标准菌株的制备
微生物限度及无菌检查
计数方法适用性检查
1.供试液的制备
u 水溶性供试品 u 非水溶性供试品：可适量加入如聚山梨酯80等表面活性剂，加入量及加 入的试剂均需进行验证，以证明其无明显抑菌性。 u 油性供试品：十四烷酸异丙酯或其它无抑菌性的表面活性剂。 u 肠溶供试品：一般肠溶制剂用pH8.6磷酸盐缓冲液，结肠制剂用pH7.6磷 酸盐缓冲液。
阳性对照组：相当于1g或1ml的供试液+不大于 100cfu的目标菌
阴性对照组：与供试液同体积的稀释液
耐胆盐格兰阴性菌检查
1.供试液制备和预培养：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基至100ml，放置20~25℃培养 约2小时内。 2.定性试验：取1:10的供试液10ml，加至肠道菌增菌培养基中（加入量应经过验证），此方法 适用于标准为不得检出的供试品。 3.定量试验：三管法，同上述MPN法，每级稀释级均取1ml加入一管培养基中。 4.选择与分离：取上述培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上。 5.结果判断：若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，定性试验判断是否检出；定量试验 则对应培养管，查表确定供试品中含有耐胆盐格兰阴性菌的可能菌数。
概要
实验室 管理要
求
菌种管 理
培养基 适用性 检查
微生物 限度检
查
无菌检 查
总体要求： 各功能区域应明确标识，特别是菌种储藏室、污染物处理
区、阳性菌室等存在生物安全危害的区域。
洁净室要求： 洁净室作为药品微生物实验室的核心区域，应远离交通干道、厕所及污染区，
应选上、下水道及其他安装适宜的位置。 洁净室与各配套功能区，包括清洗、培养基配制、消毒/灭菌、灭菌物品存放和
洁净度级 过滤完整性 别
气流组织
A级
B级
标准菌株及工作菌株的制备
标准储备菌株是标准菌株经过一次传代后制备的多份相同的菌株。
将检查完纯度的复活后的培养物制备成菌悬液，液体选用TSB、兔血或脱脂牛奶，加入甘油，使甘油终浓度10%~15%。
将菌悬液分装到多个无菌、带螺旋盖的塑料小管中。
标准储备菌株要制备多份，然后先在0℃~4℃冰箱中预冷30min，再在-25℃左右的冰箱预冷30min左右，最后放入-70℃的超低温冰箱中保存。
亦可以利用冻干机冻干的形式保存。
标准储备菌株在保存和使用时要注意避免交叉污染，减少菌株突变或发生典型的性能变化。
对于培养基的测试菌种，应将其在每种培养基上的生长特性全部记录在案。
标准储备菌株最多向下传3代，就必须更换。
工作菌株是由冻干或超低温保存的标准储备菌株经过一次传代得到的菌株。
转接操作时要注意避免标准菌株可能发生的交叉污染和菌株的退化。
制备工作菌株时，应先转接到多份非选择培养基中进行培养，以便得到稳定期的菌株。
厌氧菌的工作质控菌株应在适宜的厌氧肉汤培养基中保存或冷冻保存。
注：一般工作菌株不宜再传代。
但工作菌株如果不存在交叉污染和（或）在一周内不退化，则可以多次使用。
1.标准菌株、标准储备菌株和工作菌株的传代关系见下图。
标准菌株、标准储备菌株和工作菌株的传代关系2.ISO7218《食品和动物饲料的微生物学微生物检查的一般要求与指南》中的制备标准储备菌株和工作菌株的流程见下图，由保藏菌株构建标准储备菌株。
制备标准储备菌株和工作菌株的流程3.标准储备菌株和工作菌株的操作步骤：①通常在营养肉汤中重悬复苏。
②菌落形态观察、革兰氏染色和生化鉴定。
③例如，含10%~15%甘油的TSB的冷冻保护培养基。
④低于-70℃冻存可无限期保存，高于此温度储存期仅限1年。
4.由标准储备菌株构建工作菌株流程见下图。
由标准储备菌株构建工作菌株流程图①例如接种TSA或含羊血的TSA或其他合适的培养基，培养24h后在合适的温度（依据微生物的不同选择18℃~25℃或2℃~8℃）下可储存4周。
2020版《中国药典》9203章节对菌种要求解读
2020版《中国药典》9203章节对菌种要求解读试验过程中，生物样本可能是最敏感的，因为它们的活性和特性依赖于合适的试验操作和贮藏条件。
实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。
按照统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。
项目2015版中国药典2020版中国药典对比说明来源篇药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。
药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株为有明确来源的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。
1. 这里对标准菌株的来源限定“应来自认可的国内或国外菌种保藏机构”，位置调整，要求不变。
2. “标准贮备菌株”修订为“标准储备菌株”。
使用篇标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。
从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准贮备菌株。
标准贮备菌株应进行纯度和特性确认。
标准贮备菌株保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装于小瓶中，建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30℃）等方法保存。
低于-70℃或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时间。
标准贮备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。
冷冻菌种一且解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。
标准菌株应来自认可的国内或国外菌种保藏机构，其的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。
从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准贮储备菌株。
标准贮储备菌株应进行纯度和特性确认。
标准贮储备菌株保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装于小瓶中，建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30℃）等方法保存。
微生物实验用菌种管理规程(含表格)
微生物实验用菌种管理规程（ISO13485-2016/YYT0287-2017）1.0目的规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2.0适用范围适用于微生物实验用菌种管理，包括菌种的申购、传代、使用及销毁等。
3.0引用/参考文件ChP2015实用药品微生物检验检测技术指南4.0职责质量控制实验室负责菌种的申购、传代、使用、销毁等工作，QA负责监控和参与OOS调查。
5.0程序5.1术语和定义5.1.1标准菌株由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌。
5.1.2传代菌株用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种，3代后的传代菌株在需要时可以作为工作菌株使用。
5.1.3工作菌株用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
5.1.4菌种的代将菌种接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
5.2菌种来源5.2.1标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（CMCC）或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌种。
5.2.2质量控制实验室涉及到的菌种种类、代码、保存方法及保存条件如下。
菌种名称菌种代码保存方法保存温度保存期限TSA斜面2～8℃1个月金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月铜绿假单胞菌CMCC(B)10104冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501冷冻干燥管-20℃1年SDA斜面2～8℃3个月白色念珠菌CMCC(F)98001冷冻干燥管-20℃1年SDA斜面2～8℃3个月黑曲霉菌CMCC(F)98003冷冻干燥管-20℃1年TSA斜面2～8℃1个月生孢梭菌CMCC(B)64941冷冻干燥管-20℃1年5.3菌种的申购、验收、保存5.3.1菌种的申购5.3.1.1微生物室QC依据菌种的库存及菌种的使用情况，提出采购申请，申请需明确菌种的名称，标准编号以及申购数量等信息。
中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection , CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
2015版药典菌种传代 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用说明书导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签1CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。
储存于2, 8 ?，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基2改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤:a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
标准菌株的购置、验收、复活、确认、转代、储存、使用、废弃等
标准菌株的购置、验收、复活、确认、转代、储存、使用、废弃等1标准菌株的概念及其应用1.1标准菌株概念1）GB/T27405-2008实验室质量控制规范食品微生物检测：①标准培养物：标准菌株、标准储备菌株和工作菌株的统称。
①标准菌株：至少定义至属或种水平的菌株。
按其特征进行分类和描述，有明确的来源。
①标准储备菌株：标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。
①工作菌株：由标准储备转接后获得的同种菌株。
1.2标准菌株的应用：各种国际标准、国家标准、行业标准及企业标准等的相关微生物检测，用于验收培养基(包括试剂盒)、验证方法和评估实验操作。
2微生物菌种管理的相关流程2.1菌株的采集：实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买ATCC菌种，三是科研中菌种交流。
不管是哪种来源，均统一采集。
采集中严格按照规范执行。
要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。
保证菌种合格和环境安全。
采集中要有菌种传代标识。
选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准菌株必须附带有供应商的合格证或检测报告或说明书，来证明所采购的标准菌株是合格的。
2.2标准菌株和验收实验室收到标准菌株，首先应进行符合性感官检查，记录菌株号和标准菌株来源途径信息，确保溯源性清楚。
同时还应记录标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等情况。
2.3冻干标准菌株的复活①开启产品包装：先用70%酒精棉擦拭外包装，从凹口处撕开产品外包装，撕掉标签上的拉片，将其贴于菌株接收、保存记录序号前面。
①复活：选择合适的培养基和培养条件（根据生产商说明或有关技术通则见附录）进行复活。
菌种的首次活化最好是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。
冻干菌株的传代次数不得超过5代，从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。
捏管帽处安瓿瓶（仅一次）使其释放水合液体。
垂直握住安瓿瓶并轻拍之，使液体流入含小球的管底。
通过挤捏压碎小球使其与液体混合，立即将拭子浸于水合液体。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
标准储存菌株和工作菌株制备作业指导书
一、目的
保证菌种经过较长时间保藏后仍然保持较强的生命力，不被其他杂菌污染，减少菌株突变或发生典型的特性变化，从而保证微生物学检验结果的准确可靠。
二、方法依据
《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB4789.28-2013》及《附录B标准储存菌株和工作菌株的制备》。
三、适用范围
适用于本中心检验菌种（大肠埃希氏菌、产气肠杆菌）的传代、储存及工作菌株制备。
四、名词解释
4.1标准菌株（F0）:直接从官方菌种保藏机构获得。
4.2标准储备菌株（F1):将标准菌株在实验室转接一代以后得到的一套完全相同的独立菌株。
4.3储备菌株（F2）：从标准储备菌株转接一代获得的培养物。
4.4工作菌株：由标准储备菌株、储备菌株或标准物质转接一代获得的菌株。
五、培养基和试剂
5.1营养肉汤
5.2营养琼脂
5.3乳糖蛋白胨培养液
5.4 75%乙醇
5.5 无菌水
六、仪器设备
6.1生物安全柜
6.2生化培养箱（37℃，44.5℃）
6.3高压蒸汽灭菌器
6.4冰箱（4℃，﹣20℃）
6.5微型旋涡混合仪
6.6水浴恒温振荡器
6.7接种环
6.8酒精灯
七、标准储存菌株的制备
7.1本中心所需标准菌株从认可的菌种中心购买，并要求生产商提供验证报告。
冷冻干燥菌种为0代。
本中心应做好符合性检查并做好符合性检查并填写记录，做好文件归档。
7.2菌种复活
7.2.1将标准菌株及已灭菌的培养基等用物移入生物安全柜。
7.2.2点燃酒精灯，在酒精灯火焰周围5厘米无菌区内，用砂轮在距菌种管封口端1/3处划痕，75%酒精棉球消毒菌种管外壁，用无菌纱布包裹菌种管末端用力掰开。
7.2.3用无菌吸管吸取0.5ml适宜的液体培养基加大菌快上，混
匀成菌悬液。
再将全部菌悬液移入含有5ml适宜的培养基的培养试管中，在37℃生化培养箱中培养12-18小时。
7.2.4取出培养试管，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活成长。
形成第一代菌种（），各菌种适宜培养基及培养条件见表1.
7.3在适宜的固体培养基上进行平板分离
选择适宜的鉴别平板，用灼烧灭菌的接种环完全浸入复活的培养基中，取一满环接种物，将接种环接触容器边缘3次去除多余的液体。
划线时，接种环与琼脂平面的角度应为200，300。
接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续。
置于37℃生化培养箱中培养24小时。
7.4菌种纯度检查和确认
观察菌落形态是否符合，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽是否相似。
对于出现两种或两种以上形态的菌株，需要分离挑选目标菌株。
各菌种菌落形态特征见表1.
7.4.2革兰氏染色
7.4.2.1涂片：在载玻片上滴加一滴生理盐水，用灭菌接种环取典型菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。
7.4.2.2干燥：在室温中使自然干燥。
7.4.2.3固定：将载玻片迅速通过火焰2-3次，以载玻片反面接触皮肤，热面不烫为度。
7.4.2.4染色：滴加结晶紫染色液，染色1分钟，水洗
7.4.2.5脱色：滴加95%乙醇脱色，约30秒，水洗
7.4.2.6复染：滴加复染液，复染1分钟，水洗
显微镜下观察，革兰氏阳性菌染色后呈紫色，革兰氏阴性菌染色后呈红色，见表1
7.5菌悬液的制备。