基因敲除具体步骤

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农杆菌介导同源重组法敲除真菌基因步骤

农杆菌介导同源重组法敲除真菌基因步骤

农杆菌介导同源重组法敲除真菌基因步骤下面是使用农杆菌介导同源重组法敲除真菌基因的步骤:第一步:构建敲除载体首先,需要构建一个用于敲除目标基因的质粒载体。

该质粒至少包括以下组成部分:1.目标基因的上下游同源片段:需要从真菌基因组中提取一段上游和下游同源片段,使其与要敲除的目标基因相连。

同源片段可通过PCR扩增、限制性内切酶切割等方法获得。

2.抗生素抗性基因:为了筛选在真菌中发生敲除的成功转化事件,可以在敲除载体中加入一个抗生素抗性基因,如大肠杆菌中常用的Amp^R或Kan^R基因。

3.其他辅助元件:如多克隆位点、启动子和转录终止子等。

第二步:构建农杆菌介导的转化种接下来,需要构建农杆菌介导的转化种,这是为了将敲除载体导入到真菌细胞中。

1.选择适当的农杆菌株:常用的农杆菌株有Agrobacterium tumefaciens和Agrobacterium rhizogenes。

2.将敲除载体转化到农杆菌株中:采用化学转化或电转化方法将构建好的敲除载体导入到农杆菌株中。

通过培养选择含有敲除载体的农杆菌菌落,得到转化成功的农杆菌。

第三步:准备获得真菌藻斑体的悬浮液1.制备悬浮液:将病原真菌培养在适当的培养基上并进行培养,直到培养物中细胞密度达到一定水平。

2.收获悬浮液:离心培养物,将细胞沉淀洗涤后,并使用适当的缓冲液作为悬浮液。

第四步:农杆菌和真菌藻斑体的共培养1.将转化成功的农杆菌菌落接种到适当培养基中进行培养,直到菌液培养到对数生长期。

2.将真菌藻斑体的悬浮液加入到农杆菌培养液中,使两者发生共培养。

3.调整共培养菌体的培养条件:包括温度、培养时间、转化溶液浓度等,以促进农杆菌对真菌细胞的诱导转化。

第五步:筛选敲除菌株1.将共培养菌体涂布到含有适当抗生素的选择性培养基上,筛选出抗生素抗性菌落。

2.通过PCR或Southern blot等方法,鉴定筛选出来的菌落是否发生了目标基因的敲除。

3.进行进一步的单克隆分离、测序和鉴定,最终确定敲除成功的菌株。

基因敲除动物模型构建步骤

基因敲除动物模型构建步骤

基因敲除动物模型构建步骤
①. 基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因等)的载体上,成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能,所以一般设计为替换型载体。

②.ES 细胞的获得:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔,猪,鸡等的胚胎干细胞也有使用。

常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

③.同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中,从而得以表达。

一般地,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。

④.选择筛选已击中的细胞:由于基因转移的同源重组自然发生率极低,动物的重组概率为10-2 ~10-5 ,植物的概率为10-4 ~10-5 。

因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。

目前常用的方法是正负筛选法(PNS法),标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。

其中应用最多的是PNS法。

⑤.表型研究:通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变,达到研究目的基因的目的。

⑥.得到纯合体:由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型,需要进行至少两代遗传。

细胞基因敲除方法及步骤

细胞基因敲除方法及步骤

细胞基因敲除方法及步骤我们知道在mRNA翻译成蛋白质的过程中,组成蛋白质的氨基酸是由三个相邻的碱基决定的,而mRNA的起始密码子一般是AUG。

当翻译开始后,核糖体从AUG开始翻译,并且沿着mRNA进行移动,每相邻的三个碱基决定一个氨基酸。

当移码突变发生时,在基因组上增加或减少了非3的倍数个碱基。

这时候,蛋白翻译依然从AUG起始密码子开始,但是由于增加或删除的碱基破坏了原来基因序列,导致了表达的蛋白序列完全改变了,甚至引起蛋白翻译提前结束。

不管是哪种情况,原来的基因所表达的蛋白已经不存在了,因此我们就可以认为该基因已经被敲除了。

那么,假如出现增加或删减的碱基数是3的倍数这种情况呢?这种情况是不能算是移码突变的。

除非增加或删减的碱基序列是在蛋白的关键功能域上,不然后续得到的蛋白依然有功能的,因此也就不能算是成功的基因敲除。

理论上出现非移码突变的概率是1/3,但是在做基因敲除的过程中,我们可以通过测序手段筛选出突变的序列为非3的倍数,从而确保得到阳性克隆细胞是发生移码突变的。

片段敲除又是什么?片段敲除就很好理解了,也就是通过基因敲除手段,让基因上的某个或某些外显子区域缺失。

在利用CRISRP/Cas9进行片段敲除的过程中,我们会在要敲除的片段两端设计两条sgRNAs,然后通过Cas9蛋白对基因组进行切割,从而达到敲除片段DNA的目的。

这时有同学会问,只能敲除了某个外显子,而不能敲除整个基因么?在技术上其实是可以做到的,但是整个基因片段的敲除比较费时费力,而且有时还可能让你的结果非常不可信。

首先,基因敲除的难度会随着敲除片段长度的增加而增加,一般基因包含的外显子区都比较短,但内含子区却很大,从而导致了一个基因至少都有10Kb以上的序列,这时要敲除整个基因就会变得很困难。

而且,在基因的内含子区,往往并不是没有功能基因序列,他们有可能包含着其他基因的调控元件,如果全部敲除就会影响其他基因的表达,甚至影响了实验结果的可信度。

基因敲除技术的原理

基因敲除技术的原理

基因敲除技术的原理基因敲除技术是一种用于研究基因功能和基因治疗的技术。

其基本原理是通过向细胞中导入特定的DNA片段,与细胞中的目标基因发生碱基互补配对,从而实现对目标基因的敲除或沉默基因敲除技术的主要步骤和原理如下:1.基因定位在基因敲除技术的初期,需要先确定要敲除的基因的染色体位置和DNA序列信息。

这些信息可以通过基因组测序等技术获得。

通过对基因进行定位,可以确保后续基因片段设计时的准确性。

2.基因片段设计根据目标基因的染色体位置和DNA序列信息,设计特定的DNA片段,用于与目标基因发生碱基互补配对。

在设计基因片段时,需要考虑与目标基因的同源区、转录调控元件以及内含子等区域的关系,以确保设计的基因片段能够有效地敲除目标基因。

3.载体构建将设计的DNA片段插入到载体中,以便将载体转入细胞中。

常用的载体包括质粒、病毒载体等。

载体构建时需要确保DNA片段的正确取向和连接,以确保在转染细胞后能够成功地敲除目标基因。

4.细胞转染将构建好的载体转入到目标细胞中,常用的方法包括电穿孔法、脂质体转染等。

细胞转染时需要控制转染条件,如转染剂浓度、转染时间等,以确保转染效率。

5.基因敲除在转染后的细胞中,载体中的DNA片段会与目标基因发生碱基互补配对,从而实现对目标基因的敲除或沉默。

在基因敲除过程中,需要控制敲除条件,如敲除时间、敲除效率等,以确保敲除结果的准确性。

6.筛选与鉴定通过特定的筛选方法,从敲除后的细胞中筛选出成功敲除目标基因的细胞株。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光标记筛选等。

筛选出的细胞株需要通过分子生物学方法进行鉴定,如PCR扩增、测序等,以确保目标基因已经被成功敲除或沉默。

总之,基因敲除技术是一种重要的生物技术,可以用于研究基因功能和治疗疾病。

通过对其原理和步骤的掌握和应用,可以实现对特定基因的有效敲除和沉默,从而深入探讨基因的功能和作用机制。

基因敲除流程

基因敲除流程

基因敲除流程基因敲除是一种常用的分子生物学技术,用于研究特定基因的功能。

通过基因敲除,可以研究基因在生物体内的功能,揭示基因与生物体生理活动之间的关系。

下面将介绍基因敲除的流程及相关注意事项。

1. 确定目标基因。

首先,需要确定要敲除的目标基因。

这通常是通过文献调研和基因功能研究来确定的。

选择合适的目标基因对于后续的实验设计和结果分析至关重要。

2. 设计敲除载体。

接下来,需要设计敲除载体。

敲除载体是一种特殊的质粒,可以在生物体内引发基因敲除。

在设计敲除载体时,需要考虑敲除的靶点、选择合适的启动子和选择适当的标记基因等因素。

3. 转染细胞。

将敲除载体转染至目标细胞中。

转染是指将外源DNA导入细胞内的过程。

转染方法有多种,如化学法、电穿孔法、病毒载体法等。

选择合适的转染方法可以提高敲除效率。

4. 筛选阳性克隆。

经过转染后,需要进行筛选阳性克隆。

通常可以利用抗生素筛选或荧光标记筛选等方法,筛选出携带敲除载体的细胞克隆。

5. 验证敲除效果。

最后,需要验证敲除效果。

可以通过PCR、Western blot、免疫组化等方法来验证目标基因是否被成功敲除,以及敲除后对生物体的影响。

需要注意的是,在进行基因敲除实验时,应该严格按照操作规程进行,确保实验的准确性和可重复性。

另外,针对不同的生物体和目标基因,可能会有一些特殊的操作要求,需要根据具体情况进行调整。

总之,基因敲除是一项重要的分子生物学技术,可以帮助科研人员深入研究基因的功能和生物体的生理活动。

通过不断改进敲除技术,相信基因敲除将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。

基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些?

基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些?

基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些?基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

它是针对某个序列已知但功能未知的序列,改变生物遗传基因,令特定的基因功能丧失,从而使部分功能被屏蔽,并可进一步对生物体造成影响,进而推测出该基因的生物学功能。

目前能实现基因敲除的方法有:1.运用基因同源重组进行基因敲除(1)步骤方法A 构建基因载体:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上,使之成为重组载体,常用的标记基因有:neo 基因、TK 基因等。

根据实验目的不同,打靶载体分为全基因敲除、条件敲除、基因敲进、诱导性基因敲除等打靶载体。

B获得胚胎干细胞:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔、猪、鸡等的胚胎干细胞也有使用。

基因敲除一般应用于鼠,常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。

有些科研机构和单位已经运用C57BL/6遗传背景的小鼠的胚胎干细胞进行基因打靶,广泛运用于免疫学、神经学、癌症等领域。

C同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中,从而得以表达。

一般来说,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但操作便利。

D筛选已表达的细胞:由于基因转移的同源重组自然发生率极低,因此要从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞。

目前常用的方法有:正负筛选法(PNS法)、标记基因的特异位点表达法以及PCR 法,其中应用最多的是PNS法。

E 性状观察:通过观察重组小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变,达到研究目的基因的目的。

基因敲除的详细实验流程

基因敲除的详细实验流程

基因敲除的详细实验流程英文回答:Gene knockout is a widely used technique in molecular biology to study the function of specific genes. Itinvolves the deliberate removal or inactivation of a target gene in order to observe the resulting effects on the organism or cell.The first step in the gene knockout process is toidentify the target gene that will be knocked out. This is typically done by studying the gene's sequence and function, as well as any available literature on its role in the organism or cell.Once the target gene has been identified, the next step is to design a knockout construct. This is a piece of DNA that will be introduced into the organism or cell todisrupt or delete the target gene. The knockout construct typically consists of a selectable marker, such as a genefor antibiotic resistance, flanked by sequences that are homologous to the target gene.The knockout construct is then introduced into the organism or cell using a variety of techniques, such as electroporation or viral transduction. Once inside the organism or cell, the knockout construct integrates into the genome through homologous recombination with the target gene.After integration, the knockout construct disrupts or deletes the target gene, rendering it non-functional. This can be confirmed by various methods, such as PCR or Southern blotting, which detect the presence or absence of the target gene.Finally, the effects of the gene knockout are observed and analyzed. This can involve studying the phenotype of the organism or cell, as well as performing molecular assays to investigate changes in gene expression or protein levels. The results of the gene knockout experiment can provide valuable insights into the function of the targetgene and its role in the organism or cell.中文回答:基因敲除是分子生物学中常用的一种技术,用于研究特定基因的功能。

第一代基因编辑ZFN

第一代基因编辑ZFN
Science 24 July 2009:Vol. 325. No. 5939,P433.DOI: 10.1126/science.1172447
ZFN应用实例2
• 2013年复旦大学朱焕章等首次利用ZFN技术证实一种HIV治疗策略的有效性。 研究人员设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR的ZFN, 在多个HIV感染及潜伏细胞系上证实了ZFN能特异靶向HIV-1前病毒LTR并介导 整合的全长HIV-1前病毒的高效切除,获得了显著抗HIV感染的效果,提示了 该方法将可能为一个可选择的根除HIV的治疗手段。
染色体自发丢失;使用ZFN在
一条21号染色体上插入Xist基
因,使这整个染色体失去功能。
Hongmei Lisa Li, Takao Nakano, and Akitsu Hotta. (2014) Genetic correction using engineered nucleases for gene therapy applications. Development Growth Differentiation, 56(1): 63-77
+
非特异性 核酸内切酶
基因组编辑技术
简史
1993年前ZFN就已开始出现,为第一代基因编辑技术; 2009年底出现的TALEN短期内取代了ZFN,成为第二代基因编辑技术; 2012年CRISPR/Cas的出现,使得基因编辑大放异彩,基本取代了前两代基
因编辑技术,而且其系统还在进一步优化中。
荣誉
应用
定点突变,定点修饰(包括转基因),转录调控 基因治疗(如遗传病),中国、美国已经率先开启相关医学应用研究。 ……
第一代基因编辑技术——ZFNs
是一种常出现在DNA结合蛋白质中的一种结构基 元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。
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The following protocols take MLCK (myosin light chain kinase) as an example.General steps:1.BAC extraction (It is necessary for us to identify the BAC by PCR)2.Transform BAC to EL350 ( Cm+)3.Retrieving (Cm+ Amp+)4. Targeting 1st lox P (Amp+ Amp+ and K+)5. Transform MLCK 1st lox P to EL350 to get purify MLCK 1st lox P ( Amp+ and K+)6. MLCK 1st lox P pop out (Amp+ and K+ AmP+)7. Transform MLCK 1st lox P pop out to EL250 (Amp+)8. Targeting 2nd lox P (Amp+ Amp+ and K+)9. Transform MLCK 2nd lox P to DH-5α or XL1-Blue ( Amp+ and K+)10. Linearization1. BAC extractionSolution I:Tris.Cl 0.025 MEDTA 0.01MGlucose 0.05MpH 8.0Solution II:SDS 1 %NaOH 0.2Mfresh prepared (1Volume 2% SDS + 1Volume 0.4M NaOH)Solution III:(120 ml 5 M KAc + 23 ml HAc + 57 ml H2O) / 200 mlProtocol:1. Harvest 50 ml bacterial cells (O/N) by centrifugation at 9,000 r/m for 10 min,pour off the supernatant clearly.2.Add 5ml ice-cold Solution I, mix.3.Add 10 ml Solution II, invert several times gently.4.Add 7.5 ml Solution III, invert several times gently.5. Centrifuge at 9,000 r/min for 10 min at 4℃. Remove the supernatant to a freshtube.6.Add 0.6 volume of isopropanol7.Centrifuge at 9,000 r/min for 10 min at 4℃. Remove supernatant.8.Dissolve DNA pellet in 400 ul TE¥, add 20 ul 10mg/ml RNase, 55℃,20-30min.9.Add equal volume of Phenol/chloroform (1:1), mix and centrifuge at 12,500rpm for 5 min at RT. (From this step, 1.5 ml tube can be used)10.Transfer supernatant to a fresh tube, add equal volume of chloroform, mix andcentrifuge at 12,500 rpm for 10min at RT11.Add 0.1 volume of 3M NaAc (pH5.3) and 2 volume of ethanol (stored at -20℃).Mix and centrifuge at 12,500 rpm for 10 min at 4℃.12.Dissolve DNA with 50 ul pH 7.4 MilliQ H2O.(TENS isn’t good for BAC extraction)2. Transform BAC into EL350 (Cm+)1.Pick up a single colony of EL350 to 3ml LB¥, grow at 32℃ O/N (12-16h)2.Next day, incubate 1 ml of O/N culture to 50 ml LB, 32℃ for 2-3h to OD600=0.5 From this step, all on ice or in 4℃3.Transfer 6ml cells to 15 ml centrifuge tube, put on ice for 15 min4.Spin at 3,500 rpm for 6 min, resuspend cell with 1.5ml pH 7.4 MilliQ H2O.5.Spin, wash twice more.¥6.Remove supernatant, add about 50 ul pH7.4 MilliQ H2O.7. Add 10 ul BAC to 50 ul competent cells, pipette them to an electroporation cup (0.1 cM gap).8. 1.75kV, 25 uF, 200 ohms.9. Add 1ml SOC to each curvette¥and incubate at 32℃ for 1h.10. Centrifuge at 3,500 rpm for 3 min, pour off most of the supernant and plate cells (Cm+).3. Retrieving (Cm+ Amp+)Retrieval plasmid construction1.PCR amplify two 500 bp homologous arms(BAC as template)2.Insert these two fragments to T vector3.Not I, Hind III cutting and Spe I Hind III cutting 500 bp fragments ligated with Not I ,Spe I cutting PL253¥4.Transform, identify the positive colones5.Cut the retrieval plasmid with Hind III, purify the product.Transformation1.Pick up a single colony of BAC-EL350 to 3ml LB, grow at 32℃ O/N (12-16h)2.Next day, incubate 1 ml of O/N culture to 50 ml LB, 32 ℃ for 2-3h to OD600=0.53.Induce BAC-EL350 in 42℃ water bath by shaking for 15 min.From this step, all on ice or in 4℃4.Transfer 6ml cells to 15 ml centrifuge tube, put on ice for 15 min5.Spin at 3,500 rpm for 6 min, resuspend cells with 1.5ml pH 7.4 MilliQ6.Spin, wash twice more.7.Remove supernatant, add about 50 μl pH 7.4 MilliQ8.Add 200-500ng linear retrieval plasmid to 50ul BAC-EL350, pipette them to anelectroporation cup (0.1 cM gap).9. 1.75kV, 25 uF, 200 ohms.10. Add 1ml SOC to each curvette and incubate at 32℃ for 1h.11. Centrifuge at 3,500 rpm for 3 min, pour off most of the supernatant and plate cells (Amp+).MLCK-PL2534. Targeting 1st lox P(Amp+ Amp+ and K+)¥sequenceMini-targeting vector construction1.PCR amplify 80 bp homologous arms lox P floxed Neo cassette (1st lox P) fromPL452.2.Ligate 1st lox P with T vector (If the PCR product quantity is enough for later use ,this procedure is not necessary)3.Cut 1st lox P–T to get 1st lox P fragment, purify the product.Note: If you use the ligation method to construct the mini-targeting vector, two ~500bp homologous arms are ligated to the floxed Neo cassette excised from PL452 with Eco RI and Bam HI and to PL253 that is linearized by Not I and Sal I.For more detail, pls see, Lee, E. C. et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics73,56-65 (2001)Transformation1.Pick up a single colony of MLCK-PL253-EL350 to 3ml LB, grow at 32℃ O/N(12-16h)2.Next day, incubate 1 ml of O/N culture to 50 ml LB, 32 ℃ for 2-3h to OD600=0.53.Induce MLCK-PL253-EL350 in 42℃ water bath by shaking for 15 min.From this step, all on ice or in 4℃4.Transfer 6ml cells to 15 ml centrifuge tube, put on ice for 15 min5.Spin at 3500 rpm 6 min, resuspend cell with 1.5ml pH 7.4MilliQ6.Spin ,wash twice more.7.Remove supernatant, add about 50μl pH 7.4MilliQ8.Add 200ng 1st lox P fragment to 50ul MLCK-PL253-EL350, pipette them to anelectroporation cup (0.1 cM gap).9. 1.75kV, 25 uF, 200 ohms.10. Add 1ml SOC to each curvette and incubate at 32℃ for 1h.11. Centrifuge at 3,500 rpm for 3 min, pour off most of the supernatant and plate cells (Amp+ and K+).$Kanamycin concentration?HindIII EcoRcoR I5. Transform MLCK 1st lox P to EL350 to get purified MLCK 1st lox P ( Amp+ and K+) $??Note: EL350 contains multiple copies of plasmids, so there will be both recombinant and unrecombinant plasmids in EL350.6. 1st lox P pop out (Amp+ and K+ Amp+)1.Pick up a single colony of EL350 to 3ml LB, grow at 32℃ O/N (12-16h)2.Next day, incubate 1 ml of O/N culture to 50 ml LB, 32 ℃ for 2h to OD600≈0.4.3.Induce EL350 with 1mg/ml Arabinose at 32 ℃ for 1h.From this step, all on ice or in 4℃4.Transfer 6ml cells to 15 ml centrifuge tube, put on ice for 15 min5.Spin at 3500 rpm for 6 min, resuspend cells with 1.5ml pH 7.4 MilliQ6.Spin ,wash twice more7.Remove supernatant, add 50 μl pH 7.4 MilliQ8. Add MLCK 1st lox P plasmid (dilution≈1:1000) to 50μl competent cells, pipettethem to an electroporation cup (0.1 cM gap).9. 1.75kV, 25μF, 200 ohms.10. Add 1ml SOC to each curvette and incubate at 32℃for 1h.11. Centrifuge at 3,500 rpm for 3 min, pour off most of the supernatant, plate cells (Amp+).Note: You can plate cells to the K+ plate to conform the pop out efficiency (No or little electroporated cells grow on the K+ plate)HindIII EcoRHindIII EcoR I7. Transform MLCK 1st lox P pop out to EL250 (Amp+)Note: There may be leaky expression of the Cre recombinase in EL350, leading to undesired excision between floxed lox P sites in the final construct.8. Targeting 2nd lox P(Amp+ Amp+ and K+)Mini-targeting vector construction1.PCR amplify 80 bp homologous arms FRT-Neo-FRT-loxP cassette (2nd lox P)from PL451.2.Ligate 2nd lox P with T vector (If the PCR product quantity is enough for later use ,this procedure is not necessary)3.Cut 1st lox P–T to get 1st lox P fragment, purify the product.Note: If you use the ligation method to construct the mini-targeting vector, two ~500bp homologous arms are ligated to the FRT-Neo-FRT-loxP cassette excised from PL451 with Eco RI and Bam HI and to PL253 that is linearized by Not I and Sal I. Transformation1.Pick up a single colony of MLCK 1st lox P pop out EL250 to 3ml LB, grow at32℃ O/N (12-16h)2.Next day, incubate 1 ml of O/N culture to 50 ml LB, 32 ℃ for 2-3h to OD600=0.53.Induce MLCK 1st lox P pop out EL250 in 42℃ water bath by shaking for 15 min From this step, all on ice or in 4℃4.Transfer 6ml cells to 15 ml centrifuge tube, put on ice for 15 min5.Spin at 3,500 rpm 6 min, resuspend cell with 1.5ml pH 7.4MilliQ6.Spin ,wash twice more.7.Remove supernatant, add 50μl pH 7.4 MilliQ8.Add 200 ng 2nd lox p fragment to 50μl MLCK 1st lox P pop out EL250, pipettethem to an electroporation cup (0.1 cM gap).9. 1.75kV , 25μF , 200 ohms.10. Add 1ml SOC to each curvette and incubate at 32℃for 1h..11. Centrifuge at 3,500 rpm for 3 min, pour off most of the supernatant and plate cells (Amp+ and K+)HindIII EcoRHindIII EcoR9. Transform MLCK 2nd lox P to DH-5α or XL1-Blue ( Amp+ and K+) to purify the targeting vectorIt is important to confirm the restriction enzyme pattern.10. LinearizationSouthern Blot Protocol1.Following electrophoresis, cut the agarose gel to size by removing any blank oruntreated lanes that do not need to be transferred.2.Soak the gel in base solution for 2×20 minutes. There is no need to be treatedwith neutralizing solution.3.Allow genomic DNA to transfer overnight in base solution.4.UV crosslink, 125mJ/cm2. Then bake at 80℃ for 30 minutes.5.Hybridize the membranes with a labeled probe.Radioactive labeling of probe(Rediprime II Random Prime Labelling System, Amersham Biosciences)1.Dilute the DNA to be labeled to a concentration of 25ng in 45ul of TE buffer.2.Denature the DNA sample by heating to 100℃ for 5 minutes in a boiling waterbath.3.Snap cool the DNA by placing on ice for 5 minutes after denaturation.4.Add the denatured DNA to the reaction tube.5.Add 5ul of Redivue [32P] dCTP and mix by pepetting up and down about 12 times,moving the pipette tip around in the solution.6.Incubate at 37℃ for 1 hour, then room temperature overnight.7.Add 125ul EtOH and 5ul NaAc, centrifuge at 10 000 rpm for 10 minutes toprecipitate DNA. Dissolve DNA in 50ul dH2O.8.For use in hybridization, denature the labeled DNA by heating to 100℃for 5minutes, then snap cool on ice for 5 minutes. (without snap cooling, add hot probe into hybridization buffer, it works okey.)HybridizationInsert membrane in hybridization tube and wet with 65℃hybridization buffer. Increase volume slightly to adequately cover the membrane (approximately 5ml). Prehybridize at 65℃for 30~45 minutes. Replace the solution with freshhybridization buffer, and heat-denatured probe. Hybridize overnight while gently rotating at 65℃.Post hybridization treatmentWash the membrane in ~50ml of 2×SSPE, 0.1% SDS, 1mM EDTA (these is no difference whether the wash buffer is at 65℃ or room temperature) for 2×15 minutes. Wash twice for 15 minutes per wash in 0.2×SSPE, 0.1% SDS, 1mM EDTA at 65℃.RecipesBase Solution (1.5M NaCl, 0.5M NaOH)For 2 liters:175.35g NaCl40g NaOHQS to 2 liters with water and autoclave.20×SSPE (3M NaCl, 0.2 M NaH2PO4, 20mM EDTA, pH7.0)350.7g NaCl55.2g NaH2PO4(H2O) (or 48g anhydrous NaH2PO4)14.89g EDTADissolve in boiling water, cool to room temperature, and adjust pH to 7.0 with NaOH. QS to 2 liters with water and autoclave.2×SSPE 0.1% SDS, 1mm EDTA100 ml of 20×SSPE10 ml of 10% SDS2 ml of 0.5M EDTAQS to 1 liter with distilled water, skip autoclaving.0.2×SSPE 0.1% SDS, 1mm EDTA10 ml of 20×SSPE10 ml of 10% SDS2 ml of 0.5M EDTAQS to 1 liter with distilled water.Prepared byPeng Yajing & He Weiqi。

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