分子生物学之转化技术
质粒转化方法
质粒转化方法质粒转化是分子生物学中常用的实验技术，用于将外源DNA导入到宿主细胞中，从而实现基因的表达或功能研究。
在实际的科研工作中，选择合适的转化方法对于实验结果的准确性和稳定性至关重要。
本文将介绍几种常用的质粒转化方法，希望能对科研工作者有所帮助。
一、化学转化法。
化学转化法是最常用的一种质粒转化方法。
其基本原理是利用化学方法破坏细胞壁，使得质粒能够进入细胞内。
常用的化学转化试剂包括钙盐、PEG（聚乙二醇）等。
在实验操作中，需要注意控制转化试剂的浓度和转化条件的时间，以确保转化效率和细胞存活率。
二、电转化法。
电转化法是利用电脉冲的作用，使得细胞膜发生短暂的通透性增加，从而促进质粒的进入。
这种方法通常需要借助电转化仪器，操作相对复杂，但转化效率较高，适用于一些难转化的细胞。
三、热激转化法。
热激转化法是利用热激和质粒DNA之间的相互作用，使得质粒能够进入细胞内。
在实验操作中，通常将细胞与质粒混合后进行热激，然后迅速降温，以促进质粒的转化。
这种方法操作简单，适用于一些对转化条件敏感的细胞。
四、化学热激联合转化法。
化学热激联合转化法是将化学转化和热激转化两种方法相结合，以提高转化效率。
在实验操作中，先利用化学方法破坏细胞壁，然后进行热激，从而使得质粒能够更有效地进入细胞内。
这种方法综合利用了化学和热激的优势，适用于一些对转化效率要求较高的实验。
五、自然转化法。
自然转化法是一种利用细胞自身特性进行转化的方法。
一些特定的细胞在一定条件下能够自发地吸收外源DNA，实现质粒转化。
这种方法操作简单，但转化效率较低，适用于一些对转化效率要求不高的实验。
总结。
在选择质粒转化方法时，需要根据实验的具体要求和细胞的特性进行合理的选择。
化学转化法适用于大多数细胞，操作简单，转化效率较高；电转化法适用于一些难转化的细胞，转化效率较高；热激转化法和化学热激联合转化法适用于一些对转化条件敏感的细胞；自然转化法适用于对转化效率要求不高的实验。
质粒转化方法
质粒转化方法质粒转化是分子生物学实验中常用的一种技术手段，它可以将外源DNA导入到宿主细胞中，从而实现外源基因的表达和功能研究。
在生物工程、基因工程、基因治疗等领域具有广泛的应用。
本文将介绍几种常用的质粒转化方法，希望能为相关研究工作者提供一些参考和帮助。
一、化学法转化。
化学法转化是一种简单、快速、经济的质粒转化方法。
其基本原理是利用化学方法破坏细胞壁，使质粒DNA得以进入细胞内。
常用的化学法转化试剂包括钙离子、PEG（聚乙二醇）等。
在实验操作中，首先将目标细胞与质粒DNA混合，然后加入适当的转化试剂，经过短时间的热激冲或冷冻解冻处理，使质粒DNA成功转化入细胞内。
这种方法操作简便，适用于大多数细胞类型，但转化效率较低，通常需要进行筛选和鉴定。
二、电穿孔法转化。
电穿孔法转化是利用电场作用使细胞膜发生瞬时孔道，从而实现质粒DNA进入细胞内的方法。
在实验操作中，首先将目标细胞与质粒DNA混合，然后将混合物置于电穿孔仪中，施加特定的电场脉冲，使细胞膜发生瞬时通透性，促使质粒DNA进入细胞内。
这种方法转化效率较高，适用于多种细胞类型，但操作相对复杂，需要专门的仪器设备。
三、病毒载体法转化。
病毒载体法转化是利用病毒作为载体，将外源基因导入到宿主细胞中的方法。
常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。
在实验操作中，首先将目标细胞与携带外源基因的病毒载体接种，经过一定的培养和复制过程，使外源基因得以表达和复制。
这种方法转化效率高，能够实现稳定的基因表达，但存在病毒安全性和生物安全性的风险。
四、基因枪法转化。
基因枪法转化是利用基因枪将微粒金属载体上携带的质粒DNA直接“枪击”入植物细胞中的方法。
在实验操作中，首先将微粒金属载体与质粒DNA混合，然后装载到基因枪上，通过氦气或子弹等加速装置，将微粒金属载体“枪击”入植物组织细胞中。
这种方法适用于植物细胞转化，操作简便，转化效率较高，但对基因枪的制备和操作要求较高。
总结。
分子生物学常用技术(二)
分子生物学常用技术（二）引言概述:本文旨在介绍分子生物学中常用的技术，以帮助读者全面了解分子生物学研究的方法和工具。
本文将重点介绍分子生物学常用技术（二），包括基因克隆、PCR、DNA测序、基因编辑和蛋白质表达等。
正文:一、基因克隆1. 酶切与连接：通过使用特定限制酶对DNA进行切割，然后使用DNA连接酶将不同DNA片段连接起来。
2. DNA片段扩增：利用聚合酶链反应（PCR）扩增目标DNA片段，得到大量复制的目标片段。
3. 质粒构建：将目标基因片段插入质粒中，构建重组质粒，然后将其转化到宿主细菌中。
二、PCR1. 反应体系：PCR反应需要引物、模板DNA、琼脂糖等成分，同时需要在适宜的温度条件下进行。
2. 热循环：PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。
通过不断重复这三个步骤，可以扩增目标DNA序列。
3. PCR变异：通过引入突变引物或特殊PCR反应体系，可以实现目标片段的定向变异。
三、DNA测序1. Sanger测序：利用DNA聚合酶反应合成，以dideoxynucleotide三磷酸（ddNTP）作为终止子，从而得到带有不同长度的DNA片段，再通过毛细管电泳分离，并借助荧光标记的ddNTP定序碱基。
2. 下一代测序：利用高通量测序平台，如Illumina、Ion Torrent等，可以同时测序大量DNA片段，从而加快和降低测序成本。
3. 新一代测序技术的应用：新一代测序技术广泛应用于基因组测序、转录组测序、甲基化测序等领域。
四、基因编辑1. CRISPR-Cas9系统：通过引入Cas9核酸酶和相应的单导RNA（sgRNA），可以实现对目标基因的精准编辑和改造。
2. CRISPR-Cas9应用：基因敲除、基因敲入、基因修饰和基因变异等应用广泛，可以用于研究基因功能和疾病治疗等领域。
3. CRISPR-Cas9技术的优缺点：CRISPR-Cas9技术具有高效、快速和精准编辑基因的优点，但也存在不确定的副作用，如非特异性剪切和细胞毒性等。
农杆菌转化法详细过程
农杆菌转化法详细过程农杆菌转化法是一种常用的分子生物学技术，用于转传基因突变体及重组蛋白多肽的制备、表达及分离的。
本文主要介绍农杆菌转化法的详细过程。
农杆菌转化法的操作有三个主要步骤：取样处理和分离、形成农杆菌转化口、添加转化用DNA。
首先，样品的提取与分离。
农杆菌的提取涉及到从硒源、含有硒的培养基中提取农杆菌，农杆菌提取涉及到培养基pH值调节，分子筛选等操作，最后用等离子体质量法（SDS-PAGE）及酶联免疫吸附试验（ELISA）确定提取物质纯度，确保它可以转化农杆菌。
其次，形成农杆菌转化口。
农杆菌转化口是通过转化DNA到农杆菌中的必要条件，通过磁性微粒把纯化的农杆菌细胞进行磁性分离，再通过诸如使用CaCl的电解液等形成转化口，只有在有转化口的条件下才能更有效地将转化DNA转入农杆菌中。
最后，添加转化用DNA。
转化用DNA经过PCR扩增后，继续采用PCR裂解方法，裂解出单个DNA条带来使转化效率更高，再将DNA转换为易溶质，用10% PEG-NaCl等转换剂将DNA溶解在体外液中，然后将溶解的DNA加入到表达农杆菌中，经过一定条件的处理和细胞培养，使转化DNA被转化到农杆菌中。
通过上述三步来完成农杆菌的转化，农杆菌转化法不仅可以将经PCR扩增得到的DNA转化到细菌中，而且具有廉价、灵活性高、可得到高细胞质丰度的特点，往往被用来实现多种克隆方法，如转位克隆、特定位置转位克隆、软杂交克隆等。
农杆菌转化法在分子生物学研究中得到了广泛的应用，如以此方法对基因组质粒进行变换，用于目的基因的插入、DNA剪切酶多肽的表达，以及重组基因的分离，这在生物工程、细胞工程及分子生物研究都有重要作用。
因此，农杆菌转化可以认为是分子生物技术中最培养最灵活的方法，能够有效地转移DNA并检测表达水平，以满足多种生物学研究和工程技术需要。
在操作中，除了上述步骤外，我们还需要注意一些其他操作。
包括：样品的正确处理、添加剂的正确添加、转化过程的室温控制、培养的液体的正确设置、转化后菌体的电解液处理和保存等步骤。
ti质粒转化的原理
ti质粒转化的原理质粒转化是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，它能够将外源DNA导入到目标细胞中。
这项技术在基因工程、遗传转化和生物制药等领域具有重要的应用价值。
在本文中，我们将深入探讨质粒转化的原理，并分享对这个主题的观点和理解。
一、质粒转化的原理质粒转化的原理是通过改变细胞膜的通透性，使质粒能够进入目标细胞。
这样一来，外源DNA就能够在目标细胞内进行重组和复制。
下面将介绍两种常见的质粒转化方法：热激转化和电穿孔转化。
1. 热激转化热激转化是一种利用温度和钙离子改变细胞膜通透性的方法。
目标细胞在低温条件下与质粒一起处理，使细胞膜发生冷冻/融化循环。
接下来，细胞在高温条件下暴露于热激，此时细胞膜通透性增加，质粒得以进入细胞内。
将细胞培养在适当的培养基上，质粒就能够在细胞内进行复制和表达。
2. 电穿孔转化电穿孔转化通过应用电场脉冲的方式改变细胞膜通透性。
目标细胞和质粒混合，形成电穿孔转化液。
将电穿孔转化液暴露于电脉冲中，电场脉冲使细胞膜产生瞬时的微小孔洞，从而使质粒得以进入细胞内。
将细胞培养在适当的培养基上，质粒能够在细胞内进行复制和表达。
二、观点和理解质粒转化作为一项重要的分子生物学技术，具有广泛的应用前景。
通过质粒转化，我们能够将感兴趣的外源DNA导入到目标细胞中，进行基因操作和功能研究。
这项技术在基因工程领域有着重要的应用，例如构建重组蛋白表达系统、揭示基因调控机制以及研究细胞信号通路等。
作为文章写手，我认为质粒转化的原理和方法对于理解基因操作和基因功能的研究具有重要意义。
通过质粒转化，我们能够探索不同细胞中的基因表达方式、调控机制以及细胞间的相互作用。
这对于研究生物学中的许多重要问题，如发育生物学、细胞信号传导、肿瘤发生等，提供了强有力的工具和方法。
质粒转化不仅在基础研究中有着广泛应用，也在农业、医药和生物制药等应用领域发挥着重要作用。
通过质粒转化技术，我们能够将外源基因导入植物细胞中，创造出具有特定性状的转基因植物。
质粒的转化
质粒的转化引言：质粒的转化是一种常用的分子生物学技术，可以将外源DNA序列导入到细胞中，实现基因的表达和功能研究。
本文将围绕质粒的转化展开讨论，介绍质粒的构建、转化方法及应用领域，以及在实验中可能遇到的问题和解决方案。
一、质粒的构建质粒构建是质粒转化实验的前提和基础。
常用的质粒构建方法包括限制性内切酶切割、连接反应、脱磷酸酶处理和酶联克隆等。
首先，通过限制性内切酶切割将目的DNA序列和质粒DNA切割成互补的末端，然后使用连接酶将两者连接起来。
接下来，通过脱磷酸酶处理去除连接反应中未连接的DNA分子，最后使用酶联克隆方法将连接好的质粒转化到宿主细胞中。
二、质粒转化的方法常用的质粒转化方法有热激转化法、电穿孔法和化学转化法。
热激转化法是将质粒与细胞一起暴露在高温下，利用热激刺激细胞膜的通透性增加，使质粒能够进入细胞。
电穿孔法是利用电场脉冲作用于细胞，使细胞膜发生破裂，并形成微小的孔道，质粒通过孔道进入细胞。
化学转化法则是利用化学试剂破坏细胞膜的完整性，使质粒能够进入细胞。
三、质粒转化的应用领域质粒转化技术在基因工程和生物医学研究中具有广泛的应用。
在基因工程中，质粒转化被广泛应用于基因克隆、基因表达和基因敲除等方面。
通过质粒转化，科研人员可以将外源基因导入到细胞中，实现目的基因的表达和功能研究。
在生物医学研究中，质粒转化技术被用于基因治疗、疫苗研发和疾病模型构建等方面。
通过质粒转化，科研人员可以将治疗性基因导入到患者的细胞中，实现基因治疗的目的。
四、质粒转化中可能遇到的问题及解决方案在质粒转化实验中，常常会遇到质粒回收率低、细胞毒性和质粒稳定性差等问题。
针对这些问题，可以采取一些措施来解决。
例如，对于质粒回收率低的情况，可以优化质粒构建和转化条件，提高质粒的产量和质量。
对于细胞毒性的问题，可以调整转化试剂的浓度和作用时间，降低对细胞的伤害。
对于质粒稳定性差的情况，可以选择具有高拷贝数的质粒或者使用质粒稳定性较好的宿主细胞。
质粒转化方法
质粒转化方法质粒转化是分子生物学中常用的实验技术，用于将外源DNA导入细胞内，实现基因工程的目的。
质粒转化方法主要包括化学法、电穿孔法、热激冲法和凝胶法等多种技术。
本文将介绍这些方法的原理和操作步骤，希望能帮助读者更好地理解和应用质粒转化技术。
化学法是最常用的质粒转化方法之一。
其原理是利用化学试剂改变细胞膜的通透性，使得质粒能够进入细胞内。
常用的化学试剂包括钙离子和聚乙二醇等。
操作步骤主要包括将质粒和化学试剂混合后滴加到细胞中，然后通过热激冲或冷冻复苏等方法促使质粒进入细胞。
电穿孔法是利用电场对细胞膜进行瞬间通透化，使得质粒能够进入细胞内。
操作步骤包括将质粒与细胞混合后置于电穿孔仪器中，通过设定合适的电场参数使质粒进入细胞。
这种方法操作简单，转化效率较高，常用于真核细胞的转化。
热激冲法是将质粒与细胞混合后，通过热激冲使细胞膜发生短暂的通透性改变，促使质粒进入细胞内。
这种方法操作简便，适用于多种细胞类型，但转化效率较低。
凝胶法是将质粒与细胞混合后，利用聚丙烯酰胺凝胶的孔隙结构，通过电泳或离心等方法将质粒转化到细胞内。
这种方法操作简单，适用于大规模的转化实验。
除了上述方法外，还有一些新兴的质粒转化技术，如纳米颗粒介导的转化、超声波介导的转化等，这些方法在特定情况下能够提高转化效率，但操作复杂度较高。
在进行质粒转化实验时，需要根据实验的具体要求选择合适的转化方法。
在操作过程中，需要注意消毒、无菌操作，以及对细胞的处理和培养条件等因素的控制，以确保实验的准确性和可重复性。
总之，质粒转化是基因工程领域中不可或缺的技术手段，掌握不同的转化方法并根据实验要求进行选择，能够更好地进行基因克隆、表达调控等研究工作。
希望本文所介绍的质粒转化方法能够对读者有所帮助，促进基因工程技术的发展与应用。
质粒转化步骤
质粒转化步骤质粒转化是分子生物学中常用的实验技术，它可以将外源DNA导入到细胞内，使得细胞表现出新的性状或功能。
本文将详细介绍质粒转化的步骤。
一、准备工作1.选择质粒：根据实验需要选择合适的质粒，例如pUC19、pBR322等。
2.选择菌种：一般常用大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主菌，也可根据需要选择其他菌种。
3.培养基：选择适当的培养基，如Luria-Bertani（LB）培养基。
4.抗生素：添加适当浓度的抗生素以筛选含有目标质粒的菌落。
5.电击仪：用于电击转化法。
二、制备化学试剂和培养基1.制备CaCl2（50 mM）溶液：称取1.47 g CaCl2·2H2O加入100 ml去离子水中，并在室温下搅拌至完全溶解。
2.制备冷冻保护剂：称取20%（w/v）蔗糖溶液和10%（w/v）DMSO溶液各10 ml混合均匀即可。
3.制备SOC培养基：称取2%（w/v）蔗糖、0.5%（w/v）酵母提取物、0.5%（w/v）NaCl、0.2%（w/v）MgSO4·7H2O和10 mM Tris-HCl调pH至7.0，加入适量的去离子水至100 ml。
三、质粒转化步骤1.制备化学竞争剂：将目标质粒溶解在去离子水中，浓度一般为1-10 ng/μl。
将DNA溶液加入CaCl2溶液中，混合均匀后在冰上静置30分钟。
2.处理细胞：将菌种预培养至指定的生长期，一般为对数生长期。
用LB培养基洗涤细胞3次，使得细胞表面的抗原物质减少。
3.转化操作：（1）热激法：将含有目标质粒的CaCl2/DNA溶液滴加到处理后的细胞上，在42℃恒温水浴中短暂热激15-60秒，然后立即放到冰上静置5分钟左右。
（2）电击法：将处理后的菌落均匀铺在富含营养的琼脂平板上，用LB培养基预培养。
将细胞转移到电击仪的电极板上，加入含有目标质粒的CaCl2/DNA溶液，设置适当的电压和时间进行电击。
4.恢复细胞：将转化后的菌落挑选到含有抗生素的LB平板上进行筛选。
质粒转化方法
质粒转化方法质粒转化是分子生物学中常用的实验技术，它是将外源DNA导入宿主细胞内，使其表达特定的基因或蛋白。
在研究领域中，质粒转化技术被广泛应用于基因工程、蛋白表达、基因敲除等方面。
本文将介绍几种常见的质粒转化方法及其特点。
1. 热激转化法。
热激转化法是一种简单而有效的质粒转化方法。
首先，将宿主细胞与质粒DNA混合，然后在42℃的热激条件下进行短暂的热激转化。
热激能够增加宿主细胞膜的通透性，有利于外源DNA的导入。
此外，热激还能够促进DNA的重组和修复，提高转化效率。
热激转化法操作简便，适用于大多数细菌和酵母等微生物。
2. 电穿孔法。
电穿孔法是利用高压脉冲电场使宿主细胞产生短暂的孔道，从而实现外源DNA的导入。
这种方法转化效率高，适用于多种细胞类型。
在实验操作中，首先将宿主细胞与质粒DNA混合，然后将混合物置于电穿孔仪中进行电穿孔处理。
电场的作用使细胞膜发生短暂的通透性改变，外源DNA得以进入细胞内。
电穿孔法不仅适用于细菌和酵母，还可用于哺乳动物细胞的转化。
3. 化学法转化。
化学法转化是利用化学方法改变细胞膜的性质，使其对外源DNA具有较强的吸附和摄取能力。
在实验中，通常使用钙离子或聚乙烯醇等化合物与细胞混合，形成质粒DNA-细胞膜复合物，然后通过热激或电穿孔等方法促使外源DNA进入细胞内。
化学法转化操作简单，适用于多种细胞类型，转化效率较高。
4. 瞬时转染法。
瞬时转染法是一种将外源DNA导入细胞内，但不稳定地保留在细胞内的转化方法。
通过瞬时转染，外源DNA可在短时间内表达目的基因或蛋白，然后很快被降解或排出细胞外。
这种方法适用于临时性的基因表达实验，如药物筛选、蛋白功能研究等。
总结。
质粒转化方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
研究人员在选择转化方法时，应根据实验需要和细胞特性综合考虑，选择最适合的转化方法。
同时，在实验操作中，应严格控制转化条件，提高转化效率和稳定性，确保实验的顺利进行。
分子生物学实验技术_DNA转化
转化：将质粒导入大肠杆菌或其他细胞内 的过程叫转化。 与噬菌体不同，质粒本身不具备感染细 胞的能力，这种具有接受外源DNA能 力的细胞叫感受态细胞
制备感受态细胞
CaCl2 法
原理：细菌处于0oC,CaCl2的低渗溶液中，菌细 胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNAase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面， 经42oC短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合 物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复 原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因 得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需 的转化子。
电转化法 1.取1ml 37oC 150rpm过夜培养的菌液加入含有 100ml LB液体培养基的三角烧瓶中37oC，培养 2~3h（OD=0.5~0.8） 2.将菌液分装至2个50ml离心管中，冰浴30min 3.4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加入 50ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀（清洗的目 的是去掉细胞溶液里的各种杂质。在高压电的情 况下， 多余的离子将破坏细胞结构 ）
4. 4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别 加入25ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 5. 4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别 加入10ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 10ml 10% 6.4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加 入400ul预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 7.40ul每管分装，4oC保存
电转化
原理：利用瞬间高压使细胞壁产生小孔而接受外 源DNA。操作中需要将DNA溶液中的盐分全部去 掉，否则因盐分而产生高电流，高电流产生火花 而杀死大肠杆菌
实验步骤
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 试剂
需要量／L
终浓度
• 2.4H2O
10.88g
55
• 2.2H2O
2.20g
15
•
18.65g
250
• (0.5M, 6.7)
20
10
• H2O
补至1L
• C. 用预先处理的滤膜（ 0.45 m孔径）过滤除菌，分成小份于－20 C 保存。
操作步骤（续）
• 2. 挑取一个经37 C 培养16－20h平面上的单菌落（2－3直径），接种至250 锥形瓶中的25 培养液或 培养液中，37 C 摇床（250－300）培养6－8h。
• 2 200 （ 1%, 0.5%, 1%, 7.0）
• 370C 550=0.5
•,
• 5,000 10
• 100 (100 2/10 , 7.5)
•
5
• 4,000 10
• 100 (100 2/10 , 7.5)
• 20
• 4000 10
• 10 (8.5 1.5 )
• 200 , -700C
中快速冷冻感受态细胞。贮存于－70 C 备用。 • 用液氮冷冻可提高转化效率约5倍。一般分装成每份50 l感受态细胞足
够些，如100－200 l 。 • 4、需要时，从－70 C冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心， 融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10 。 • 5、用一冷的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管中，放 置在冰浴上。（不用玻璃管是因为它们会降低转化效率约10倍。）
• A. 0.5M (6.7)[哌嗪’-双(2-乙磺酸)]溶液的配制:将15.1g 溶于80超纯水中,用5 M 调值至 6.7，最后加纯水，定容至100。用预先处理的滤膜(0.45 m孔径)过滤除菌。分成小份于 －20 0C保存。
• B. 转化缓冲液的配制:将下列组分溶于800纯水中，然后加20 0.5 M 的 （6.7），加纯水定 容至1L。
2转化法获得高转化效率的关键
• 1、制备感受态所用的水最好用超纯水，尽可能使用新买的生化试剂配 制培养基、化学溶液和制备感受态。如果可能，最好用国外的原装试剂 来配制培养基和化学溶液。
• 2、本方法中的2应该用2·2H202应该用2·6H2O,这样可获得最佳的转化 结果。另外2和2最好都用国外产的试剂，以保证最佳转化效率。
20 200 ( ) , 370C, .
培养基的配制
• 培养基的配制:
• 配制每升培养基,在950 去离子水中加入：
• 胰化蛋白胨（）20 g
• 酵母提取物
5g
•
0.5g
• 摇动容器使溶质完全溶解。加10 250 溶液（将1.86g 用100 去离子水溶解即 配成250 溶液）。用5 M 调值至7.0。用去离子水定容至1L。在15 （1.052）高 压下蒸汽灭菌20 . 该溶液在使用前，加入 5 灭菌的2 M 2 [2 M 2 溶液的配制方 法如下：用90去离子水溶解19 g 2, 用去离子水调整体积为100 ,在15 (1.052)高 压下蒸汽灭菌20 ]。
物理转化法
• 当大肠杆菌暴露在电荷中时，其细胞膜会不稳定而诱导形成暂时孔洞， 于是分子可由该孔进入细胞。这种电击的方法最初是用来诱导进入真 核细胞的，随后又被用于质粒转化大肠杆菌和其他细菌。这是转化细 菌的最简单、最快捷、最有效和重复性最好的方法。
• 通过优化各种参数包括电场的强度、电脉冲长度，的浓度和电击缓冲 液的组成能够获得每微克超过1010个转化子的转化效率。对于2.6-85 的质粒，其转化效率可达到每微克质粒获得6×10101×107个转化子。 这比通过化学方法制备的感受态细胞的最高转化效率高10-20倍以上。用的大多数大肠杆菌菌株。
• 3、细菌的生长状态：由于未知的原因，最高的转化效率总是用直接取 自冻存于-70 C的储备液中直接培养获得的，因此，不应使用在实验 室中连续传代或存放于4 C或室温的培养物。
• 4、玻璃和塑料器皿的清洁。 微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅度地 降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于 其他目的的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（－Q 水或相当的水）充满，再经高温高压消毒。水在玻璃器皿使用前应倒掉。
• 转化效率介于107－108左右，比传统的氯化钙法高10－100倍。类似 于分子克隆第三版上的2转化法，但有些区别。
• 2转化法优点：
• 重复性好，对操作技术要求不高，对纯度、试剂质量要求不高（但是熟 练而细心的操作、纯的样品和高质量的试剂仍然能获得最好的结果）；
• 2转化法缺点：
• 转化效率不高，一般仅用于载体构建，不用于建库。
方法制备超级感受态方法
• 用化学方法制备超级感受态的方法主要有：的方法和的方法。 • 采用的方法一般可以达到5 108个转化克隆／ g超螺旋质粒，而采用
的方法一般可以达到1 108 -3 108个转化克隆／ g超螺旋质粒。 • 与上一种制备超级感受态的的方法相比，方法的优点在于并不过分地讲
究细节，但是重复性更好。这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18 0C进行培养而不是通常的37 0C。否则这个方法就没有什么特别之处。 没人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。也许是18 0C时合 成的菌膜成份和物理性状更有利于获取，也许是低温使有利于高效转化 的生长时相延长了。 • 在18 0C进行细菌培养并非易事，大多数实验室都没有这种摇床。将摇 床置于4 0C冷室，用温控器加温至18 0C是一个解决问题的方法。也可 使培养物的温度维持在20－23 0C，这样做并不会造成转化效率降低。 这一温度在很多实验室其实是室温。在这一温度范围，细菌生长得很慢， 倍增时间大约为2.5-4h。如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是 在晚间较迟的时侯，这时细菌的600 吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。 解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。
• 1. : • • 1M 2 12 • 1M , 7.5 1.2 • H2O 120 • • • 3. : • • 42.5 + 7.5
:
2. :
1M 2 15 1M , 7.5 1.5 H2O 150
50-100 1-5 , 30
420C 30 . 250 500 ( )
370C 45 1 225
最经典、最可靠的化学转化法：2 法
• 2转化法的效率：
• 5 106 -2 107个转化克隆／ g超螺旋质粒。(转化效率的计算： 0.1标准质粒如18转化感受态细胞后，通常得到1转化液。涂布100 l 长出100个菌落，则转化效率为：100X10X104=107转化克隆／ g超 螺旋质粒)
• 改良的2转化法（个人方法）：
将贴附在管壁上的培养基吸干。 • 8. 加 80 预冷的转化缓冲液重悬细菌沉淀。轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸。 • 9. 于4 C 2500g 离心10 收集菌体。 • 10. 倒去上层培养液， 将离心管倒扣在吸水纸上2 以吸干剩余液体，用一个真空
吸引器将附着在管壁上的培养基吸干。
冻存感受态细胞
• 1、用20 预冷的转化缓冲液轻轻重悬沉淀。 • 2、加1.5 。轻轻混匀细菌悬液，放置冰上10 。 • 3、迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮
本方法需要的缓冲液和溶液
• 二甲基亚砜（） • 二甲基亚砜的氧化产物是转化的抑制物，为避免上述问题，
应购买高质量的。 • 转化缓冲液（见后面） • 用前置于冰上预冷至0 C。 • 培养基：，，。 • 专用设备： • 液氮 • 18 C 摇床。 • 42 C恒温水浴。
操作步骤
• 1.制备转化缓冲液（用前冰上预冷。）用超纯水（－Q过滤水）配制。
转化法
• 20世纪70年代晚期和80年代早期， 在冷泉港实 验室和哈佛大学做研究生的时候，他做出了以前 从未听说过的转化效率，并且以后他的方法被标 准化了, 称为转化法。
• 如果足够细心，用的方法可获得高达5X108的转 化效率。可事实上只有少数人能够重复出本人的 高转化效率。
• 由于该方法对操起技巧和细心程度要求较高，重 复性低，这里不做介绍。有兴趣的同学可参考分 子克隆上的步骤进行尝试。
方法获得高转化效率的关键因素
• 1、使用高纯度的水和二甲基亚砜，实验过 程中尽可能使用新买的试剂和培养基。
• 2、细菌的生长状态。接种的细菌应用直接 取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得。 而不能使用在实验室中连续传代或存放于4 ℃或室温的培养物。
• 3、试验中所使用的玻璃和塑料器皿应清洗 干净，并用超纯水充满，再经高温高压消 毒。
• 培养基：
• 培养基除含有 20 葡萄糖外，其他成分与培养基相同。培养基经高压灭菌后冷至 60 C或60 C以下，加20除菌的1 M葡萄糖溶液（1M 葡萄糖溶液的配制 方法是： 用90 去离子水溶解18 g葡萄糖，完全溶解后， 用去离子水定容至 100 ，用0.22 m滤器过滤除菌）。
• 培养基极易染菌，所以配好后一定要分装成小份，每次取一份使用，其余放4°C 保存。
• 3. 晚上约6点，将上述初始培养物接种于三个盛有250 培养液的1L 锥形瓶中， 第一个加10,第二个加4,第三个加2,于18－22 C 中速摇床过夜。
• 4.次日早上,测量三瓶培养物的600值，每45测定一次。 • 5. 当有一瓶的培养物600＝0.55时，将培养瓶置于冰上10，弃去另两瓶培养物。 • 6. 于4 C 以 2500g(相当于 转头，3900)离心10 收集菌体。 • 7. 倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2 以吸干剩余液体，用一个真空吸引器
操作、设计与技能
转化技术(一)
1
细菌转化技术
2
酵母转化技术
细菌转化技术
• 一、化学转化法； • 2转化法、22转化法、方法、方法等；