14细胞活力测定
MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究
MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究王家敏;平玲;沈武玲;徐水林;魏园园;马忠仁;乔自林【摘要】分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、北京协和细胞资源中心及某企业引进4株MDCK细胞系,扩大培养后液氮冻存,分别建立种子细胞库和工作细胞库.细胞复苏后分别对每株细胞进行了活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究.结果表明,4个来源的MDCK细胞均呈上皮型,生长状态良好；生长曲线呈S型；细菌、真菌、支原体检测都为阴性；染色体2n=78；外源质粒在该细胞中能进行复制和表达.建立的细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了基础理论依据和细胞资源.%Four cell lines were imported form ATCC, CCTCC, Xiehe Cell Resource Center of Beijing and a factory, and then these four cell lines were preserved with liquid nitrogen. Observations on morphology, dynamic growth, microbial contamination, analysis of karyotype and fluorescin plasmid transfeetion and expresstion were carried out. The results showed that all the cell lines were epithelioid and grew well. The growth curve of MDCK cells were all "S". The tests for bacteria, fungi, virus and mycoplasma were all negative. The chromosomes were 78. The exogenous plasmid could copy and express in the cell. Those results show that the MDCK cell bank is established successfully, which lays the foundation of the work bases for the research of MDCK cell and influenza vaccine.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2012(040)012【总页数】5页(P1231-1234,1261)【关键词】MDCK细胞系;细胞库;生物学特性【作者】王家敏;平玲;沈武玲;徐水林;魏园园;马忠仁;乔自林【作者单位】甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州 730030;兰州民海生物工程有限公司,甘肃兰州730010;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州 730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1MDCK细胞系（Madin-Darby canine kidney cells）是从犬肾组织中分离培养获得的上皮样贴壁细胞，该细胞系可连续传代[1]。
阿尔玛蓝试剂测定细胞活力的原理
阿尔玛蓝试剂测定细胞活力的原理简介阿尔玛蓝（Alamar Blue）试剂是一种常用于测定细胞活力的荧光染料，其原理基于细胞的代谢活性和氧化还原状态的变化。
该试剂可以通过颜色的变化来间接地反映细胞的活力水平，广泛应用于细胞生物学和药物筛选等领域。
本文将详细介绍阿尔玛蓝试剂测定细胞活力的原理以及操作步骤。
实验原理细胞活性的代谢过程细胞的活性主要通过代谢反应来维持和表现。
细胞的代谢反应包括细胞的有氧呼吸和氧化还原反应。
有氧呼吸是细胞中产生能量的重要过程，通过氧化糖类和脂肪类物质来产生ATP。
而氧化还原反应则涉及到细胞内一系列的氧化还原对，包括NADH/NAD+、NADPH/NADP+等。
这些氧化还原对的变化不仅反映了细胞代谢活性的变化，也直接影响了细胞的生理功能。
阿尔玛蓝试剂的工作机制阿尔玛蓝试剂是一种荧光染料，其主要成分为有机物二氟二甲酰胺（Resazurin）。
在无细胞存在的情况下，二氟二甲酰胺以蓝色形式存在。
然而，当细胞存在时，细胞的代谢活性会导致有氧呼吸和其他氧化还原反应的进行，产生还原型二氟二甲酰胺（Resorufin）。
还原型二氟二甲酰胺的荧光比蓝色形式强，可在可见光波段（530-560 nm）进行检测。
阿尔玛蓝试剂的应用原理根据阿尔玛蓝试剂的工作机制，我们可以利用其荧光信号的强度来间接反映细胞的活力水平。
一般情况下，细胞活力高的样本会导致阿尔玛蓝试剂的荧光信号较强，而细胞活力低的样本则会导致荧光信号较弱。
通过测量样本中的荧光信号强度，并与对照组进行比较，我们可以评估细胞的活力水平。
操作步骤实验准备1.准备培养皿和细胞培养试剂（包括培养基、胎牛血清等）。
2.提前制备适量的阿尔玛蓝试剂。
根据实际需要，将阿尔玛蓝试剂按照推荐浓度配制好。
细胞处理1.将要检测细胞的培养皿取出，将旧培养液倒出。
2.加入足够的培养基，以洗涤细胞表面的杂质和减少胎牛血清的影响。
3.将细胞培养皿放入振荡器中，以适当速度振荡培养皿，以保证培养基均匀覆盖细胞表面。
(完整版)免疫学及免疫学检验学+题库答案
一、名词解释第1章概论1.免疫学：2.免疫分子：3.补体：4.临床免疫学：第2章抗原抗体反应5.抗原抗体反应：6.抗原抗体反应特异性7.可逆性8.比例性9.抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalence）10.最适比（optimalratio）11.带现象（zonephenomenon）第3章免疫原和抗血清的制备12.免疫原(immunogen)13.半抗原14.免疫佐剂15.多克隆抗体(polyclonal antibody, pcAb)第5章凝集反应16.凝集反应17.直接凝集反应18.间接凝集反应19.明胶凝集试验第6章沉淀反应免疫学及免疫学检验试卷第1页（共13页）20.沉淀反应21.絮状沉淀试验22.免疫浊度测定23.凝胶内沉淀试验24.单项扩散试验25.双向扩散试验26.免疫电泳技术27.对流免疫电泳28.火箭免疫电泳29.免疫电泳30.免疫固定电泳第19章补体检测及应用31.补体32.免疫溶血法33.补体结合试验第22章感染性疾病与感染免疫检测34.感染第23章超敏反应性疾病及其免疫检测35.超敏反应36.Ⅰ型超敏反应37.Ⅱ型超敏反应38.Ⅲ型超敏反应39.Ⅳ型超敏反应第24章自身免疫性疾病及其免疫检测40.自身耐受41.自身免疫免疫学及免疫学检验试卷第2页（共8页）42.自身免疫病43.自身抗体44.抗核抗体第25章免疫增殖性疾病及其免疫检测45.免疫增殖性疾病46.免疫球蛋白增殖病47.本周蛋白48.血清区带电泳49.免疫电泳50.免疫固定电泳第26章免疫缺陷性疾病及其免疫检验51.免疫缺陷病52.获得性免疫缺陷综合征第27章肿瘤免疫与免疫学检验53.肿瘤免疫学54.肿瘤抗原55.肿瘤标志物第28章移植免疫及其免疫检测56.移植57.主要组织相容性复合体58.移植排斥反应59.移植物抗宿主反应(GVHR)60.血清学分型法二、填空题。
免疫学及免疫学检验试卷第3页（共13页）第1章概论1.推动现代生命科学前进的三架战车：分子生物学、免疫学、细胞生物学。
鉴定细胞活性的实验方法
能发生质壁分 离的 ， 表示这些细胞
是活的 ； 不能发 生质壁分离 的， 表示这些 细胞是死 的。
有的碎屑的一端 ， 在染液 中涂抹几 下 ， 上盖玻 片。 放 盖
②观察 线粒体 ： 在高 倍显微镜 下观察经过 染色 的的人
染色 １ ２ ｒ ｎ ０～ ０ ｉ 后倾 出溶液 ， 自来水 反复冲洗种子 ， ａ 用
３ １ 原理 健 那绿染液 是专一性染线 粒体 的活 细胞 ．
染料 ， 它可穿过 活细胞 膜进入 细胞 内。线粒 体 中细胞 色素氧化酶能 够使 染料 保持 氧化状 态 （ 即有 色状 态 ）
则部分活细胞也会着色 ， 会干扰计 数。
３ 健 那 绿 染 色 法
４ ３ 实验 步骤 ．
①先将待测 种子用水浸泡 ３— ｈ 待 ４，
充分 吸胀后取 出一部 分种子 ， 水 中煮 沸 ３～ ｍｉ， 在沸 ５ ｎ
作为死种子。②取 浸好 的新种 子、 陈种子 和死 种子各
５ ， ０粒 如为小 麦和 玉米 ， 则用 单面 刀 片沿胚 部 中线纵 切成两半 ， 中一半 用于测 定。③ 将备好 的种子 分别 其 放在培养皿 内 ， 加入红墨水溶液 ， 以浸没种子 为度。④
２３ 实验步骤 ①制备酵母菌细胞悬液 。②染 色 ： ． 取
９ Ｌ酵母菌细胞 悬液 移入 试管 中 ， １ Ｌ０ ４ 台盼 ｍ 加 ｍ ． ％
蓝溶液 ， 混匀 ， 然后用吸管滴 加到血球计数板上 的盖玻
４ ２ 仪 器药品及材料 ① 红墨水溶 液的配制 ： ． 取市售
红墨水稀释 ２ 倍 （ 份红墨水加 ｌ ０ １ ９份 自来 水 ） 作为染
０ ３／ Ｌ 糖 溶 液 。 ．ｇ ｍ 蔗
cellviabilityassay计算公式
cellviabilityassay计算公式1.细胞活力实验是一种常用的细胞生物学技术。
Cell viability assay is a commonly used technique in cell biology.2.通过细胞活力实验可以评估细胞的存活率和健康状况。
Cell viability assay can assess the cell survival rate and health status.3.细胞活力实验可以使用不同的试剂和方法来进行。
There are various reagents and methods that can be used for cell viability assay.4.一般情况下，乙酰四甲基溴化锂（MTT）试剂是常用的评估细胞活力的方法之一。
In general, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay is commonly used for assessing cell viability.5.细胞活力实验的计算公式可以根据具体的实验目的和细胞类型来确定。
The calculation formula for cell viability assay can be determined based on specific experimental purposes and cell types.6.评估细胞存活率可以帮助科研人员了解细胞对各种外部因素的抗性。
Assessing cell survival rate can help researchers understand the resistance of cells to various external factors.7.研究细胞存活率对于药物筛选和毒性测试具有重要意义。
基于网络药理学和实验验证探究狼毒大戟醇提物治疗肝细胞癌的分子机制
网络出版时间：２０２３－０６－１５１５：１４：３６ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ２／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０６１４．１５４８．０４７．ｈｔｍｌ◇网络药理学◇基于网络药理学和实验验证探究狼毒大戟醇提物治疗肝细胞癌的分子机制田辛晨１，３，王浩辰２，张一鸣３，张家琪３，张登甜２，颜廷昊１，３，赵 静３，蒋树龙１，３（１．山东大学齐鲁医学院，山东济南 ２５００００；２．济宁医学院临床医学院，山东济宁 ２７２０００；３．济宁医学院附属济宁市第一人民医院，山东济宁 ２７２０００）收稿日期：２０２３－０２－２２，修回日期：２０２３－０４－１２基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ８１８７３２４９）；山东省青年泰山学者资助计划（Ｎｏｔｓｑｎ２０１９０９２２）；山东省自然科学基金（ＮｏＺＲ２０２２ＭＨ３１９）作者简介：田辛晨（１９９５－），男，硕士生，研究方向：肿瘤内科学，Ｅ ｍａｉｌ：ｔｘｃ０８１７＠１２６ ｃｏｍ；赵 静（１９８８－），女，副主任药师，研究方向：中药抗肿瘤药效评价，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：９９５２０１６２０＠ｑｑ．ｃｏｍ；蒋树龙（１９７９－），男，主任医师，研究生导师，研究方向：中医药抗肿瘤，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｊｎｓｌｊｉａｎｇ＠１６３．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２１１００３文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０７－１３５４－０８中国图书分类号：Ｒ２８２ ７１；Ｒ３１９；Ｒ３２９ ２８；Ｒ３４５ ５７；Ｒ７３５ ７摘要：目的 基于网络药理学和实验验证解析狼毒大戟醇提物治疗肝细胞癌作用机制。
方法 通过ＴＣＭＳＰ、ＳｗｉｓｓＡＤＭＥ、ＳｗｉｓｓＴａｒｇｅｔＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ数据库以及参考文献获得狼毒大戟醇提物活性成分和作用靶点；运用ＧｅｎｅＣａｒｄｓ和Ｄｉｓ ＧｅＮＥＴ数据库筛选肝细胞癌相关基因；利用Ｖｅｎｎｙ平台、ＳＴＲＩＮＧ平台和Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ软件构建蛋白质－蛋白质互作网络图；使用ＤＡＶＩＤ数据库进行ＧＯ和ＫＥＧＧ富集分析。
不同晶相的草酸钙晶体引起肾上皮细胞的毒性差异
不同晶相的草酸钙晶体引起肾上皮细胞的毒性差异孙新园;姚秀琼;余凯;欧阳健明【摘要】采用扫描电子显微镜(SEM)、激光共聚焦显微镜(LSM)、流式细胞仪、电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)等方法比较研究了尺寸约1.2 μm的一水草酸钙(COM)和二水草酸钙(COD)晶体对非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)的损伤差异.COM和COD均能引起Vero细胞的细胞活力和超氧化物歧化酶(SOD)活力降低、丙二醛(MDA)含量升高以及碘化丙啶(PI)红染细胞数目增多,且均呈现浓度依赖性.在相同晶体浓度时,COM的细胞毒性明显比COD强,引起细胞表面表达的粘附分子透明质酸(HA)比COD多,粘附量也显著增加.相比于COM晶体,Vero细胞更容易内吞COD晶体.COM与COD晶体对肾上皮细胞的毒性差异与晶面的离子密度以及细胞与晶体间的静电作用等因素密切相关.本文结果将有助于从分子水平上和细胞水平上阐释草酸钙结石的形成机理.【期刊名称】《无机化学学报》【年(卷),期】2016(032)005【总页数】9页(P818-826)【关键词】一水草酸钙;二水草酸钙;细胞毒性;浓度效应【作者】孙新园;姚秀琼;余凯;欧阳健明【作者单位】暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632;暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632;暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632;暨南大学生物矿化与结石病防治研究所,广州 510632【正文语种】中文【中图分类】R69;R329.2+8国家自然科学基金（No.21371077）资助项目。
＊通信联系人。
E-mail：*************.cn肾结石是一种临床常见的多发病，肾中结石的主要组分为草酸钙（CaOx）［1］，其中一水草酸钙（COM）的发生率约是二水草酸钙（COD）的2倍［2］。
COD 结石与高钙尿［3-4］，低枸橼酸水平［5］和高pH值［6］有密切的联系，而COM结石经常出现在正常尿钙情况下［7］。
PRRSV强弱毒感染PAM和Marc-145细胞入胞途径差异的研究
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）引起的猪场最重要传染病之一，给全世界养猪业造成了持续的经济损害。
减毒活疫苗免疫接种作为防控PRRS 的有效手段在全世界范围内得到广泛应用。
减毒活疫苗毒株是在猴源细胞系上连续传代获得的，导致其与亲本毒株在生物学特性上存在巨大差异，同时本实验室前期结果也提示HP-PRRSV 野毒株和疫苗毒株在入胞途径上可能存在差异。
Na +/H +交换的依赖是巨胞饮的标志性特征，阿米洛利（EIPA ）是Na +/H +交换的特异性抑制剂，细胞骨架重排在病毒的入胞过程中发挥重要作用，细胞松弛素D （Cyt D ）是肌动蛋白聚合的特异性抑制剂。
分别利用EIPA 和Cyt D 预处理PAM 和Marc-145细胞后接毒，对比强弱毒在两种细胞内病毒拷贝数、蛋白表达水平及子代病毒的释放上与空白对照组的差异。
结果表明，PRRSV 强弱毒均不利用巨胞饮途径感染Marc-145或者PAM 细胞，但强弱毒在感染不同细胞时对肌动蛋白的依赖性存在明显的区别。
本研究结果初步揭示了PRRSV 野毒株和疫苗毒株入胞过程的差异，为进一步揭示PRRSV 疫苗毒株致弱机制提供了前期基础。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；入胞途径；巨胞饮；肌动蛋白中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）04-0018-08Analysis of the Differences of the Entry Pathway of PAM and Marc-145 Infectedwith Highly Pathogenic and Attenuated PRRSVsZHU Haojie 1, GAO Fei 1, XU Jingjing 1, LIU Yuting 1, TONG Guangzhi 1, JIANG Yifeng 1, LI Guoxin 1,2(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for the Prevention andControl of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)收稿日期：2021-01-02基金项目：国家生猪现代产业技术体系（CARS-35）；国家自然科学基金（31670158）作者简介：朱豪杰，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：李国新，E-mail：*****************.cn；姜一峰，E-mail：********************.cnPRRSV 强弱毒感染P AM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究朱豪杰1，高 飞1，徐晶晶1，刘宇婷1，童光志1，姜一峰1，李国新1,2（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）2023,31(4):18-25Abstract: Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), which caused by Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is considered as the most important infectious disease to the pig industry. Immunization is considered as an effective way to control PRRS all over the world. Live attenuated vaccine which obtained by continuous generation on Marc-145 cells was considered as the most effective vaccine, the generation on allogenic cell line resulting huge biological difference compaired with their parents strains including growth characteristic. Our previous results also showed that PRRSV fi eld strain and vaccine strain might have differences in the pathway of entry the cell. Na +/H + exchange is the key characteristic of macropinocytosis, Amiloride (EIPA) is the specific inhibitors of Na +/H +exchange, Cytochalasin D (Cyt D) was widely used to inhibited actin polymerzation. The PAM and Marc-145 cells were pretreated· 19 ·朱豪杰等：PRRSV 强弱毒感染PAM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究第31卷第4期猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种急性且高度传染的病毒性疾病。
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（3）加入5毫克／毫升的MTT液（20微升／ 孔）；继续培养4小时。
（4）吸尽孔内培养液后，加入DMSO液 （150微升／孔），将培养板臵于微孔板振 荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （5）酶标仪检测各孔OD值（检测波,490或 570纳米），记录结果。
经 验
接种96孔板时，细胞一定要混合均匀，每孔加在中间，尽可能不摇 晃，否则液体张力会让细胞移到孔的边缘，影响生长。
操作步骤
（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103104细胞/孔，每孔培养基总量100-200微 升（各孔保持一致），37℃、5％CO2培养 箱中培养一段时间（待细胞进入指数生长期） （2）根据实验目的加入一定药物或试剂（一般 倍比稀释法设计至少5个浓度梯度，每个浓 度3-5个复孔），培养24、48、72h（根 据具体实验条件而定）
经 验
MTT避光保存，一般可用1-2周
DMSO 腐蚀微量加样器，切记注意 还可用酸化的10%SDS或5%异丁醇 代替DMSO 还原的MTT在460-630nm均有较好的吸收峰，因此有人用490、 570，也有单波长双波长之分（校正波长630） 在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的 吸收值应该在0.7-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸 收值可能已经超出线性范围。 建议CCK-8法替代 可用于求药物的IC50（半抑制率）
实验步骤
1、注意实验过程的记录：详细 2、细胞传代至96孔板（如培养时间较长，可接种密度 可选择103），注意观察生长状态和加药时间.注意： 一般加药前一天换液 3、加药。柴胡，母液40ug/ul。倍比稀释法稀释（无 菌状态培养液稀释，稀释倍数各组讨论自定，做好记 录），然后加药，各孔的最终量一致。一般用药终浓度 单位为ug/ml.做好记录 4、培养一定时间后MTT测定不同浓度OD值
实验四
细胞活力测定——MTT法
培养细胞活力测定
1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成 的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来 表示细胞的增殖能力
克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠
2. 化学染色法
死细胞着色法（台盼蓝、氨基黑、赤藓红B）、活细 胞着色法（结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝） 台盼蓝法
96孔板四周的孔一般不作培养液、MTT、DMSO）；
2、正常对照孔（细胞、培养液、MTT、DMSO） 可选3、阳性对照（细胞、已知的有明显作用效果的药物如顺铂、培 养液、MTT、DMSO ）。 可选4、阴性对照（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT、DMSO）
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞
中的百分比表示细胞活力
3. 比色法——MTT、XTT、CCK8 等
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝 四吐盐比色法的原理：活细胞线粒体中脱 氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲 臜（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞 没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积 在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、 细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。