生物化学第十四章-基因重组和基因工程
生物化学课件 基因重组和基因工程
3´ 5´ 5´
内切酶
3´ (recBCD)
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5 ´ 3´
DNA侵扰 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´
分支迁移 (recA)
内切酶 (recBCD)
5´ 3´ 3´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
DNA 连接酶
5´ 3´ 3´ 5´
IR Transposase Gene IR
发生形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)
15
插 入 序 列 的 复 制 性 转 座
16
（二）转座子转座
转座子(transposons) ——可从一个染色体位 点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：反向重复序列
使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表 型，称为转化作用 (transformation)。
8
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
9
10
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出
来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在
供体细胞与受体细胞之间的 DNA 转移及基因
重组即为转导作用(transduction)。
能否让细菌“吐出”蚕丝？
能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵 的药物？
设想三
科学家于20世纪70年代创立了可以定向 改造生物的新技术——基因工程。
28
DNA重组技术是基因工程的核心技术
基因工程的 原理 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 基因重组
第十四章基因重组与基因工程.pptx
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并 将细菌涨破。
• 溶原 和裂 解可 以相 互转 变。
整合
转导
• 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。
酶有不止一个切口，需经过改造。 • 一个切口：插入型载体。 • 二个切口：置换型载体。
噬菌体载体
目的基因的来源
• 直接从染色体DNA中分离：原核生物 • 人工合成：简单的多肽 • 从NA后建库。
穿梭质粒
酵母
动 植 物 病 毒 、 组织培养细胞 昆虫载体 DNA 直 接 导 入 生 殖 细 胞
DNA重组体的筛选与鉴定
• 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型
• DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内 切酶切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定： 用目的基因作探针监测宿主DNA是否重 组体。
分 切 接 转 筛
载体和目的基因
• 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分 子。但必须利用宿主的酶系统，才能有 进一步的基因表达能力。
• 常用的载体有： 质粒、 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA
• 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化 后可用于基因工程。
转化
细菌的转化
转化
• 病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
细胞的转化
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体 内的过程。
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染 色体重组，成为细菌染色体的一部分。
沈同《生物化学》精要
沈同《生物化学》（第三版）精要速览第一章绪论第二章蛋白质的结构与功能第三章核酸的结构与功能第四章酶第五章糖代谢第七章生物氧化第八章氨基酸代谢第九章核苷酸代谢第十章DNA的生物合成第十一章RNA的生物合成第十二章蛋白质的生物合成第十三章基因表达调控第十四章基因重组和基因工程第一章绪论一、生物化学的的概念：生物化学（biochemistry)是利用化学的原理与方法去探讨生命的一门科学，它是介于化学、生物学及物理学之间的一门边缘学科。
二、生物化学的发展：1．叙述生物化学阶段：是生物化学发展的萌芽阶段，其主要的工作是分析和研究生物体的组成成分以及生物体的分泌物和排泄物。
2．动态生物化学阶段：是生物化学蓬勃发展的时期。
就在这一时期，人们基本上弄清了生物体内各种主要化学物质的代谢途径。
3．分子生物学阶段：这一阶段的主要研究工作就是探讨各种生物大分子的结构与其功能之间的关系。
三、生物化学研究的主要方面：1．生物体的物质组成：高等生物体主要由蛋白质、核酸、糖类、脂类以及水、无机盐等组成，此外还含有一些低分子物质。
2．物质代谢：物质代谢的基本过程主要包括三大步骤：消化、吸收→中间代谢→排泄。
其中，中间代谢过程是在细胞内进行的，最为复杂的化学变化过程，它包括合成代谢，分解代谢，物质互变，代谢调控，能量代谢几方面的内容。
3．细胞信号转导：细胞内存在多条信号转导途径，而这些途径之间通过一定的方式方式相互交织在一起，从而构成了非常复杂的信号转导网络，调控细胞的代谢、生理活动及生长分化。
4．生物分子的结构与功能：通过对生物大分子结构的理解，揭示结构与功能之间的关系。
5．遗传与繁殖：对生物体遗传与繁殖的分子机制的研究，也是现代生物化学与分子生物学研究的一个重要内容。
第二章蛋白质的结构与功能一、氨基酸：1．结构特点：氨基酸(amino acid)是蛋白质分子的基本组成单位。
构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-α-氨基酸。
高一生物必修课件基因重组和基因工程及其应用
两者区别
9字
基因重组是自然发生的，而 基因工程是人工操作的。
9字
基因重组的结果具有不确定 性，而基因工程可以精确设 计和控制。
9字
基因重组通常发生在同一物 种内，而基因工程可以跨物 种进行。
9字
基因重组不需要额外的工具 或技术，而基因工程需要依 赖特定的工具和技术，如限 制性内切酶、DNA连接酶等 。
高一生物必修课件基因重组和 基因工程及其应用
汇报人：XX
20XX-01-13
CONTENTS
• 基因重组 • 基因工程 • 基因工程应用 • 基因重组与基因工程关系 • 实验：基因重组和基因工程操
作实践
01
基因重组
基因重组概念
基因重组定义
基因重组是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组 合。
05
实验：基因重组和基因工程操作实践
实验目的与原理
目的
通过实验操作，了解基因重组和基因工程的基本原理，掌握相关实验技能，培养科学探究精神和实验能力。
原理
基因重组是生物体内基因重新组合的过程，包括同源重组和非同源重组两种方式。基因工程则是通过人工手段对 基因进行改造和重组，实现特定性状或功能的表达。本实验将通过模拟基因重组和基因工程操作，加深对相关原 理的理解。
重组DNA分子的导入
目的基因的检测与鉴定
将重组DNA分子导入受体细胞，使目的基 因在受体细胞中表达。
通过PCR、Southern杂交等方法检测目的 基因是否成功导入并表达。
03
基因工程应用
农业生产应用
转基因作物
通过基因工程手段，将外 源基因导入农作物中，使 其获得抗虫、抗病、抗除 草剂等优良性状，提高作
生物化学试题及答案(14
生物化学试题及答案〔14〕第十四章基因重组与基因工程[测试题]一、名词解释：1.基因工程〔geneticengineering〕。
2.接合作用(conjugation)。
3.转化作用(transforation)。
4.转导作用(transduction)。
5.转座(transposition)。
6.转座子(transposons)。
7.同源重组(homologousrecombination)。
8.全然重组(generalrecombination)。
9.DNA克隆〔DNAcloning〕。
10.复制子(replicon)。
11.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)。
12.回文结构〔palindrome〕。
13.配伍末端〔compatibleend〕。
14.目的DNA〔targetDNA〕。
15.互补DNA(complementaryDNA；cDNA)。
16.克隆载体(cloningvector)。
17.表达载体(expressionvector)。
18.质粒(plasmid)。
19.α—互补(alphacomplementation)。
20.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)。
21.标志补救(markerrescue)。
22.转染〔transfection〕。
23.基因组DNA〔genomicDNA〕。
24.感受态细胞〔competentcell〕。
25.聚合酶链反响(polymerasechainreaction)。
26.cDNA文库(cDNAlibrary)。
27.保守性转座(conservativetransposition)。
28.复制性转座(duplicativetransposition)。
29.溶菌生长途径(lysispathway)。
30.溶源生长途径(lysogenicpathway)。
二、填空题：31.自然界的常见基因转移方式有____、____、____、____。
大学生物化学课件基因工程ppt
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
切割DNA后产生含5’磷酸和3’羟基的末端
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
扩增或表达
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
（六）克隆基因的表达
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
平端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准：
能在宿主细胞中自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 作为表达载体，具有与宿主细胞相适应的
调控元件：启动子，增强子等。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
生物化学教案：第十四章 基因重组与基因工程
转座子(transposon, Tn)
1950年麦克林托克(McClintock)在对玉米籽粒颜色遗传进行观察时所发现。转座子在移位过程中，导致DNA链的断裂/重接，或是某些基因启动/关闭。
（1）原核细胞转座子
其原型是E.coli的IS(insertion sequence,插入序列)，一个细菌细胞常带少于10个IS序列。IS两端存在着反向重复序列IR(inverted repeat)，IR长短不一。IS本身没有任何表型效应，只携带和它转座作用有关的基因，称转座酶基因。
1、同源重组的概念和机制。
最基本的DNA重组方式，同源重组是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。
2、细菌的基因转移与重组
接合作用、转化作用、转化作用。
3、特异位点重组
λ噬菌体DNA的整合，细菌的特异位点重组，免疫球蛋白的基因重排。
B．人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。
授课章节
第三篇 基因信息传递·第十四章 基因重组与基因工程
授课对象
2007级本科
临床专业1、2、3班
学时
4
时间
2008.11.24/30
授课地点
5315、5506、2301教室
教材
《生物化学》·第六版·人民卫生出版社
基因重组与基因工程PPT课件
不易腐烂的番茄
2、动物植物的遗传改良
抗虫植物 化学农药
兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽。
3、人类基因治疗
（1）体细胞基因治疗
1990年9月14日美国政府首次批准了一项基因治疗临床研究计划：对一台患有腺苷脱氨酶（ADA）缺陷的重度联合免疫缺陷症（SCID）4岁女童进行基因治疗并获得成功。该患者今年已经10岁了。从而开创了医学界的新纪元。
（三）DNA序列的复制
（一）DNA克隆技术
2、PCR技术
10.3 基因工程
（一）基因工程的基本原理和方法
基因工程的实现主要分为三个步骤： 第一步：目的基因的分离或制备：人工分离生物基因组群中目的基因及内切酶定位切割或人工酶促合成 第二步：重组DNA：选择载体及目的基因与载体基因重组 第三步：导入与表达：重组DNA导入受体细胞，目的基因表达出目的效应和性状 实现以上三步需要进行以下工作： 1) 寻找目标基因 2) 取得目标基因 3) 基因的载体问题：现主要有质粒载体、病毒载体、脂质载体、原生质载体
（2）转基因生物的生产
转基因小鼠：导入人类基因，具有较强的学习能力。在迷宫实验中，转基因鼠觅食本领比普通鼠要高许多，同时对迷宫中食物存放地点记忆更清楚。
（二） 基因工程的应用
1、特殊蛋白质的大量生产
乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊
美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fatorⅧ。只需300～600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。
人胰岛素 从猪和牛的胰脏提取，获得100g胰岛素需800－1000kg的牛胰脏。现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。 人生长激素 具有物种特异性，只能用人的生长激素来治疗侏儒症。以前从尸体脑垂体中提取，来源非常有限，现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。 干扰素 体外培养人体细胞来生产，产量低，成本高，现用重组大肠杆菌生产。
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第十四章基因重组和基因工程
一、自然界的基因转移和重组：
基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。
2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。
来源于宿主DNA的基因称为转导基因。
4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位
置的现象。
这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。
⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。
当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。
其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。
免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。
5．基因重组的方式：
⑴位点特异性重组：在整合酶的催化下，两段DNA序列的特异的位点处发生整合并共价连接，称为位点特异性重组。
⑵同源重组：发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组(homologous recombination)。
这种重组方式要求两段DNA序列类似，并在特定的重组蛋白或酶的作用下完成。
二、重组DNA技术：
重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆(molecular cloning)，是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。
1．载体和目的基因的分离（分）：对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。
⑴载体：常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
①质粒：是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。
②噬菌体：可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。
常用的为人工构建的λ噬菌体载体，当目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。
③病毒：常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。
⑵目的基因：①直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离。
②人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。
适应于编码小分子多肽的基因。
③从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。
④从基因文库中筛选：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。
将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。
C-文库具有组织细胞特异性。
⑤利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应
（polymerase chain reaction, PCR）技术，在体外合成目的基因。
2．载体和目的基因的切断（切）：通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。
能够识别特定的碱基顺序并在特定的位点降解核酸的核酸内切酶称为限制酶。
限制酶所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。
由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。
形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。
3．载体和目的基因的重组（接）：即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。
⑴粘性末端连接法：载体与目的基因通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。
⑵人工接尾法：即同聚物加尾连接法。
在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，通过碱基互补进行粘合后，再由DNA连接酶连接。
⑶人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。
4．重组DNA的转化和扩增（转）：将重组DNA导入宿主细胞进行增殖或表达。
重组质粒可通过转化方式导入宿主细胞，λ噬菌体作为载体的重组体，则需通过转染方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。
重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。
5．重组DNA的筛选和鉴定（筛）：对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。
⑴根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。
⑵根据标志互补进行筛选：当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。
即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。
⑶根据DNA限制酶谱进行分析：经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。
⑷用核酸杂交法进行分析鉴定：采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，以确定重组体中带目的基因。
获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。
如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。