真菌菌悬液的制备
菌悬液的制备方法
菌悬液的制备方法
菌悬液是一种用于培养微生物的液体培养基，它可以提供微生物生长所需的营养物质和水分。
制备菌悬液的方法相对简单，下面将介绍一种常用的菌悬液制备方法。
首先，准备所需材料和设备，蒸馏水、培养基粉末、试管或烧杯、移液管、称量器等。
然后，按照一定比例将培养基粉末加入到蒸馏水中。
通常情况下，培养基粉末的用量应根据所培养微生物的特性和需求来确定，一般建议按照厂家提供的配方比例进行配制。
在加入培养基粉末的过程中，需要充分搅拌使其充分溶解，以确保培养基的均匀性。
接着，将配制好的培养基溶液装入试管或烧杯中。
在装液体的容器上盖上适当的盖子或覆膜，以防止外界的污染和水分蒸发。
随后，对培养基溶液进行高温高压消毒。
将装有培养基溶液的容器放入高压灭菌锅中，进行121摄氏度、15分钟的高温高压消毒处理。
这一步骤是为了杀灭培养基中的细菌和真菌等有害微生物，以确保培养基的无菌性。
最后，将消毒后的培养基溶液冷却至室温。
在冷却过程中，需要注意避免外界的污染，以免影响培养基的质量。
待培养基溶液冷却至室温后，即可将其用于微生物的培养。
需要注意的是，制备菌悬液的过程中应严格遵守无菌操作规范，以确保培养基的质量和微生物培养的成功。
另外，在使用培养基前，应对其进行无菌性检测，以确保培养基的质量符合要求。
综上所述，菌悬液的制备方法并不复杂，但需要严格按照操作规范进行操作，以确保培养基的质量和微生物培养的成功。
希望本文介绍的菌悬液制备方法能够对您有所帮助。
菌悬液梯度稀释步骤
菌悬液梯度稀释步骤菌悬液梯度稀释是一种常用的实验方法，用于确定微生物悬液中微生物的浓度。
下面将详细介绍该实验的步骤。
1. 准备工作在开始实验之前，首先需要准备好所需的实验器材和试剂。
包括培养基、试管、移液器、标准溶液等。
确保实验环境干净整洁，并采取严格的无菌操作。
2. 制备菌悬液从培养基中挑取适当数量的菌落，将其转移到含有适量培养基的试管中。
通过摇床或培养箱，在适当的条件下培养菌落，使其达到合适的生长状态。
3. 稀释菌悬液将培养好的菌悬液取出一定体积（如1毫升），加入等体积的无菌生理盐水或稀释液中，充分混合。
这样就得到了一份菌悬液的稀释液。
4. 梯度稀释取一定体积的上一步得到的菌悬液稀释液（如0.1毫升），加入等体积的无菌生理盐水或稀释液中，充分混合。
重复此步骤，每次都取上一步的稀释液的一定体积进行稀释。
这样就得到了一系列不同浓度的菌悬液。
5. 接种培养基将每一种浓度的菌悬液分别接种到含有培养基的培养皿或试管中。
确保每种浓度都有足够的培养基供菌落生长。
6. 培养将接种好的培养皿或试管放入恰当的培养箱或恒温器中，以适当的温度和湿度进行培养。
培养的时间根据具体需要而定，可以是几小时或几天。
7. 结果观察培养结束后，观察每个培养皿或试管中的菌落形成情况。
根据菌落的数量和大小，可以初步判断菌悬液的浓度。
通过以上步骤，我们可以得到一系列不同浓度的菌悬液，从而进行后续实验或研究。
菌悬液梯度稀释是一种简单有效的方法，可用于各种微生物学实验。
通过合理操作和准确观察，可以得到可靠的实验结果，为后续研究提供有力支持。
希望这篇文章能帮助你了解菌悬液梯度稀释的步骤，并在实验中取得成功。
抑菌试验方案
（一）病虫害的制备
1、病虫害的采集
本实验所用材料分病原菌及害虫两类。
其中病原菌分别从宣木瓜和丹皮两种地道药材植物上采集。宣木瓜的病原菌本实验室已有，并且提取了单一菌种。丹皮方面需要我们查阅资料以及请教师姐，把握最佳采集时间和采集类型，然后我们进行实地考察以及集采。采集丹皮根部，连同根部泥土带回。
（二）抑菌实验———滤纸片法（细菌）
1、 菌悬液制备
将供试菌种在各自适合的斜面培养基上和适宜的温度条件下(细菌37℃,霉菌28℃)于培养箱中培养活化(细菌24 h,霉菌48 h),备用。将活化后的供试斜面培养基用10 mL无菌生理盐水稀释制成含菌量为106～108个/ mL的菌悬液。
2、丝瓜伤流液滤纸片的制备及处理
0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。
2.3划线法分离
2.3.1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。
2.3.2、划线
细滤纸,用钢笔套按一个圆印,剪下(一次剪4个),尽量剪圆。置于三角瓶中,塞上棉塞,高压蒸汽灭菌后浸泡于丝瓜伤流液中, 2 h后用无菌镊子夹出,在瓶口沥去多余丝瓜伤流液,即可贴入刚接种的器皿上。贴入时标记起始位置,按顺时针或逆时针方向将滤纸片顺序贴入。
3、抑菌试验
分别将配制好并已经灭菌的各种固体培养基趁热分别倒入无菌培养皿中,每皿15～20 mL(各皿量要相同),冷却凝固后用吸管吸取0.3 mL被试菌液,加到平皿上,用涂布棒涂布均匀。将灭菌的丝瓜伤流液滤纸片用无菌镊子夹取风干,放在含菌平板上,每皿3片,每种处理丝瓜伤流液做3次重复。细菌置于37℃培养24 h,霉菌置28℃培养48 h,测定滤纸片的抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。
实验七体外抑菌实验
03 实验结果
抑菌圈测量
抑菌圈大小
根据实验结果，测量并记 录各菌株对应的抑菌圈直 径，以评估抗菌物质的抑 菌效果。
抑菌圈对比
将不同菌株的抑菌圈进行 对比，分析抗菌物质对不 同菌株的抑制作用差异。
抑菌圈标准化
为确保实验结果的可靠性， 将抑菌圈直径标准化，以 消除实验操作和设备差异 对结果的影响。
数据记录与分析
数据整理
将实验过程中测量的数据整理成表格， 便于后续分析和对比。
数据分析
显著性检验
采用统计学方法对实验数据进行显著 性检验，以确定抗菌物质对各菌株的 抑制效果是否具有统计学上的显著差 异。
根据抑菌圈大小和其他相关指标，分 析抗菌物质对不同菌株的抑制作用。
结果展示
图表展示
利用图表（如柱状图、折线图等）直观展示实验结果，便于观察和分析。
实验操作步骤
1. 菌悬液制备
将实验菌种接种于适宜的培养基中， 培养至对数生长期，制备成一定浓度 的菌悬液。
2. 抗菌药物稀释
将抗菌药物用生理盐水或无菌水稀释 至所需浓度。
3. 抗菌活性测试
将菌悬液与稀释后的抗菌药物混合， 观察抗菌药物的抑菌效果。
4. ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ果记录
记录抑菌圈的大小、透明度等指标， 分析抗菌药物的抑菌效果。
结论总结
根据实验结果和数据分析，总结抗菌物质对各菌株的抑制作用，并给出相应的 结论和建议。
04 结论
结果总结
实验结果显示，不同浓度的抗菌剂对不同细菌的抑菌 效果存在差异。在一定浓度范围内，随着抗菌剂浓度
的增加，抑菌效果逐渐增强。
实验中使用的抗菌剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 的抑菌效果不同，表明不同细菌对抗菌剂的敏感性存
抑菌实验
一、菌种(一)、细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；(二)、真菌：啤酒酵母（Saccgaromyces cerevisiae）、米曲霉（Aspergillusoryzae）3402、黑曲霉（Aspergillus niger）、叶点霉（Phyllosticta maydis ）和刺盘孢霉（Colletotrichum musae）二、培养基（一）细菌培养液：LB液体：胰蛋白胨10.0g酵母提取物 5.0gNaCl 10.0g10mol/LNaOH 100μL蒸馏水定溶至1.0LpH 7.0~7.4如要配置固体LB培养基，加15.0g琼脂糖/L(二)、真菌培养液：马铃薯培养基(PDA)马铃薯(去皮切块) 200.0g葡萄糖 20.0g琼脂 18.0g，蒸馏水 1000mLpH 自然三、器材培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤(一)、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将保存菌种反复转种2次，使菌种新鲜，细菌置30℃，温箱培养1d，霉菌置27℃，温箱培养3d，备抗菌实验用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃，置旋涡混合器混匀。
3、倒平板在超净台里将培养基倒入平板，每板约15mL左右，水平放置，凝固后倒置放入30℃温箱中，2d后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新倒平板。
4、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。
5、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
实验12 常用菌种保存技术
实验12 常用菌种保存技术返回目录为保持细菌原有的性状和活力，通过人为方法提供一定的条件，使细菌在低温、干燥、缺氧的环境中，生长受到抑制、新陈代谢处于最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保存菌种的目的。
保存菌种的方法有很多，如斜面保存法、液体石蜡法、干燥保存法、液氮法、冷冻真空干燥法等。
这里仅介绍斜面保存法、液体石蜡法、冷冻真空干燥法。
一、斜面保存法【试剂与器材】1．菌种待保存的细菌、霉菌等。
2．培养基培养细菌、霉菌用斜面培养基。
【操作步骤】1．将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用纸将管塞部分包扎好，置4℃冰箱中保藏。
2．保存时间依微生物的种类各异。
霉菌、放线菌及有芽胞的细菌保存2～4个月转种一次，普通细菌最好每月转种一次，假单胞菌两周转种一次，酵母菌两个月转种一次。
【评价】本法操作简单、使用方便、不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。
缺点是保藏时间短、需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。
二、液体石蜡法【试剂与器材】1．菌种待保存的细菌,霉菌等。
2．培养基培养细菌、霉菌用培养基。
3．溶液或试剂液体石蜡。
4．仪器或其他用具无菌吸管，40℃温箱等。
【操作步骤】1．将液体石蜡分装于试管或三角烧瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎好，12l℃灭菌30min，然后放在40℃温箱中使水蒸发后备用。
2．将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养，直到生长良好。
3．用无菌吸管吸取无菌的液体石蜡，加入已生长良好的菌种斜面上，加入的石蜡高出斜面顶端1cm为宜，使菌种与空气隔绝。
4．将试管直立，置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比在冰箱中保存的时间还要长)。
【评价】此法实用而且效果较好。
产孢子的霉菌、放线菌、芽胞菌可保藏2年以上，有些酵母菌可保存1～2年，一般无芽胞细菌也可保存1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎奈瑟菌，在35℃～37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。
乳酸菌菌悬液的制备
乳酸菌菌悬液的制备乳酸菌菌悬液是一种含有益生菌的悬浮液，可以增加乳酸菌的存活率并使其更容易被吸收。
制备乳酸菌菌悬液需要进行以下步骤：1.选择乳酸菌菌株：乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，常见的有嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等。
在制备乳酸菌菌悬液时，需要选择耐受胃酸和胆盐的菌株，以提高存活率。
2.菌种的培养：将选好的乳酸菌菌株接种到适宜的培养基中，利用培养基中的营养物质为菌株提供营养。
同时，为了增加菌落数量，可以利用振荡培养或搅拌培养的方式进行培养。
3.菌液的收集：通过培养一段时间后，菌液中的菌株数量会增加。
此时，可以使用离心机将培养物与菌体分离，收集到菌液中。
4.菌液的悬浮：将收集到的菌液通过离心或过滤的方式除去大部分的培养基残留物，得到较为纯净的乳酸菌菌体。
然后，将乳酸菌菌体悬浮于适宜的溶液中，例如生理盐水、蔗糖溶液或甘油溶液中。
5.菌液的保存：乳酸菌菌悬液由于含有活菌，所以需要采取适当的保存方式，以保证其活性。
常用的保存方法有冷藏和冷冻。
冷藏保存在4摄氏度下，能够保持较长时间的活性；冷冻保存则需要将菌液转移到-20摄氏度或更低的温度。
6.产品的包装：最后一步是将乳酸菌菌悬液进行产品化。
可以将菌悬液灌装到药用注射器中，以便于用户使用。
同时，要在包装上注明保存和使用的方法，以保证用户正确使用。
在以上步骤中，关键的一点是保证乳酸菌菌株的活性。
为此，可以在培养过程中加入适量的保护剂，例如果糖、蔗糖等，以提高菌株对胃酸和胆盐的抵抗能力。
此外，在制备乳酸菌菌悬液时，应注意无菌操作，以避免菌液被其他微生物污染。
乳酸菌菌悬液的制备过程相对简单，但是需要仔细操作以保证菌株的活性。
通过制备乳酸菌菌悬液，可以方便地获得乳酸菌的益生菌，从而促进肠道健康，增强免疫力。
菌液制备(正文)
4.1菌液的制备4.1.1将培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后, 用接种环取菌苔少许接种置适宜的培养基中(10ml/支,已灭菌), 将已接种毕的细菌管置35℃~37℃培养18~24小时，真菌管置23℃~28℃按对应的菌种培养适宜的时间，取出备用。
一般于冰箱中保存可用两周。
适宜的培养基选择：1)大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中；2)生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中；3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱（用0.9%无菌氯化钠反复的吹洗斜面）。
然后，吸出孢子悬液（用管口带有簿的无菌棉花或纱布能过滤菌丝毛细吸管）至无菌试管内.4.1.2取上述培养好的菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只刻度吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-2 ……以此类推，稀释至含活菌数在 50 ～100 个。
4.1.3用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4，10-5,，10-6，的稀释菌悬液各1ml，对号放入编号的无菌平皿中，每个平皿放1ml。
（基本每个稀释级平行2个平皿）4.1.4尽快向盛有稀释级的菌液平皿中倒入融化后冷却至45℃的营养琼脂培养基约15ml/皿。
待培养基凝固后倒置于37℃恒温培养箱中培养。
4.1.5培养48小时后，取出培养平板，算出三个稀释级的平均菌落数。
取每1ml含小于100CFU的稀释级作为阳性对照用菌液。
4.4.4此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在一周内使用。
1)大肠杆菌35~37℃培养48小时；2)金黄色葡萄球菌30~35℃培养48小时；3)枯草芽孢杆菌30~35℃培养48小时；4)白色念珠菌23~28℃培养7天；5)黑曲霉23~28℃培养7天；6)生孢梭菌30～35℃培养18～24小时。
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真菌菌悬液的制备
1）白色念珠菌悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。
取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。
用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。
挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第 3 代培养物。
2）取第3代～14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），
用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。
3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。
4）菌悬液保存在4℃冰箱内备用。
当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
菌落形态可直接用显微镜观察。
菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。
1) 在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。
取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。
用接种环划线接种
第 1 代培养物于MEA 培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h。
取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置30℃±1℃培养箱中培
养42h～48h，即为第3代培养物。
2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置30℃±1℃培养42h～48h。
3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温80 生理盐水溶液, 刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振
摇1min 后,滤过除去菌丝。
滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经5000 r/min～6000 r/min，离心20min。
再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。
4) 黑曲霉分生孢子悬液在2℃～8℃储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。
5) 使用时，可用稀释液适当稀释。
6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法,每片加菌悬液10μl。
染菌后，
置37℃培养箱内烤干(约30min)，或置室温下自然阴干后再使用。
7) 回收菌数应达5×`10^5`cfu/片～5×`10^6`cfu/片，可依试验要求确定。
生孢梭菌菌悬液制备
其实无菌方法验证中的菌悬液的制备也是依中国药典（2005年版二部）附录XI H无菌检查法中“培养基灵敏度检查”项下的方法，制备成小于100 CFU/ml的对照用菌液。
所以无论你做什么，菌悬液的制备方法都是一样的。
具体方法就是，先把生孢梭菌在硫乙醇中培养24小时，然后吸取1毫升培养液用生理盐水进行10倍稀释，我的经验是，稀释到10的-7次方就是在100cfu以下了（这个你得自己多做几次平行实验或验证实验，看到底稀释到多少倍。
最初不好把握的时候可以同时培养几个临近的梯度），然后取至少200ml的硫乙醇酸盐培养基到试管里（要求无菌），然后接种1ml 制备好的菌悬液到硫乙醇试管里，在32.5度下培养18h，然后开始计数。
生孢梭菌在液体的硫乙醇里会长成梭子一样的单个菌落，这时拿的时候千万不要震动，然后开始计数（一个单独的“梭子”计一个菌落）。
注：如果培养时间太长会产生浑浊，不便于计数。
如果震动试管也会浑浊。
硫乙醇的量尽量大一点，这样便于计数。