(推荐)菌种的接种及菌悬液制备操作程序
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化2.1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。
2.2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。
也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
2.4 实验方法与步骤2.4.1 分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
2.4.2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24-48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。
菌液的制备及保存
1目的菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的.规范菌种原始菌液的制备及长期保存。
2内容2.1定义原始菌液——由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液.工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。
2.2 总则微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外)。
每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检,如果是芽孢悬浮液,用常规方法测定其存活孢子数。
经检查如果满意，贴上合适的标签,并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2 ～8℃）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史.生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。
原始菌种的传代次数最多传至第五代。
2。
3 培养基2.4 冻干菌制备原始菌液2.4。
1 由甘油冷冻菌制备原始菌液2.4.1.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。
2.4。
1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；2.4.1。
3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中；2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间；2.4.1。
5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。
2。
4。
2 由集菌平板制备原始菌液2.4.2。
1 在超净工作台内,把经过24h（或更长时间)培养的菌液摇匀，各取1ml，无菌转移至5只培养基平板上,轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。
不同培养基适用于不同菌种。
2。
4。
2。
2 另用一只平板,划线分离菌液,培养之，以检查菌液是否纯种。
2。
4。
2。
3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。
2.4。
2.3.1 生长菌—24h以内即可显见增长；2.4.2。
3.2 孢子-需要3～7天或更长时间才能得到50%孢子，这样可确保提到浓的悬浮液。
液体菌种制作过程
液体菌种的的制作过程一、母种纯化1、配方：1000ml为例（1）小麦（麦夫或豆芽）50克，土豆200克，葡萄糖20克，蛋白胨2克，琼脂18-20克，KH2 PO4 1.5克，MgSO4 0.75克，PH自然（6左右）（2）蔗糖24g，蛋白胨2g，酵母膏1g，2、制作小麦煮开花，土豆煮酥而不烂；琼脂剪碎，放入溶解，加入其他配料，总体积称到标准量，装入试管，进行常规灭菌（121℃，40分钟）。
3、接种将所用母种及新制的试管放入接种箱，灭菌20分钟后将手用75%的医用酒精擦洗（消毒），伸入接种箱等待5-10分钟再开始接种（接种前所有接种工具都要在酒精灯火焰上匀烧灭菌），在酒精灯火上方切取0.3cm²一小块菌丝，放入新培养基上，塞好试管口；放在该菌最适合的温度下培养。
4、培养在培养过程中，每天都要仔细逆光观察，发现有任何疑常现象都要淘汰不要。
二、摇瓶种子制作1、配方：1000ml为例a.可以用母种纯化配方（不加琼脂）b.土豆200克，黄豆8克（需打凝浆）或脱脂豆奶8克，葡萄糖30克，蛋白胨2克，KH2PO41.5克，MgSO4 0.75克。
c.玉米小麦各50克，蔗糖20克，葡萄糖10克，蛋白胨2克，酵母膏2克，KH2PO41克，MgSO4 0. 5克。
d．蔗糖24g，蛋白胨2g，酵母膏1g，KH2PO42g,MgSO4 1g, 豆浆50ml.2、制作将以上配方任选一种用类似母种的方法制成液体培养基，装入摇瓶，塞好瓶口，包上放潮纸，放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀，温度升至121℃后，计时40分钟，让其自然冷却，压力归零时，打开灭菌锅盖，将一边掀起3-5cm，利用余热将棉塞烘干。
3、接种将摇瓶及纯化好的母种一起放入接种箱，灭菌后，去掉防潮纸，扭松棉塞，在酒精灯火焰上方，挑取0.3cm²的菌丝皮左手拿起棉塞,右手迅速将菌丝接入,然后立刻盖上棉塞,用同样的方法一个摇瓶接入15-20块,让其均匀地分布在液体表面。
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。
复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。
5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。
使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。
5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。
菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。
菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。
5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。
5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。
5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。
传代次数不宜过多，一般不超过10代。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
霉菌实验操作方法
霉菌实验操作方法霉菌实验是一种常用的微生物实验，用于观察和研究霉菌的生长和繁殖情况。
以下是一种常用的霉菌实验操作方法：1. 准备所需材料和试剂：- 霉菌菌种（如青霉菌、曲霉菌等）- 培养基（如琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂等）- 干燥的无菌培养皿- 培养皿密封膜或胶带2. 无菌操作：- 洗手并进行必要的消毒，确保实验环境无菌。
- 将所需材料和试剂进行高温高压灭菌或丙酮消毒。
- 使用无菌技术操作，避免外界的菌群污染。
3. 制备菌种悬液：- 从保存的霉菌菌种中取出一小部分，通过接种环或接种针悬浮于无菌生理盐水或无菌培养基中。
- 使菌种悬液均匀分布。
4. 霉菌培养：- 将无菌培养基熔化并冷却至适宜的温度。
- 将培养基倒入无菌培养皿中，待其固化形成培养基平板。
- 使用接种环或接种针，分别在培养基表面划线或刺激式接种菌种悬液。
- 均匀划线或刺激式接种以确保霉菌的均匀分布。
5. 培养皿密封：- 用无菌的培养皿密封膜或胶带将培养皿密封，防止外界空气和其他菌群的进入。
- 将密封后的培养皿标记上必要的信息（菌株名称、日期等）。
6. 培养条件：- 将密封后的培养皿置于适宜的温度和湿度条件下。
- 注意避光，霉菌一般在暗处生长。
7. 观察和记录：- 在培养一段时间后，观察培养皿上是否有霉菌生长。
- 记录霉菌的生长情况，包括菌落的形态、颜色和分布等。
- 还可以进一步进行镜检，观察霉菌的菌丝和孢子等微观结构。
8. 结果分析：- 根据观察和记录的结果，分析和总结霉菌的生长和繁殖情况。
- 可以进行统计分析或比较不同实验组的结果。
请注意，实验中的操作和培养条件可能因具体的实验目的和研究对象而有所不同。
在进行实验前，应仔细研究和理解所用菌种的特性，以及相应的实验操作方法和安全注意事项。
菌种的接种及菌悬液制备操作程序
菌种的交种及菌悬液造备收配步调之阳早格格创做一、菌种的交种：1、菌种的复苏：1.1把冻搞菌种管、灭菌1ml毛细滴管、单碟、镊子、营养肉汤培植基、营养琼脂斜里数收，移进交种室或者超洁处事台.1.2将冻搞菌种管中壁用碘酒揩洗消毒、稍搞，用75%乙醇棉揩洁，搁正在灭菌单碟内，待搞.面焚酒粗灯，将菌种管的启心一端正在火焰上，烧灼白热，用灭菌毛细滴管吸与营养肉汤培植基，滴正在灼热的菌种管启心一端，使热而炸裂.1.3与灭菌镊子，正在火焰旁，将炸裂的管心挨启，搁进灭菌单碟内，另与一收灭菌毛细滴管，正在火焰旁吸与营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻搞菌块搅动督促溶解，随即吸出管内菌液，分别交种至营养琼脂斜里置35～37℃培植22～24小时.1.4与出培植物，小心瞅察菌苔形态、有无纯菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌降后，转种3代即可应用.如创造菌形没有典型，可举止仄板分散单菌降.2、菌种的交种：2.1准备需用的培植基，培植基应新陈造备，如斜里已无热凝火者，没有宜再使用.标签上证明菌名及交种日期.自冰箱与出的菌种斜里，应正在室温搁置约30分钟，待温度仄稳后再移进交种室或者超洁处事台.2.2面焚酒粗或者其余灯，正在左脚握住菌种斜里，将管心靠拢火焰旁，左脚拿交种棒后端，将交种环烧白30分钟，随后将局部交种棒金属部分正在火焰上烧灼，往返通过3次.左脚用知名指、小指及掌部夹住棉塞，左脚将管心正在火焰上转动烧灼，左脚再沉沉扒启棉塞，将交种环伸进管内先正在近壁的琼脂斜里上靠一下，稍热却再移至菌苔上，刮与少量菌苔，随即与出交种棒，并将菌种管品移至火焰旁.堵上棉塞，左脚将菌种管搁下，与营养琼脂斜里1收，照上述收配挨启棉塞，将交种环伸进管内至琼脂斜里的底部，由底进与，将交种环沉揭斜里的表面直合移动，使细菌划正在斜里的表面上.2.3与出交种棒，正在火焰旁将培植基管棉塞堵上，而后将交种过细菌的交种棒正在火焰上烧灼灭菌.2.4将已交种毕的细菌管置35～37℃培植22～24小时，霉菌管普遍置24～25℃霉菌培植箱内培植7日.二、菌悬液的造备：1、短小芽孢杆菌悬液与短小芽孢杆菌处事用菌种营养琼脂斜里培植物加灭菌火1～2ml将菌苔洗下，造成悬液，用吸管将此悬液种至衰有营养琼脂培植基的扁培植瓶内，匀称摊布.正在35～37℃培植7日.与菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌火10ml将芽孢洗下，造成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，正在70～75℃火浴内加热30分钟将菌体杀死，待热后冰箱贮躲为浓菌液.2、大肠杆菌悬液与大肠杆菌处事用菌种的营养琼脂斜里培植物，用交种环与菌苔少许交种至营养琼脂斜里上，正在35～37℃培植20～22小时，临用时，与大肠杆菌的营养琼脂斜里培植物少许，交种至5ml营养肉汤培植基内，造成悬液，正在36±1℃培植18～24h后使用.此菌液只供当天使用.3、沙门菌与沙门菌处事用菌种的营养琼脂斜里培植物，照大肠杆菌悬液造备要领举止，此菌液只供当天使用.。
菌液制备标准操作规程
一、目的：建立方法适用性检查用菌、阳性对照菌及验证用菌的制备及使用标准操作规程，为操作人员提供正确的操作规程。
二、范围：使用于供试品无菌检查及方法适用性试验，微生物限度检查及方法适用性试验，培养基适用性检查等所用菌液的制备。
三、职责：微生物实验室人员。
四、内容：1、简述:1.1、试验环境：应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内或生物安全柜中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
1.2、操作室的清洁与消毒应依照《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。
2、设备及仪器:2.1、阳性对照室2.2、生化培养箱2.3、压力蒸汽灭菌器2.4、微波炉2.5、玻璃器皿:锥形瓶、培养皿（90mm）、试管及塞、刻度吸管（0.1ml、1ml、5ml、10ml）锥形瓶等用前应洗涤干净。
刻度吸管口上端距0.5㎝处塞约2㎝的适宜疏松棉花，灭菌备用。
2.6、用具:接种环（铂金或镍铬合金，环径4～5㎜、长度6～10㎝）3、试液：3.1、消毒液: 0.1%苯扎溴铵溶液、0.1%醋酸氯已定溶液、CLBⅡ型消毒溶液（规格：0.65g/片）、75%乙醇溶液、杀孢子剂。
消毒液配制按《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。
3.2、试验用液: 0.9％无菌氯化钠溶液、PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。
试验用液配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。
4、培养基: 胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基。
培养基配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。
5、菌种：所用的菌种传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代,一般使用2～5代的菌种），具体如下：金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕大肠埃希菌〔CMCC（B）44 102〕铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50 094〕生孢梭菌〔CMCC（B）64 941〕枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕6、菌液制备:接种金黄色葡萄球菌、铜绿假胞单菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物至胰酪大豆胨液体培养基中；接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养24～72小时，观察上述培养物如生长良好，无菌分装约3ml/管（生孢梭菌上层加约1ml液状石蜡隔绝空气，造成厌氧环境），并取1管（其余至4～6℃冰箱冷藏保存，铜绿假胞单菌室温保存，在有效期内使用）用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液，采用10倍级系列稀释法制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
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菌种的接种及菌悬液制备操作程序
一、菌种的接种：
1、菌种的复苏：
1.1 把冻干菌种管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或超净工作台。
1.2 将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在
灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使冷而炸裂。
1.3 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取
一支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面置35～37℃培养22～24小时。
1.4 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，
呈典型菌落后，转种3代即可应用。
如发现菌形不典型，可进行平板分离单菌落。
2、菌种的接种：
2.1 准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜
再使用。
标签上注明菌名及接种日期。
自冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
2.2 点燃酒精或其他灯，在左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手
拿接种棒后端，将接种环烧红30分钟，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。
右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开棉塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管品移至火焰旁。
堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。
2.3 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接
种棒在火焰上烧灼灭菌。
2.4 将已接种毕的细菌管置35～37℃培养22～24小时，霉菌管一般置24～
25℃霉菌培养箱内培养7日。
二、菌悬液的制备：
1、短小芽孢杆菌悬液取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物加灭菌水1～2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布。
在35～37℃培养7日。
取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，
应有芽孢85%以上，用灭菌水10
ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在70～75℃水浴内加热30分钟将菌体杀死，待冷后冰箱贮藏为浓菌液。
2、大肠杆菌悬液取大肠杆菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时，临用时，取大肠杆菌的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，制成悬液，在36±1℃培养18～24h后使用。
此菌液只供当天使用。
3、沙门菌取沙门菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，照大肠杆菌悬液制备方法进行，此菌液只供当天使用。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
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