16S rRNA基因高通量测序分析 牛粪发酵相关细菌多样性
基于16S rRNA和宏基因组高通量测序的微生物多样性研究
基于16S rRNA和宏基因组高通量测序的微生物多样性研究摘要：微生物研究从人工分离培养开始，但是，大部分微生物无法在实验室条件下生存，这对微生物多样性研究产生直接的影响。
基于此，在高通量DNA测序技术的应用下，以16S rRNA和宏基因组高通量测序为基础，对微生物多样性展开研究，并以水体微生物、人体舌苔微生物（变量为是否有胃病）对比为研究对象，旨在实现16S rRNA和宏基因组高通量测序在微生物多样性研究中的应用效果提升。
关键词：16S rRNA；宏基因组；微生物；多样性引言：从不同的角度出发，选择多种指数对微生物多样性进行度量分析，可以以系统发生树或者基本可操作分类单元为主，在实际操作过程中，则需要利用树形结构标识不同微生物之间的进化距离。
基于此，以16S rRNA和宏基因组高通量测序为基础，以水体微生物、人体舌苔微生物（变量为是否有胃病）为样本，并对微生物多样性展开讨论，结合微生物序列数、不同分类水平的分类单元以及测序深度，实现微生物多样性特征及规律的检验与分析[1]。
116S rRNA基因与宏基因组高通量测序数据分析在对16S rRNA与宏基因组测序进行分析时，以数据预处理、可操作分类单元划分、物种分类以及丰度信息注释的方式进行处理。
一方面，16S rRNA的测序过程是化学反应过程，在试剂或者实验环境等因素的变化，以DNA测序为基础，在对测序的质量控制进行分析时，提出含有未识别的碱基，根据序列的最低、平均或者类似准则来提出低质量序列。
在此基础上，还需要进行双端序列拼接，由于不同物种高变区长度不同，所以需要确定重叠区域的位置，在实际研究的过程中，利用PANDAscp来完成双段序列连接。
在预处理的过程中，以混合样本分离为最终目标，而且，以OYU为基础，通过序列比对相似度阈值的16S rRNA基因序列聚类分析，获得序列集合[2]。
在利用统计模型的基础上，从序列参数以及物种类分类的角度进行控制，假设有k个OTU时，N为测序数据，则其概率公式如下：在上述公式中，为k个高斯分布的混合比例，、为高斯分布的均值以及方差参数。
西藏米拉山土壤古菌16SrRNA及amoA基因多样性分析
Research Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(8):994-1002;4August 2009ISSN 0001-6209;CN 11-1995 Q http: actamicrocn基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2009CB119000);公益性行业(农业)科研专项经费项目(NYHYZX07 050)*通信作者。
Tel Fax:+86 10 82109545;E mail:xiebingyan2003@作者简介:孟祥伟(1981-),女,籍贯,硕士研究生,研究方向为土壤微生物分子生态。
E mail:xiaowei031@163 c om 收稿日期:2009 03 23;修回日期:2009 04 27西藏米拉山土壤古菌16S rRNA 及amoA 基因多样性分析孟祥伟,茆振川,陈国华,杨宇红,谢丙炎*(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)摘要: 目的 本研究旨在了解西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌及氨氧化古菌群落结构组成情况。
方法 采用未培养技术直接从土壤中提取微生物总DNA,分别利用通用引物构建古菌16S rRNA 基因和氨氧化古菌a moA 基因克隆文库。
利用DOTUR 软件将古菌和氨氧化古菌序列按照相似性97%的标准分成若干个可操作分类单元(OTUs)。
结果 通过构建系统发育树,表明古菌16S rRNA 基因克隆文库包括泉古菌门和未分类的古菌两大类,并且所有泉古菌均属于热变形菌纲。
氨氧化古菌amoA 基因克隆文库中序列均为泉古菌。
古菌16S rRNA 基因和古菌amoA 基因克隆文库分别包括64个OTUs 和75个OTUs 。
结论 西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌多样性比较丰富,表明古菌在高寒草甸土壤的氮循环中可能具有重要的作用。
关键词:古菌;16S rRNA 基因;amoA 基因;系统发育分析中图分类号:Q939 文献标识码:A 文章编号:0001 6209(2009)08 0994 09 古菌作为三域之一的生物[1],具有其独特的性质,也是目前生物地球化学研究的热点之一。
牦牛源产细菌素的乳酸菌的筛选鉴定
牦牛源产细菌素的乳酸菌的筛选鉴定周晏阳;孔雪英;吴梅;罗雪;汤承【摘要】为筛选优良的产细菌素乳酸菌,用含0.5％碳酸钙的MRS固体培养基从19份牦牛粪便样本中分离出91株乳酸菌,进一步采用牛津杯法筛选产细菌素的乳酸菌,并结合16S rRNA序列扩增测序鉴定该批乳酸菌.结果表明:在排除有机酸、过氧化氢等抑菌因素后,从91株乳酸菌中筛选到9株对大肠杆菌ATCC25922和金葡球菌ATCC25923有明显抑制作用的乳酸菌菌株,该9株菌株对蛋白酶敏感,初步认定为产细菌素乳酸菌;经16S rRNA序列扩增测序鉴定该9株菌分别为海氏肠球菌,屎肠球菌,蒙氏肠球菌株和植物乳杆菌,其对常见抗生素不耐药,可作为益生菌的候选菌株.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(043)004【总页数】7页(P331-337)【关键词】牦牛;细菌素;乳酸菌【作者】周晏阳;孔雪英;吴梅;罗雪;汤承【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S852.6乳酸菌是一种被普遍认为安全的微生物，其代谢过程中会分泌很多代谢产物，如有机酸、过氧化氢和细菌素等[1].其中细菌素是由细菌核糖体合成的抗微生物肽，既可以抑制食品中腐败微生物和致病微生物的生长，又可以被人体内蛋白酶降解而不具有耐药性，因而在开发食品天然防腐剂和抗生素替代品领域有广阔的应用前景[2-3].牦牛是青藏高原地区特有畜种，是牧民赖以生存的生产资料和生活物资，其对空气稀薄、高寒、牧草生长期短的高原恶劣生态环境具有良好的适应能力[4-5]，牦牛源产细菌素乳酸菌不仅对高原环境以及牦牛肠道环境有更强的适应力，抑制牦牛肠道病原菌，从而减轻牦牛腹泻问题，还可以促进牦牛生长发育，调节机体免疫，促进肠道发育和局部抵抗力，在食品安全方面也具有十分重要的意义[6].目前，关于牦牛源产细菌素乳酸菌的筛选鉴定鲜有报道.鉴于此，本研究从牦牛粪便样品中分离鉴定和筛选产细菌素乳酸菌的分离、筛选、鉴定，为开发牦牛益生菌提供试验依据.1.1 菌株与试剂川西北牦牛粪便采集于川西北高原.指示菌株金葡球菌(ATCC25923)和大肠杆菌(ATCC25922)均由西南民族大学动物医学实验室鉴定保存.MRS固体培养基、MRS肉汤培养基、药敏片、MH培养基，购自杭州微生物试剂有限公司；蛋白酶K、过氧化氢酶，购自Solarbio公司；PCR反应各类试剂、DL 2000 DNA Marker、DNA Marker 1，购自大连宝生物公司.1.2 乳酸菌的分离纯化称取2 g新鲜牦牛粪便样品于20 mL无菌水中，震荡混匀后以10倍系列稀释，分别取不同稀释度样品在无菌条件下接种于0.5%碳酸钙MRS固体培养基[7]，37℃恒温培养箱静置培养48 h，挑取具有溶钙圈的单个菌落进行革兰氏染色，显微镜观察为革兰氏阳性菌株后的接种于MRS固体培养基纯化，37℃恒温培养箱静置培养24 h，筛选出的菌株编号后保存备用.1.3 筛选产细菌素乳酸菌的鉴定1.3.1 无细胞发酵上清液的制备挑取单菌落接种到MRS肉汤培养基，37℃恒温箱静置培养24 h，后10000×g，4℃离心15 min取得上清液.上清液用0.22 μm滤膜过滤，除去菌体及其他的杂质[8].1.3.2 筛选将发酵上清液使加入牛津杯中测定其抑菌活性.指示菌分别为大肠杆菌ATCC25922和金葡球菌ATCC25923.检测平板选用营养琼脂培养基，每个平板固定为15 mL.用移液枪吸取0.3 mL指示菌菌悬液至检测平板上，用无菌玻棒均匀涂布，并用眼科镊将无菌牛津杯置于平皿中，在水平置于无菌操作台中的培养皿中均匀放置3只牛津杯，4℃冰箱静止8 h待上清液扩散完全，放入37℃恒温箱培养12 h后观察结果.1.3.3 有机酸和过氧化氢排除试验乳酸菌在发酵过程中会分泌一些酸类物质，为移除酸性物质的干扰，将上清液pH 用氢氧化钠溶液从4.0均调至6.0，同时加入过氧化氢酶处理，并且用相同pH的MRS肉汤培养基作为空白对照[9].1.3.4 蛋白酶消化乳酸菌发酵上清液试验把蛋白酶K溶解在双蒸水中配成2 mg/mL的母液.按体积比1:1的比例加入发酵上清液，在蛋白酶最适温度用水浴锅孵育1 h后，检测抑菌活性[10].1.3.5 产细菌素菌株的分子鉴定提取产细菌素菌株基因组DNA作为模板[11]，采用细菌16S通用引物扩增16S rRNA序列并测序鉴定.1.4 产细菌素乳酸菌系统发育分析将筛选的产细菌素乳酸菌双向测序后拼接并去除多余的序列得到的16s rRNA编码区核苷酸序列片段，使用MEGA 5.0截去多余片段，Bootstrap Replications设定为1000，建立乳酸菌同种间系统发育进化树；同时对与16s rRNA序列同源性高于97%的乳酸菌进行系统进化分析，建立属间进化树，分析牦牛胃肠道乳酸菌的遗传进化关系.1.5 对抗生素的敏感性试验试验菌株的制备，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌(ATCC25922)质控菌株种子液以1%接种于3 mL TSB，180 rpm，37℃摇菌6 h.植物乳杆菌种子液以1%接种于4 mL MRS肉汤，37℃静置培养12 h.用无菌棉拭子蘸取已经校正的0.5麦氏比浊浓度的乳酸菌菌液，均匀地涂布整个MH培养基表面.取阿莫西林、氨苄西林、链霉素、氯霉素、利福平、环丙沙星、诺氟沙星、米诺环素、四环素药敏纸片贴于平板表面，每个平板贴4张纸片.每个平板各设三个平行组.用大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)做质控菌株，37℃培养12 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径[12].2.1 乳酸菌的分离本实验共从19份川西北牦牛粪便样品中分离得到91株有明显的溶钙圈且革兰氏染色呈蓝紫色的阳性菌，初步判定为乳酸菌.2.2 产细菌素乳酸菌的筛选利用牛津杯法从91株乳酸菌中筛选出63株乳酸菌对指示菌株有明显的抑制作用.如图2所示，乳酸菌发酵上清液对指示剂有抑制作用，排除了酸和过氧化氢的影响后，抑菌圈减小.排除酸影响的发酵上清液经蛋白酶K处理后，其抑菌活性完全丧失.通过筛选最终只有9株乳酸菌的抗菌物质为蛋白质或肽类.2.3 产细菌素菌株的16S rRNA序列扩增鉴定由图3可知目的片段在1500 bp左右，通过NCBI比对9株乳酸菌，BLAST比对的结果显示为SWUN5816、SWUN5817、SWUN5818、SWUN5819为海氏肠球菌，SWUN5820、SWUN5821、SWUN5822为屎肠球菌，SWUN5823为蒙氏肠球菌，SWUN5815为植物乳杆菌.2.4 产细菌素乳酸菌系统发育分析根据16S rRNA序列测序结果，将它们与GenBank中不同来源的海氏肠球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌相同区段基因序列构建系统进化树，由于蒙氏肠球菌分离源较少所以不做进化树.从图4中可以看出11株植物乳杆菌分为两大支，植物乳杆菌SWUN5815与绵羊和山羊的遗传进化关系较近.从图5可以看出，4株海氏肠球菌聚集在一起，与鱼源的关系较近.从图6中可以看出，10株屎肠球菌分为两大支，3株屎肠球菌聚集在一起与鸡源屎肠球菌分布在一个大支上.2.5 产细菌素乳酸菌抗生素敏感试验结果根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B纸片扩散法检测乳酸菌对多种药物的敏感性.由表1可知:牦牛源植物乳杆菌SWUN5815对常用的9种常用抗生素敏感.本研究从分离自19份牦牛粪便样品的91株乳酸菌中筛选出9株产细菌素乳酸菌，并通过16S rRNA鉴定为1株植物乳杆菌、1株蒙氏肠球菌、3株屎肠球菌、4株海氏肠球菌.乳酸菌代谢过程中会产生很多代谢产物，如二氧化碳、有机酸、双乙酞、过氧化氢及细菌素等，有抑菌能力的主要是酸和细菌素，所以在确定细菌素的抑菌作用之前，必须排除其他代谢产物的干扰[13-14].植物乳杆菌SWUN5815对革兰氏阳性菌和阴性菌均有不同程度的抑制作用.已报道可以同时抑制革兰氏阴性菌与阳性菌的有植物乳杆菌ZJ317、P158d等[15-16].分析植物乳杆菌SWUN5815抑菌的原因，可能是该菌分泌IIa和IIb类细菌素的结果，不同种类的细菌素协同发挥作用，究竟植物乳杆菌SWUN5815产生哪些种类的细菌素，有待进一步研究.细菌素的分泌量与外界环境也有很大的关系，比如菌液培养的时间，同时抑菌实验的时候环境也要求稳定，如平板的厚度以及指示菌的浓度都需要定量. 筛选出的乳酸菌对常见的多种抗生素均表现出敏感性，并且可以有效地抑制病原微生物的生长，显示出了其作为候选益生菌株的潜力.研究报道显示，一些肠球菌属的益生菌株会对某些抗生素具有抗性，这可能与其携带的相关抗性基因有关[17-18]，但这些抗性可能是内源性的或者是天然性的，不一定具有转移性.能分泌细菌素的乳酸菌具有很好的抗微生物活性，可加以应用，但在应用时需综合考虑它们的表型及基因型特征与益生特性的关系[19-20].本研究的结果也为筛选牦牛源益生菌作为牦牛源专用微生态制剂提供参考数据.【相关文献】[1]SABO S D S，VITOLO M，GONZÁLEZ J M D.Overview of Lactobacillus plantarum，as a promising bacteriocin producer among lactic acid bacteria[J]. Food Research International，2014，64:527-536.[2]CLEVELAND J，MONTVILLE T J，NES I F，et al.Bacteriocins:safe，natural antimicrobials for food preservation.[J].International Journal of Food Microbiology，2001，71(1):1.[3]高鹏，韩金志，陆兆新，等.广谱抗菌乳酸菌的分离鉴定及细菌素的提取和纯化[J].食品科学，2016，37(11):160-166.[4]欧江涛，钟金城，白文林，等.中国牦牛的遗传多样性[J].中国牛业科学，2002，28(4):42-46.[5]郭宪，阎萍，曾玉峰，等.中国牦牛遗传资源现状分析[J].中国畜禽种业，2008(1):60-62.[6]TUO Y，ZHANG L，HAN X，et al.In vitro assessment of immunomodulating activity of the two Lactobacillus strains isolated from traditional fermented milk [J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27(3):505-511.[7]徐凤，汤承，张焕容.山羊源乳酸菌的分离鉴定及系统进化分析[J].家畜生态学报，2016，37(4):16-21.[8]CHIU H H，TSAI C C，HSIH H Y，et al.Screening from pickled vegetables the potential probiotic strains of lactic acid bacteria able to inhibit the Salmonella invasion inmice.[J].Journal of Applied Microbiology，2008，104(2):605.[9]周佳，刘书亮，胡欣洁，等.产宽谱pH细菌素乳酸菌的筛选鉴定、毒力检测及细菌素特性研究[J].食品科学，2012，33(11):194-199.[10]陈丽燕，张光祥，黄春萍，等.两株高产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及酶学特性[J].生物学通报，2011，38(4):531-538.[11]周晏阳，邱莞思，唐俊妮，等.微波加热快速提取芽孢杆菌与乳酸菌DNA[J].中国畜牧兽医，2016，43(10):2792-2796.[12]朱惠.牦牛源海氏肠球菌Swun3株对小鼠生长性能和肠黏膜免疫的影响[D].成都:西南民族大学，2016.[13]杨晓宇，张七斤，于晨龙，等.不同来源乳酸菌的耐酸耐胆盐试验[J].动物医学进展，2014，35(2):73-77.[14]黎杰，韩磊，殷文政.一株产细菌素乳酸菌的筛选及细菌素特性研究[J].安徽农业科学，2015(22):225-227.[15]王小娜，宋达峰，顾青.产细菌素乳酸菌的鉴定及其特性研究[J].中国食品学报，2011，11(3):181-186.[16]张艾青，刘书亮，敖灵.产广谱细菌素乳酸菌的筛选和鉴定[J].微生物学通报，2007，34(4):753-756.[17]SANTOS K M O D，VIEIRA A D S，SALLES H O，et al.Safety，beneficial and technological properties of Enterococcus faecium isolated from Braziliancheeses[J].Brazilian Journal of Microbiology，2015，46(1):237-249.[18]PIENIZ S，MOURA T M D，CASSENEGO A P V，et al.Evaluation of resistance genes and virulence factors in a food isolated Enterococcus durans，with potential probiotic effect[J].Food Control，2014，51:49-54.[19]BELGUESMIA Y，CHOISET Y，RABESONA H，et al.Antifungal properties of durancins isolated from Enterococcus durans A5-11 and of its synthetic fragments[J].Letters in Applied Microbiology，2013，56(4):237-244.[20]DU L，SOMKUTI G A，JR R J.Molecular analysis of the bacteriocin-encoding plasmid pDGL1 from Enterococcus durans and genetic characterization of the durancin GLlocus.[J].Microbiology，2012，158(Pt 6):1523-1532.。
基于16SrRNA测序技术的微生物组多样性分析研究
基于16SrRNA测序技术的微生物组多样性分析研究第一章入门概述在微生物学领域，了解微生物组的多样性和组成的重要性越来越受到关注。
通过对微生物组中微生物物种的鉴定和数量的测定，能够帮助我们了解微生物在不同环境中的生态功能及其对宿主的影响。
而基于16SrRNA测序技术的微生物组研究，可以直接从微生物的遗传信息入手，不但速度快、准确性高，而且可以在不同层次上研究微生物组的多样性。
本文主要介绍基于16SrRNA测序技术的微生物组多样性分析研究的基本原理、方法以及相应的应用。
第二章基本原理16S rRNA是所有细菌和古菌都具备的一种RNA，位于小亚基的30S核糖体亚基上。
其序列具有高度的起始和终止保守性，而在两端之间则存在一定的变异性。
早期16S rRNA序列的研究表明，它的高度保守性和存在变异性的特点可以用来鉴定不同的细菌和古菌，从而对微生物的分类、系统发育和进化关系进行研究。
近年来，随着高通量测序技术的不断发展，人们开始采用基于16SrRNA的高通量测序技术来研究微生物组的多样性和组成。
基于16SrRNA测序技术的微生物组研究，主要基于对微生物16SrRNA基因序列的测序和分析。
这种技术可以通过对不同体系样本中的微生物16SrRNA基因进行PCR扩增，获得大量的16SrRNA序列信息，从而对微生物组的多样性和组成进行深入研究。
第三章方法流程基于16SrRNA测序技术的微生物组分析方法主要包括样品采集、总DNA提取、16SrRNA基因的PCR扩增、高通量测序、序列质量控制、OTU聚类、分类学注释和多样性分析等若干步骤。
1. 样品采集微生物组研究的第一步是采集样品。
不同的研究目的和需要不同的样品类型，快速、高效、准确的样品采集对于后续的研究至关重要。
对于土样等环境样品，我们应该考虑样品中微生物细胞在不同深度的分布情况，采集不同深度的样品，尽可能地覆盖样品中的全部微生物种群。
对于丰富样品，如粪便、口腔、皮肤表面等，我们需要考虑样品中微生物群落在患者或者宿主的年龄、性别、健康状态等方面差异，采集不同个体的样品进行相应比较。
一株产电菌的产电性能及低温沼气发酵过程微生物群落特征
生成质子、 电子和 ＣＯ ２ 等物质ꎬ 阳极底物作为微生物
与模式菌株 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＪＣＭ ２０１９０ Ｔ ( 第二
高相似度) 和 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｒｏｆｕｎｄａ ＤＳＭ １５９００ Ｔ 属于同
图 １ ＭＦＣ 工作原理简图
一分支ꎮ
１ ３ ２ 阳极培养液的筛选
将保存在固体 ＬＢ 培养基斜面中的菌株 Ｈ１１ 接入
号为 ＯＫ５６０３５１) 分 析 发 现ꎬ 该 菌 株 与 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ 属
同源性较高ꎬ 其中与 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ ＮＣＴＣ １０７３５ Ｔ 具
有最高相似度ꎬ 为 ９８ ９１％ꎮ 基于 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因系统
发育树分析表明ꎬ 菌株 Ｈ１１ 位于 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ 属内ꎬ 且
记录ꎮ
ｂｉｏꎬ Ｃｈｉｎａ) 进行 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因高通量测序ꎮ 所有样
序列 聚 类 为 操 作 分 类 单 元 ( ＯＴＵｓ ) ꎬ 再 利 用 ＲＤＰ
Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ 软件 ( Ｖ ２ １１) 对 ＯＴＵ 代表序列进行物种注
释ꎮ
２ 结果与分析
２ １ 菌株的鉴定
对菌株 Ｈ１１ 的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列 ( ＧＥＮＥ ｂａｎｋ
度最高可达 １３ ８８ｍＷｍ －２ ꎮ 基因组解析发现了 ２８６ 个与产电相关的基因ꎬ 分布在与电子转移、 细胞色素 Ｃ 相关
蛋白和 ＮＡＤＨ 脱氢酶等 １６ 个基因家族ꎮ 为了探究低温沼气发酵过程中的微生物群落特征ꎬ 在发酵不同阶段采集
微生物样品ꎬ 利用分子生物学方法和传统微生物培养法ꎬ 随着发酵进程的推进ꎬ 微生物群落在门水平上广古菌门
１０ｍｍｏｌＬ 甲酸钠、 乙酸钠和亚铁氰化钾作为不同
牛链球菌的分离鉴定及生物信息学分析
牛链球菌的分离鉴定及生物信息学分析祖菲;段纲;项勋;李浩欣;杨志远;朱旗;代飞燕;常华【摘要】本研究对某动物医院的一头病牛粪样进行细菌分离鉴定,PCR扩增细菌16S rDNA基因并测序,构建进化树,对该菌进行药敏试验分析及生长曲线的测定.结果显示,该菌在血琼脂、巧克力琼脂、LB琼脂等培养基上均能长出光滑凸起,边缘圆润,大小各异,颜色不同的菌落,而在MRS琼脂、高盐甘露醇琼脂上却不生长;生化鉴定结果显示,乳糖、麦芽糖、甘露醇等均为阴性,葡萄糖、西蒙氏柠檬酸盐、尿素均为阳性,上述结果初步鉴定此菌为牛链球菌;进化树的构建进一步证明了分离菌属于牛链球菌,其与牛链球菌RD09的同源性为99％;药敏试验结果显示,牛链球菌对强力霉素、卡那霉素极敏感,对红霉素高度敏感,对链霉素、新生霉素、复方新诺明、头孢曲松、庆大霉素均敏感,对氯霉素、头孢拉定、阿莫西林均耐药;从牛链球菌生长曲线可看出2～23 h是牛链球菌的高度繁殖期,23～28 h是稳定期,28 h以后开始衰退.本试验结果为进一步研究牛链球菌奠定基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)011【总页数】7页(P2902-2908)【关键词】牛链球菌;分离鉴定;16S rDNA;生物信息学【作者】祖菲;段纲;项勋;李浩欣;杨志远;朱旗;代飞燕;常华【作者单位】云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S852.61牛链球菌（Streptococcus bovis）属D组链球菌，为革兰氏阳性球菌，包括7个不同的种和亚种，即马肠链球菌、解没食子酸链球菌解没食子酸亚种、解没食子酸链球菌巴氏亚种、解没食子酸链球菌马其顿亚种、婴儿链球菌婴儿亚种、婴儿链球菌结肠亚种和非解乳链球菌［1］。
16SrRNA基因序列在动物消化道细菌鉴定中的应用研究
基金项目国家自然科学基金资助项目（３０４７１２８６）。
作者简介郭海勇（１９７８－），男，吉林榆树人，助教，博士研究生，研究方向：动物微生物学与免疫学。
＊通讯作者。
收稿日期２００８!０４!１４动物消化道内附殖着大量微生物，形成复杂而动态平衡的微生物区系，动物消化道内微生物的多样性和演替一直被认为是动物微生态学研究中的热点。
动物消化道微生物菌群参与宿主对营养素的消化、吸收与合成［１－２］，刺激其免疫机制［３］，并影响宿主基因表达，可进行微生物与宿主之间的“分子对话”［４］，如果消化道内微生态平衡失调，动物机体的正常生理功能将发生紊乱，出现疾病状态。
人和动物消化道微生物细菌的分类鉴定方法一直处于不断完善之中。
传统的动物消化道微生物多样性的研究及群落结构的分析是将微生物进行分离纯化、培养，依据细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等表型特征进行初步分类，但只能研究可培养微生物，会遗漏消化道中不可培养的微生物，而且因细菌相似的表型特征和主观判断性等因素影响，尚不能给出理想的鉴定结果。
随着聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术的出现及核酸测序技术的不断完善，产生了许多新的细菌分类方法。
尤其是１６ＳｒＲＮＡ序列分析方法的出现使得细菌的进化过程可以通过试验研究来证实，这必将使人们对生物进化及与其他相关学科关系的认识更加深入。
笔者主要对１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析在动物消化道微生物分离鉴定中的应用作一简要综述，旨在为现代微生物资源的研究与开发提供一种有效手段。
１细菌１６ＳｒＲＮＡ基因特点和动物消化道微生物生态系统概述１．１细菌１６ＳｒＲＮＡ基因特点１６ＳｒＲＮＡ基因是细菌染色体上编码ｒＲＮＡ相对应的ＤＮＡ序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，是基因表达蛋白质的必经途径和载体，任何基因的突变并表现出性状都得经过１６ＳｒＲＮＡ基因。
１６ＳｒＲＮＡ基因约由１５４０个核苷酸组成，分子量较大，含有许多结构域及二级结构，包含丰富的可供区别的信息。
16SrDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性
第5卷 第10期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 102014年10月Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014基金项目: 国家质检总局科技计划项目(2011IK228)Fund: Supported by Science and Technology Planning Project of Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine(2011IK228) *通讯作者: 张建军, 高级工程师, 主要研究方向为微生物检测。
E-mail: jianjunn@*Corresponding author: ZHANG Jian-Jun, Senior Engineer, Technical Center of Shanxi Entry-Exit Inspetion and Quarantine Bureau, No.8 of Yifen Street, Taiyuan 030024, China. E-mail: jianjunn@16S rDNA 克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性张敏爱1, 张建军1*, 王子亮2, 苑 利1, 杨秀清3(1. 山西出入境检验检疫局技术中心, 太原 030024; 2. 中国合格评定国家认可中心, 北京 100062;3. 山西大学生物技术研究所, 太原 030006)摘 要: 目的 利用16S rDNA 基因文库分析法, 对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。
方法 提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA 为模板, 将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA 的PCR 产物与pMD~18T 载体连接, 构建其菌群的16S rDNA 文库。
对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST 比对。
结果 文库序列分析表明, 有53个克隆子分属3个不同的类群, 即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群,其余3个克隆子属于未知类群。
PCR-DGGE法解析牛粪厌氧发酵稳定期微生物多样性
邱学岚． 干燥后稻米品质分析【 Ｄ ］ ． 哈尔滨 ： 东北农业大学， ２ ０ ０ ５ ． 衣 淑娟 ， 冷志杰， 徐春林， 等． 水稻薄层 干燥 的试验研究 Ｉ Ｊ ｊ ． 东 北农业大学学报， １ ９ ９ ９ ， ３ ０ （ ４ ） ： ３ ７ ６ — ３ ８ １ ． 王吉泰． 非浸泡法发 芽糙米 生产工艺试验研究【 Ｄ 】 ． 哈尔滨： 东
收稿 日期 ：２ ０ １ ２ — ０ １ — ２ ８
基金项 目：黑龙江省 自 然科学基金 （ Ｚ Ｄ ２ ０ ０ ８ １ ７ ） ； 东北农业大学人才基金 （ ２ ｏ ｏ ９ Ｒ ｃ ４ ９ ） 作者简介 ：夏吉庆 （ １ ９ ５ ４ － ） ，研究员 ，博士 ，博士生导师 ， 研究方 向为生物质能源利用研究 。Ｅ － ｍ ａ ｉ ｌ ： ｘ ｊ ｑ １ ２ ３ ４ ５ ＠ ｓ ｏ ｈ ｕ ． ｃ ｏ ｎ ｒ
Ａｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ ｄ ｉ ｖ ｅｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｄ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｒ ｙ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｉ ｎ ｃ ａ ｔ ｔ ｌ ｅ ｍａ ・ ｎ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｅ ｒ ｏ ｂ ｉ ｃ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｉ ｔ ｈ ＰＣＲ— ＤＧＧＥ ／ ｘ ｌ Ａ Ｊ ｉ ｑ ｉ ｎ ｇ ， Ｍ Ａ Ｔ ｉ ａ ｎ ｙ ｉ ， Ｚ Ｈ Ｅ Ｎ Ｇ
…
ａ ｎ ａ ｅ ｒ ｏ ｂ ｉ ｃ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｉ ｔ ｈ Ｐ ＣＲ — ＤＧＧＥ ［ Ｊ ］ ． Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎｏ ￣ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａ ｇ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｙ， ｔ ２ ０ １ ３ ， ４ ４ （ ２ ） ： １ ４ ６ － １ ５ ０ ． （ ｉ ｎ Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｗｉ ｔ ｈ Ｅ ｎ ｇ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ）
【VIP专享】利用16S rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定
利用16S rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定【实验目的】1. 了解微生物分子鉴定的原理和应用。
2. 掌握利用16S rRNA基因进行微生物分子鉴定的操作方法。
3. 运用软件构建系统发育树并对微生物进行系统发育关系分析。
【实验原理】长期以来，对微生物的分类鉴定主要采用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法。
但这些传统手段均存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。
随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应( PCR) 技术的出现及核酸研究技术的不断完善，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR 指纹图、rRNA 基因（即rDNA）指纹图、16S 核糖体核糖核酸（ribosomal RNA，rRNA）序列分析等。
这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA 片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。
其中原核生物16S rRNA 基因（真核18S rRNA 基因）序列分析技术已被广泛应用于微生物分类鉴定。
核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。
其中16 S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”。
在16S rRNA分子中含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，因此很适于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。
其具体方法如下：首先借鉴恒定区的序列设计引物，将16S rRNA基因片段扩增出来，测序获得16S rRNA基因序列，再与生物信息数据库（如GenBank）中的16S rRNA 基因序列进行比对和同源性分析比较，利用可变区序列的差异构建系统发育树，分析该微生物与其他微生物之间在分子进化过程中的系统发育关系（亲缘关系），从而达到对该微生物分类鉴定的目的。
通常认为，16S rRNA基因序列同源性小于97 %，可以认为属于不同的种，同源性小于93~95 %，可以认为属于不同的属。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
平均值 Mean
0.133 0.096 0.247 0.438
标准差 SD
0.071 0.025 0.058 0.010
P值 P value
0.026 0.004 0.021
-
使用T-test分别分析了门水平上mf与m0、m1、m6的差异物种，结果见表。 mf组与m0、m1、m6组相比具有较多的变形菌门细菌（P < 0.05）和较少的 厚壁菌门细菌（P < 0.05）。
聚类分析
22
组间物种差异分析
分组 (Groups)
m0 m1 m6 mf
平均值 Mean
0.271 0.429 0.313 0.035
厚壁菌门 Firmicutes
标准差 SD
0.046 0.093 0.089 0.008
P值 P value
0.011 0.020 0.026
-
变形菌门 Proteobacteria
Shannon指数(Shannon index)
8.363 8.074 8.417 8.285 7.441 6.683 7.771 7.298 8.256 7.755 5.603 7.205 6.974 7.768 7.91 7.551
Chao1 丰富度估计量 (Chao1 richness estimator)
’s covera
ge) 0.989 0.992 0.988 0.990 0.992 0.99 0.99 0.991 0.989 0.987 0.991 0.989 0.987 0.988 0.988 0.988
注：Shannon指数：用来计算群落多样性，Shannon指数越大，说明群落多样性越高。Chao1 丰 富度估计量：用来计算群落丰度，Chao1值越大代表物种总数越多。测序深度指数：用来计算 测序的覆盖度，其数值越高，则覆盖度越好
57,113
Base(nt)
7,451,739 5,589,009 8,364,705 5,072,301 9,290,791 6,831,263 7,269,522 4,577,614 9,058,358 9,217,002 7,970,675 9,263,208 7,496,34
9
AvgLen( nt) 141 145 144 145 148 148 144 148 152 144 144 146
17
其中m0、m1、m6和mf组观测到的平均物种数分别为1440、1364、1239 和 1353 。 但 统 计 表 明 ， 所 有 各 组 间 的 观 测 物 种 数 、 Shannon 指 数 和
Chao1丰富度估计量均无显著差异（P > 0.05）。
所有个体的测序深度指数都在0.98以上，说明测序结果能够展示样品 中绝大部分的信息。
51
Effective %
85.37 85.17 83.69 82.17 85.4 81.75 82.52 82.79 86.16 87.58
77 85.13
84
每个样品的平均reads数为61310，平均长度为146nt，Q30为99.71。
12
OTU分析
为了研究样品的物种组成多样性，对所有样品的有效Tags进行聚
微生物是堆肥的生物基础
研究堆肥过程中的细菌多样性变化，对于理解牛粪堆肥过程、提高堆 肥效果，乃至开发新型堆肥益生菌剂都具有重要的意义。
之前关于堆肥过程中细菌种群的研究，大多采用实验室培养、分离、 鉴定的手段，但受培养方式的限制，仅能对粪肥中有限的细菌类别进 行分析。
16S rRNA基因可以做作为揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最 适于细菌系统发育和分类鉴定研究的指标[5]。16S rRNA基因扩增子 测序（16S rRNA gene amplicon sequencing）能够对样品中的全部 细菌进行种类和丰度鉴定，从而给环境细菌的研究提供了新的思路。
Tag数量 Tag numbers
OTU数量 OUT numbers
平均OTU数量 OUT means
m0
m0.1/m0.2/m0.3
47549/35959/51919 1590/1561/1686
1612
m1
m1.1/ m1.2/ m1.3
31354/58275/43088 1447/1689/1657
26
粪污来源不同细菌种类的多样性分析
不同畜种的排泄物细菌种群不同。 不同饲粮结构对牛粪中细菌类群及营养物含量的影响。 使用不同的抗生素对细菌类群的影响，对于畜牧场的隔离场产
生的粪污应该与大群粪污分区堆肥。
27
谢谢，请批评指正
28
分组 Groups
m0 m1 m6 mf
样品名称 (Sample names)
m0.1 m0.2 m0.3 平均 m1.1 m1.2 m1.3 平均 m6.1 m6.2 m6.3 平均 mf.1 mf.2 mf.3 平均
观测物种数 (observed_species)
1421 1392 1508 1440 1269 1388 1434 1364 1488 1333 897 1239 1333 1314 1412 1353
3
养殖粪污成为行业发展限制性因素
每头肉牛平均每天产生 30 Kg的粪便，每年牛约产生10吨的粪便， 按1000头规模的牛场计算，全年粪便总量可达到1万吨。
养殖粪污正成为环境污染的来源，10 万头牛对环境的污染相当 于100 万人口的污染程度 。
粪污处理设施是新建牛场时环评的重点考核内容 粪污处理增加了养牛业的成本
146
Q30
99.76 99.75 99.77 99.75 99.76 99.75 99.75 99.75 99.74 99.64 99.49 99.64
99.71
GC%
50.34 49.75 49.85 52.98 49.62 50.61 50.29 50.54 50.1 53.46 53.52 53.42
24
启示与建议
在循环农业中需要维持微生物的多样性
各个发酵时期的样品都有着丰富的生物多样性，且组间无显著差 异，说明发酵过程并未降低粪肥中的细菌多样性，同时也进一步 证明细菌是牛粪发酵过程的生物学基础。
由于将养殖粪便发酵后还田是实现农牧循环的重要环节，提示在 未来发展循环农业时除了需要关注宏观营养物质的循环，同时也 应该关注微生物多样性的维持。例如在沼气研究中发现，残留在 畜禽粪便中的兽用抗生素可能会抑制沼气过程，而大量的抗生素 残留会对堆肥发酵产生怎样的影响，需要进一步的研究。
测序分析S rRNA基因的V3区域 • 引物添加barcodes
9
测序分析技术路线
10
ＤＮＡ提取与ＰＣＲ扩增
牛粪基因组DNA提取结果
PCR扩增结果
不同样品使用了不同的barcode组合
11
测序数据与质控
Sample Name m0.1 m0.2 m0.3 m1.1 m1.2 m1.3 m6.1 m6.2 m6.3 mf.1 mf.2 mf.3
中原经济区农业循环技术集成与示范
16S rRNA基因高通量测序分析 牛粪发酵相关细菌多样性
报 告 人：王二耀 单 位：河南农业科学院畜牧兽医研究所 时 间：2016年10月22日
1
目录
研究背景 牛粪发酵过程中细菌多样性分析 启示与建议
2
研究背景
我国肉牛业生产方式的变迁
分散式饲养
集约化饲养
Average
Raw PE(#) 61,915 45,293 69,598 42,503 73,307 56,576 61,166 37,270 68,984 72,934 71,698 74,473
61,310
Qualified (#)
58,432 42,130 65,086 39,632 68,375 51,829 56,943 34,249 64,052 68,948 65,659 70,015
7
牛粪发酵过程中细菌多样性分析
研究目标
利用16S rRNA基因扩增子测序技术分析牛粪堆肥过程中细菌的多 样性变化规律。
采样地点
河南省新乡市河南农科牛业科技有限公司
8
技术路线
样品采集
收集牛粪
自然发酵
添加益生菌剂发酵
样品采集：
1、自然发酵0月（m0） 2、自然发酵1月（m1） 3、自然发酵6月（m6） 4、益生菌剂发酵3月（mf）
4
养殖粪污资源化处理是个双赢的方案
肉牛 养殖
养殖
种植
粪污
生物 肥料
环 境 污 染
5
养殖粪污的处理方式
直接还田：污染环境
腐熟堆肥处理：周期长，效果不稳定
生产沼气：沼液处理难度更大
无害化处理：成本过高
• 固液分离 • 废水回收 • 生物发酵 •…
成本与效果 是选择粪污处理方式的关键因素
6
14
其中厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门的细菌数量总和占到了各
组样品中细菌总数的70%以上。
15
样品复杂度分析（Alpha Diversity）
通过样本的复杂度分析可以反映样品内的细菌群落的丰富度和多 样性。
物种累积曲线（species accumulation curves） 16
各个样品的细菌群落多样性
23
结论
新鲜牛粪、自然发酵1个月、自然发酵6个月的牛粪中细菌种群并 没有明显的变化规律，说明自然发酵过程主要依赖于新鲜牛粪中 携带的细菌种群；
添加益生菌发酵后，细菌种群明显不同于自然发酵过程中的细菌 种群，其中变形菌门（Proteobacteria）细菌显著增加，而厚壁 菌门（Firmicutes）细菌显著减少，说明益生菌剂能够显著改变 堆肥过程中的细菌种群。