，4- 羟苯基-β-麦芽糖三苷。二者对人酪氨酸酶表现出竞争性抑制，其有效浓度分别为0.7mM、0.9mM。抑制作用强于熊果苷，但低于α-熊果苷。

Tokiwa用酶法合成了熊果苷十一碳烯酸酯，美白效果强于熊果苷。当用儿茶酚为底物时，熊果苷酯的IC50为熊果苷的1％。当用苯酚做底物时，其IC50为熊果苷的10%。其机理为熊果苷醋能够抑制酪氨酸酶反应后期，其中包括羟基化作用和氧化作用。

去氧熊果苷（dA）能有效地抑制酪氨酸酶活性，降低黑色素的生成，比对苯二酚作用强10倍，比熊果苷强350倍。其毒性比对苯二酚低4倍。是一种安全有效、可逆的酪氨酸酶抑制剂。

7 熊果苷药用制荆、美白产品及其临床应用

7.1 具有抗炎、镇咳、平喘功效的制剂高天兵采用熊果叶和南瓜子油等制成消炎利尿胶囊，用于治疗急、慢性膀胱炎等症，并用高效液相法测定了胶囊中熊果苷的含量。此外还有人从越桔中提取出治疗急、慢性气管炎的药用有效部位，并制成中药五类新药，目前已进人临床试验阶段。其中主要药效成分之一即为熊果苷。

7.2 具有美白效果的制剂及化妆品

7.2.1 脂质体Wen采用膜分散法制备几种熊果苷脂质体。包封率介于4.35％～17.6 3％之间，粒径范围在179.9～212.8nm。与溶液剂比较，虽然熊果苷脂质体的渗透性降低，但其在表皮／真皮层的沉积率增力口。

7.2.2 涂膜剂以乳剂配制方法，以高分子聚乙烯醇为成膜材料，加人氮酮为渗透剂，制成复方熊果苷乳膜，用于临床黄褐斑的治疗。并以2%氢醌霜为对照品。结果表明，制剂性质稳定，光滑易涂布，成膜与脱膜性能优良，未发现不良反应。总有效率87.9%，明显优于对照组。有人采用同样成膜材料，加入熊果苷和中药提取液制成涂膜剂。临床用于治疗黄褐斑，总有效率96.9%。未发现不良反应。

7.2.3 霜剂“雪夫”复方霜剂含全反式维A酸、熊果苷、维E，用于治疗黄褐斑。临床观察表明，治疗组总有效率为77.6%，对照组总有效率为26.5%。淡明斌采用3.5%～4%

熊果苷与数味中药（白芷、黄芪等）制成祛斑霜，用于治疗黄褐斑，临床观察总有效率为8 3.0%。并且无一例有不良反应。夏云稳对48 例黄褐斑患者运用内服中药及维C、维E，外用3%熊果苷霜治疗，治疗3个疗程，总有效率81.25％。

7.2.4 化妆品国际上，多个国家已将熊果苷应用到化妆品中，起到美白的效果。如日本的国际知名品牌资生堂、DHC等。国内也有很多化妆品添加熊果苷，如丁家宜品牌美白系列化妆品。报道的有伊柔美白洁面乳，内含熊果苷，在洗净的同时兼有美白的作用。

总之，随着研究的深入，熊果苷的性质和功用已被人们了解得越来越多，它也越来越广泛地被应用在医疗和美容行业上。遗憾的是，现在人们普遍注重其美白功效，对它的抗炎、镇咳、平喘的功能还没有给予足够的重视，含有熊果苷的天然植物及中草药很少有被开发成具有相关功效的中成药。因此，熊果苷及含有该成分的天然药物、中草药在这方面还有无限的潜力可挖。