TEM制样-磷钨酸负染
脂质体及其在化妆品体系中的表征
脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法
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41
包封率
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方法
原理
特点与适用范围
缺点
HPLC法
参照磷脂含量测定
适用范围广，
/
可同时用于磷脂含量和包封率测定
透析法
利用半透膜分子大小差别，通过及时更换 简单，稳定性好，可处理大量样品，
外相达到分离的目的
适合小粒径，稳定性好的脂质体
Eric Betzig
Stefan W. Hell 2014诺贝尔化学奖
W. E. Moerner
STORM 技术的开创者庄小威
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低分辨荧光显微镜和超高分辨荧光显微镜图片的对比
优点：突破光学极限的分辨率： 1nm 左右， 具有专属性，可作为通用的方法
局限性：外部资源少
北大工学院席鹏课题组 上海交大李小卫课题组
耗时较长，所耗介质较多
微柱离心法
凝胶柱层析 法
利用游离药物与含药脂质体的重力差异进 行分离，计算包封率
利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大 小的差异进行分离
常规SEM
1. 将含有脂质体的样品滴在干净的硅片上面 2. 晾干或者烘干 3. 对其进行喷金处理（增强样品的导电性）
缺点局限性 1.脂质体干燥过程中会发生结构变化。 2. 对小颗粒分辨率不高。100nm左右。
1.只能看表面结构，不能区分脂质体和其它纳米颗粒 2.脂质体不导电，需要喷金处理。
AFM
1.把样品稀释为浓度1Wt%左右 2. 样品滴在云母片上 3. 放置待溶剂挥发干后进行测试
二、对于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法观测不到脂质体,不确 定是否稳定存在于体系中，可以尝试使用荧光法。该方法对样品纯度没有 要求。如果在共聚焦显微镜不能看到完整的脂质体形状，说明脂质体极大 可能已经被破坏，那么这样的脂质体在体系中发挥不了增溶的作用，已经 没有太大的实用价值。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病ห้องสมุดไป่ตู้一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
exosome翻译
外泌体，一类小的细胞外囊泡，通过作为转运和递送细胞之间的膜和细胞质分子的载体起到在各种生理和病理过程中的重要作用。
由于外来体广泛存在于各种体液中，并且携带其来源细胞的分子信息，因此它们被认为是潜在的非侵入性生物标志物。
尽管如此，方便和定量的外泌体分析方法的发展在技术上仍然具有挑战性。
在这里，我们提出了一种基于铜介导的信号放大策略的直接捕获和外来体快速检测的低成本检测方法。
该分析涉及三个步骤。
首先，通过胆固醇部分和脂质膜之间的疏水相互作用，通过胆固醇修饰的磁珠（MB）磁性捕获大量纳米囊泡。
其次，用适体修饰的氧化铜纳米颗粒（CuO NP）锚定具有特异性膜蛋白的外泌体的珠粒结合纳米囊泡以形成夹心复合物（MB-exosome-CuO NP）。
第三，通过酸解将得到的夹心复合物溶解以使CuO NP变成铜（II）离子（Cu 2+），其可以在聚（胸腺嘧啶）（聚T）存在下通过抗坏血酸钠还原为荧光铜纳米颗粒（CuNP）。
CuNPs的荧光发射随着Cu2 +浓度的增加而增加，这与外泌体浓度成正比。
我们的方法可以定量分析7.5×104至1.5×107个颗粒/μL范围内的外来体，生物样品中检测限为4.8×104个/μL。
总工作时间约2小时。
该检测方法可能成为生物样本中常规外泌体分析的简单且经济有效的方法。
胞外囊泡（EV）是包含来自封闭在脂质双层中的分泌细胞的胞质溶胶的膜囊泡。
它们可以在各种体液中检测到，包括血液，尿液，唾液，母乳，羊水等。
在20世纪80年代，约翰斯通将内源性小EV（30-150 nm）定义为外来体，由于它们携带着丰富的分子信息，包括RNAs （信使RNAs和microRNAs），DNA片段，蛋白质等，因此外泌体吸引了人们的注意。
和他们的亲本细胞的脂质。
因此，外泌体提供了一种方便的方法来监测和分析亲代肿瘤细胞的状态而不需要活检。
此外，越来越多的证据表明外泌体的脱落与肿瘤抗原和抗肿瘤免疫反应相关，信号在免疫系统中，因此对于癌症诊断具有潜在的应用价值.6-8 Melo et al。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
水解法制备纳米二氧化硅和表征_庞久寅
一般来讲， 制备纳米二氧化硅主要有气相法 和水解法两种办法。气相法的主要特点是产品表 面整洁、纯度高、成本高， 而水解法无须特殊仪器 设备， 容易操作［１￣３］。
用氨作为原硅酸四乙酯（ ＴＥＯＳ） 的水解催化 剂可制备小粒径的 ＳｉＯ２ 粒子， 但反应条件较高、 难以控制， 有很大的局限性。我们在乙醇的氨水 溶液中 不 断 滴 加 ＴＥＯＳ， 通 过 调 整 介 质 ｐＨ、加 料 和搅拌速度等制备了不同粒径的二氧化硅。用 ＴＥＭ、动态光散射、红外和电子能谱分析， 对制得 的纳 米 二 氧 化 硅 颗 粒 组 成 、粒 径 大 小 、规 整 度 及 分布均匀性等进行表征 。 ［４￣６］
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＥＯＳ， ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏ－ｓｉｌｉｃａ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｐＨ、ｄｒｉｐｐｉｎｇ ｒａｔｅ、ａｇｉｔａｔｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＴＥＯＳ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ， ｗｅ ｃａｎ ａｃｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ｎａｎｏ－ｓｉｌｉｃａ ｗｈｏｓｅ ｓｉｚｅ ｉｓ ｂｅｌｏｗ １００ｎｍ． Ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｎａｎｏ－ｓｉｌｉｃａ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｃｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ４０ｎｍ ｎａｎｏ－ｍａｔｅｒｉａｌ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｗｅ ｃａｎ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ ｂｙ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｉｃ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ， ａｔ ｌａｓｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｐｐｏｓｉｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ． Ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ｉｓ １：２ ｂｙ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ ｍｅａ－ ｓｕｒｅｍｅｎｔ．
tem负染操作流程
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水解法制备纳米二氧化硅和表征_庞久寅
摘 要 通过 ＴＥＯＳ 在碱性条件下水解生成纳米二氧化硅。通过控制 ｐＨ、滴加速度、搅拌速度以及 ＴＥＯＳ 与乙 醇的配比， 得到小于 １００ｎｍ 的二氧化硅， 通过控制以上条件得到了粒径 ４０ｎｍ 的纳米材料。用红外光谱分析所 得二氧化硅的官能团结构、ＴＥＭ 观察到二氧化硅的微观形态， 通过电子能谱测定了硅和氧的比例为 １∶２。 关键词 纳米二氧化硅； 制备； 表征； ＴＥＭ； 水解
在 带 电 磁 搅 拌 的 锥 型 瓶 中 加 入 ５０ｇ 无 水 乙 醇、１～５ｇ 氨水， 然后用不同配比的乙醇 ＴＥＯＳ 溶 液从恒流泵中滴加到锥型瓶中， 控制滴加速度 ０．０２５～０．１５ｍｌ／ｍｉｎ 和搅拌转速 ５０～４００ｒ／ｍｉｎ， 使 ＴＥＯＳ 水解生成纳米二氧化硅。用动态光散射法、 ＴＥＭ 测定其粒径大小。然后将含有纳米二氧化硅 的醇溶液在真空烘箱内干燥， 分离最后得到固态 纳米二氧化硅。实验的基本条件为 ｐＨ 值 ８．２、搅 拌速度为 ５０ｒ／ｍｉｎ、滴加速度为 ０．０２５ｍｌ／ｍｉｎ、滴加 时间为 ４００ｍｉｎ。 １．３ 纳米二氧化硅的表征
２ 结果与讨论
２．１ 反应条件对纳米二氧化硅制备的影响
ｐＨ 值
图 １ ｐＨ 值对粒子大小的影响 对纳米粒子大小生成具有决定性作用的是
ｐＨ 值、搅拌速度和滴加速率等因素， 实验结果如 图 １、图 ２、图 ３ 所示。图 １ 为 ｐＨ 值对粒径变化的 影响， 实验结果表明， 随着 ｐＨ 值的持续升高， 粒 径呈现单调增长的趋势。
图 ６ｂ。 ２．４ 元素分析
通过图 ７ 可以看出， 通过对二氧化硅粉末的 ＸＰＳ 测定可以看出图中只有硅和氧的吸收峰， 且 两 者 的 面 积 比 为 １ ∶２， 因 而 断 定 其 分 子 式 为 ＳｉＯ２。
负染色技术
负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。
此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。
醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
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磷钨酸用水或磷酸缓冲液配制成1％左右的溶液，用滴管一滴染色液在制好样品的铜网上，1～2分钟后，用剪成尖角的滤纸吸去染色液。
再滴一滴纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两三次，这样是为了洗去多余的磷钨酸，然后静置干燥。
然后就可以用电镜观察了。
磷钨酸中的重原子相对于有机分子中的碳氢氧氮等轻原子来说，更能阻挡（散射）电子。
所以，有磷钨酸吸附（或沉积）的地方在TEM 照片中看起来更黑，而有机物占据的地方看起来更亮。
之所以叫“负染色”，就是因为被染“黑”的是背景和外轮廓，真正感兴趣的样品部分是“白”的。
也就是说，典型的经过负染色的样品是表现为黑背景中的白区。
一般有机物并不与磷钨酸发生反应，磷钨酸只是沉积在有机物周围形成“背景”或“轮廓”。
但是不是所有的磷钨酸染色都是负染色。
有一些羟基和酰胺类会与磷钨酸作用，出现正染色的效果，即有些含有这些基团的有机物在TEM下看起来被染“黑”，最典型的是尼龙。
另外，有时候不成功的负染色，看到的结果也是“白底黑点”，其实虽然是做了染色的操作，但可能由于方法不对，或者样品本身的性质不适用负染色，结果跟没染是一样的。
如果有机颗粒足够大，不染色时就能看到“白底黑点”。
另一方面，如果染色很弱，一般只是给有机颗粒镶上一个轮廓，如果染色剂量很大，则会出现很黑的“背景”。
因此，对于很小的有机颗粒，如果染色很弱，只是一个轮廓圈，电镜放大倍数不够的时候，看起来就是一个小黑点了。
就好像一个纸上画一个空心圈，站远了看也可能
成一个小黑点。