实验8 植物可溶性糖的测定
实验8-可溶性总糖的测定(蒽酮法)
一、实验目的
掌握蒽酮法测定可溶性糖含量 的原理和方法。
二、实验原理
强酸可使糖类脱水成糖醛或羟甲基糖醛，生 成的糖醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成 糖醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在630nm处有 最大吸收。在10－100μg范围内其颜色的深浅 与可溶性糖含量成正比。 这一方法有很高的灵敏度，糖含量在３0μg 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。 一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、实验器材
１、仪器：分光光度计 ２、试剂 1%蔗糖标准液：P110 100ug/L蔗糖标准液：P110 浓硫酸； 蒽酮乙酸乙酯试剂：1g 蒽酮溶于50 mL 乙酸 乙酯中，贮藏在棕中可溶性糖的提取与测定 （1）可溶性糖提取：将干净植物叶片剪碎混匀，准确称取0.１0 克-0.30g3份（三个平行），放入刻度试管中，管内加入510ml蒸馏水，盖上塞子，沸水中提取30min，提取液过滤至 25ml容量瓶，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。 （2）测定：吸取0.5ml提取液于大试管中，加入蒸馏水1.5ml,加 入蒽酮乙酸乙酯试剂0.5ml和5ml浓硫酸，混匀，盖上塞子， 沸水浴中准确保温1min取出，自然冷却至室温，在630nm波长 下比色。
2、蔗糖标准曲线的制作
（1）取6支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度 的蔗糖溶液：
管号
水（ml） 蔗糖含量（μg）
0
2 0
1
0.2 1.8 20
2
0.4 1.6 40
3
0.6 1.4 60
4
0.8 1.2 80
5
1.0 1.0 100
100ug/L蔗糖标准液（ml） 0
（2）在每支试管中立即加入蒽酮乙酸乙酯试剂0.5ml 和5ml浓硫酸，混匀，盖上塞子，沸水浴中准确保温 1min取出，自然冷却至室温，在630nm波长下比色。 以标准蔗糖含量作横坐标，以吸光值作纵坐标作标 准曲线。
植物体内可溶性糖含量的测定
植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）2010-04-04 22:43:32 来源：易生物实验浏览次数：221 网友评论0 条糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
关键词：可溶性测定含量植物可溶性糖含量测定蒽酮法solublesugar新陈代谢一、目的：糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
二、原理糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，反应如下：糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。
此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。
三、实验材料、仪器及试剂1．材料：白菜叶、柑桔2．仪器：分光光度计恒温水箱20ml具塞刻度试管（3支）漏斗100ml容量瓶刻度试管试管架剪刀研钵3．试剂：（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。
（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1．葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。
在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
2．样品中可溶性糖的提取称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。
植物体内可溶性糖含量的测定
植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
一、目的：糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
二、原理糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，反应如下：糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。
此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。
三、实验材料、仪器及试剂1．材料：植物组织叶片2．仪器：分光光度计恒温水箱20ml具塞刻度试管（3支）漏斗100ml 容量瓶刻度试管试管架剪刀研钵3．试剂：（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。
（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1．葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。
在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（O D），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
2．样品中可溶性糖的提取称取1克叶片，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。
置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
植物组织可溶性糖的测定
植物组织中可溶性糖与淀粉的测定植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。
一、苯酚法测定可溶性糖【原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。
苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100Mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nM波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定时间在160Min以上。
【仪器与用具】分光光度计；电炉；铝锅；20Ml刻度试管；刻度吸管5Ml 1支，1Ml 2支；记号笔；吸水纸适量。
【试剂】90％苯酚溶液：称取90g苯酚(AR)，加蒸馏水10Ml溶解，在室温下可保存数月；9％苯酚溶液：取3Ml 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30Ml，现配现用；浓硫酸(比重1.84)；1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。
加少量水溶解，移入100Ml容量瓶中，加入0.5Ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；100μg／L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1Ml加入100Ml容量瓶中，加水定容。
【方法】1.标准曲线的制作取20Ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表1－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1Ml 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20s时间加入5Ml浓硫酸，摇匀。
比色液总体积为8Ml，在恒温下放置30Min，显色。
然后以空白为对照，在485nM波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
表1-1各试管加入溶液和水的量试管 1 2 3 4 5 6100ug/L蔗糖液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0水（ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0苯酚（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0浓硫酸（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0蔗糖量（μg）0 20 40 60 80 1002.可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5～10Ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30Min(提取2次)，提取液过滤入25Ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
植物中可溶性糖含量的测定
一、原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
表24-2苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量
试剂
100μg/L蔗糖标准液
（mL）
蒸馏水（mL）
蔗糖量（μg）管号00
2.0
01、2
0.2
1.8
203、4
0.4
1.6
405、6
0.6
1.4
607、8
0.8
1.2
809、10
1.0
1.
01002．可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.1～0.3 g,共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5～10 mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2次），提取液过滤入25 mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
实验8 植物可溶性糖的测定
测定蔗糖
不预处理
间苯二酚比色法
测定果糖
葡萄糖氧化酶法
测定葡萄糖
利用实验间隙，观看视频材料：
《用一种生物材料设计一组生物实验的方法》
1、应用此法测得的糖具体包括哪几种糖类？
2、用此法测定时，什么样的材料需要用活性碳脱色？
3、请设计一实验，用本实验获得的同一份提取液在测 定可溶性糖含量的同时，一并测定蔗糖、葡萄糖和果 糖？这种测定方法比分别测定有什么优点？
蒽酮比色法
测定可溶性总糖
同 一 份 乙 醇 抽 提 液
预处理
间苯二酚比色法
3 绘制标准曲线：取标准葡萄糖溶液将其 稀释0、20、40、60、80μg/mL系列浓度， 按上述方法分别测其OD值，绘制标准曲线。
计算：
V 为植物样品提取液的体积 C 为提取液糖的浓度 W 为植物样重或为颗粒数 可溶性糖 % = CV/W 同一种子类型之间按每粒种子 计算
实验结果：
实验八
植物可溶性糖的测定
实验原理
糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再 与蒽酮作用生成绿色络合物，颜色 的深浅与糖含量有关，在625 nm波 长下OD值与糖含量成正比，由于蒽 酮试剂与糖反应的呈色强度随时间 变化，故必须在反应后立即在同一 时间内比色。
实验材料
小麦干种子 小麦萌发种子 萝卜干种子 萝卜萌发种子 均为市售，萌发条件为25℃ 下黑暗萌发3天。
实验步骤
1 可溶性糖的提取：
分别取2粒干种子和萌发种子于研 钵中，加80%乙醇少许，磨成匀浆，倒 入大试管中， 再用80%乙醇洗涤，水浴 80℃半小时，冷却后转移至10ml量筒， 并用80%乙醇定容至10ml。过滤，所得 的透明液体即为可溶性糖提取液。
植物组织中可溶性糖含量的测定
植物组织中可溶性糖含量的测定原理：糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。
实验材料任何植物鲜样或干样。
试剂80%乙醇葡萄糖标准溶液（100μg/mL）:准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL,使用时在稀释10倍（100μg/mL）。
蒽酮试剂称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2~3周。
仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管，剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉漏斗，滤纸。
实验步骤1.样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5~1.0g（或干样粉末5~100mg），放入大试管中，加入15mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20min，取出冷却，过滤入100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。
2.标准曲线制作取6支大试管，从0~5分别编号，按表加入各试剂。
表蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量试剂管号0 1 2 3 4 5100μg/mL葡萄糖溶液（mL）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1蒸馏水（mL） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0蒽酮试剂（mL） 5 5 5 5 5 5葡萄糖量（μg）0 20 40 60 80 100将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620nm波长下，用空白调零，测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（μg）为横坐标绘制标准曲线。
3.样品测定取待测样品提取液1.0mL加蒽酮试剂5mL，同以上操作显色测定光密度。
重复3次4.结果计算溶性糖含量（%）=从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积（ml）×样品重量（g）×106]/100 式中：C——从标准曲线查得葡萄糖量，μg。
植物可溶性糖的测定
植物组织可溶性总糖的测定2015-8-16一、目的：测定植物组织中总糖（可溶性碳水化合物），用以研究体内能量储藏和渗透物质积累情况，检测范围为10-100ug/ml。
因淀粉在超过45度可能糊化水解，如果已知样品含淀粉较多，应考虑70%乙醇提取或冷水提取（不包括淀粉）或1:4盐酸水解（包括淀粉）。
二、样品前处理：鲜样要称重后105度烘干，称干重，计算含水量，粉碎。
三、可溶性总糖的提取：干样测定完含水量后，称取样品0.25g，或鲜样2.50g，放入250ml 消煮管中，加水100ml，调整消煮炉温度约150-160度，煮沸30分钟，冷却，加水定容，取上清液过滤，滤液或离心上清液以水稀释适当倍数（5-10倍左右）待测。
注：西红柿总糖：取1ml匀浆，用水稀释1000倍，取2ml测定。
四、测定4.5.1试剂配制：4.5.1.1 80%硫酸：200ml水加入到1000ml烧杯中，在搅拌和水冷条件下，缓慢加入800ml浓硫酸，冷却备用。
4.5.1.2 蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到1000ml 80%（V/V）硫酸中，搅拌均匀，冷却后备用。
蒽酮试剂当日配制使用。
4.5.1.3 100μg/ml 葡萄糖标准液制作：称取0.0100g无水葡萄糖（分子量180.16）或者1水葡萄糖（分子量198.18）0.0110g溶于水中，加0.5ml浓硫酸，定容100ml。
4.5.2标准曲线浓度μg/ml(ppm) 0 20 40 60 80 100 样品ml葡萄糖标准液（ml） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 22 水 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0蒽酮试剂ml 84.5.3 总糖测定：取2ml提取液于试管中，在冷水浴中加8ml蒽酮试剂，沸水浴5分钟，取出迅速冷却，于625nm测定含糖量。
同时取上表标准液2ml加8ml蒽酮同样测定。
如果含糖量太低，可适当减低稀释倍数，如果糖含量太，可适当增加稀释倍数。
此方法适于含糖量1-10%样品的测定，如果超过此含量，需稀释后测定，低于此含量，需增加称量样品。
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3 绘制标准曲线：取标准葡萄糖溶液将其 稀释0、20、40、60、80μg/mL系列浓度， 按上述方法分别测其OD值，绘制标准曲线。
计算：
V 为植物样品提取液的体积 C 为提取液糖的浓度 W 为植物样重或为颗粒数 可溶性糖 % = CV/W 同一种子类型之间按每粒种子 计算
实验结果：
测定蔗糖
不预处理
间苯二酚比色法
测定果糖
葡萄糖氧化酶法
测定葡萄糖
利用实验间隙，观看视频材料：
《用一种生物材料测得的糖具体包括哪几种糖类？
2、用此法测定时，什么样的材料需要用活性碳脱色？
3、请设计一实验，用本实验获得的同一份提取液在测 定可溶性糖含量的同时，一并测定蔗糖、葡萄糖和果 糖？这种测定方法比分别测定有什么优点？
蒽酮比色法
测定可溶性总糖
同 一 份 乙 醇 抽 提 液
预处理
间苯二酚比色法
表1 不同种子和同一种子萌发前后可溶性糖含量变化
小麦种子 干种子 可溶性 糖含量 萌发种子 萝卜种子 干种子 萌发种 子
注意事项
1 定量实验，且涉及标准曲线绘 制，分光光度计的使用，因此溶 液配制、材料选取等方面必须精 确、仔细，减少误差。 2 实验组、对照组步骤应同步， 使结论准确。
问题：
实验步骤
1 可溶性糖的提取：
分别取2粒干种子和萌发种子于研 钵中，加80%乙醇少许，磨成匀浆，倒 入大试管中， 再用80%乙醇洗涤，水浴 80℃半小时，冷却后转移至10ml量筒， 并用80%乙醇定容至10ml。过滤，所得 的透明液体即为可溶性糖提取液。
2 显色及比色：吸取上述糖提取液1ml， 加入5ml蒽酮试剂，沸水浴10 min，冷却后 于625nm处测OD值，从标线取得提取液中 糖的浓度。
实验八
植物可溶性糖的测定
实验原理
糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再 与蒽酮作用生成绿色络合物，颜色 的深浅与糖含量有关，在625 nm波 长下OD值与糖含量成正比，由于蒽 酮试剂与糖反应的呈色强度随时间 变化，故必须在反应后立即在同一 时间内比色。
实验材料
小麦干种子 小麦萌发种子 萝卜干种子 萝卜萌发种子 均为市售，萌发条件为25℃ 下黑暗萌发3天。