病毒纯化浓缩方法
病毒纯化
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。
在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。
它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。
在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。
脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。
病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
现在我们讲解每个步骤的一些细节。
1.在大型装置中培养细菌。
为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。
每种病毒的培养都有不同的步骤。
脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。
在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。
2.富含病毒培养液的去除。
病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。
在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。
为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。
然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。
低速离心除去大分子的细胞残骸。
3.通过沉淀将病毒物质浓缩。
由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。
脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。
这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。
由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。
将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。
然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。
这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。
4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。
病毒的超速离心纯化
病毒的超速离心纯化实验目的超速离心法纯化A型禽流感病毒。
实验原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
此法的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
实验设备和材料专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）操作步骤蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。
蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。
30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。
1. 病毒的增殖使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。
具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。
向各尿囊腔中接种0.2mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。
此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。
24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。
2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。
3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。
离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
病毒的浓缩和纯化
病毒的浓缩和纯化
收集发病鹅的脾脏、肝脏和肾脏，均浆用1:5稀释(Wt/vol)buffer A (10 Mm Tris-HCl ,100mM EDTA PH=7.2)离心10000 转，30分钟。
再加上双抗（10000LU/ML）青霉素和链霉素(1mg/ml)。
病毒浓缩的方法用的是蔗糖梯度离心方法。
首先，10000转离心30分钟，收集上清液，用三氯三氟代乙烷纯化两次为了除去脂层。
蔗糖溶液用在下一步的操作中，提前准备buffer A。
上清放于30％的蔗糖的溶液中超速离心。
上清重新用buffer A悬浮，放于25％－60％的不间断的蔗糖溶液中，超速离心120000转，16小时。
离心完后，收集密度差别的液体。
测定病毒的浮力的密度。
最后，分离的液体带再用1：3 buffer A稀释，离心2小时，120000转。
病毒小颗粒用悬200微升水。
病毒纯化密度梯度离心法
病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。
病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。
物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。
病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。
免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。
结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。
病毒纯化方法:1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。
但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。
2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。
Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。
密度梯度离心法英文名称： density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
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本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==peg8000浓缩病毒原理篇一：慢病毒浓缩方法一超速离心沉淀法1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二 PEG-8000浓缩法1. 5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。
(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。
(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。
(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。
(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。
(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
一种流感病毒的浓缩、纯化方法[发明专利]
![一种流感病毒的浓缩、纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/909012f409a1284ac850ad02de80d4d8d15a012a.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.16C N 103923883A (21)申请号 201310015169.X(22)申请日 2013.01.16C12N 7/00(2006.01)C12N 7/02(2006.01)(71)申请人辽宁成大生物股份有限公司地址110179 辽宁省沈阳市浑南新区新放街1号(72)发明人周荔葆 殷建文 焦龙 吴栩涛甄祖刚 赵新(74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司 21107代理人韩辉(54)发明名称一种流感病毒的浓缩、纯化方法(57)摘要本发明涉及一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose4FF 层析纯化技术进行纯化。
本发明采用0.65um 的膜对流感病毒液进行澄清，采用中空纤维750k 超滤膜进行浓缩，分子筛层析技术进行纯化彻底解决了目标蛋白纯度低，杂蛋白高、DNA残留量高、抗原回收率低的问题。
对于提供疫苗质量，降低副反应提供了很好的技术手段，有利于生产出高品质、安全性好的高质量疫苗。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页(10)申请公布号CN 103923883 A1/1页1.一种流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于有以下步骤：（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清；（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩；（3）Sepharose 4FF 层析纯化技术进行纯化。
2.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（1）应用0.8～0.65um 的滤芯进行澄清是指：首先用L-15液体平衡滤芯，之后对病毒液进行澄清。
3.根据权利要求1所述的流感病毒的浓缩、纯化方法，其特征在于：步骤（2）750KD 的中空纤维超滤浓缩是指：应用0.5N NaOH 对750KD 的中空纤维超滤浓缩设备进行在线消毒清洗，用L-15液体平衡设备，浓缩20～30倍数，之后用L －15冲洗设备,定容到预订体积，超滤浓缩结束后，应用0.5N NaOH 对超滤设备进行在线清洗，清洗后应用0.1N NaOH 保存。
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病毒纯化浓缩方法
方法一超速离心沉淀法
1 仪器
超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管(Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管
2 方法步骤
（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同
样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。
方法二PEG-8000浓缩法
(1) 5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃。
(2)使用μm滤头过滤慢病毒上清液；
(3)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaCl母液ml；
(4)每20～30min混合一次，共进行3-5次；
(5) 4度放置过夜；
(6) 4度，4000 g，离心20min；
(7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
(8)加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
(9)集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃
方法三慢病毒纯化浓缩试剂盒
1. 每10ml过滤后的病毒初始液，加入Concen Solution 3ml，每20-30min 混合一次，共进行3-5次。
2.2. 4℃放置过夜。
3. 4℃，3000 g，离心45min。
4. 去掉上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。
5. 加入无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。
6. 病毒悬液分装成200μl每份,保存在离心管中，速冻后储存在-80 ℃。