菌落总数与大肠菌群数测定
菌落总数及大肠菌群
菌落总数及大肠菌群的测定一、菌落总数的测定1.准备工作：1.1先将所有仪器用报纸包好，所需药品配置好，放入121℃灭菌锅灭菌15min分钟1.1微检室提前开好紫外线灯杀菌30分钟以上。
1.2把灭好菌的培养基加热溶解，放置50℃的水浴锅恒温备用2.样品处理：先用酒精对产品外袋消毒，然后打开放入放入研钵中压碎或用剪刀剪碎（注：手部接触的部分要丢弃）3.称取25ɡ样品于225ml生理盐水中，摇匀生理盐水中，摇匀。
各吸1ml至两个培养皿中，倒入培养琼脂，转动平板混匀。
4.待琼脂凝固后放翻转平皿，放入36±1℃无菌培养箱培养48小时。
二、大肠菌群的测定：1.称取25ɡ处理好的样品于225ml生理盐水中，摇匀。
各吸取10ml至3根月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤双料管中，再各吸取1ml至3根月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤单料管和9ml生理盐水中，把试管中样液和生理盐水摇匀，用另一支移液管分别吸取1ml至另外3根单料管中。
2.把试管塞好放入36±1℃无菌培养箱培养24小时，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48小时，不产气者为阴性，产气者进行复发酵实验。
3.复发酵实验：用接种环从所有48小时内发酵产气的LST肉汤管中分别取1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48小时，观察是否产气，产气者为大肠菌群阳性。
4.大肠菌群最可能（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌的MPN 值。
（1）营养琼脂的配置：称取23.5g于1L蒸馏水中，加热沸腾至完全溶解，分装于500ml锥形瓶中，1瓶大约装350ml，121℃高压灭菌15分钟。
（2）月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤双料管配置：称取17.8g于300ml蒸馏水中，加热沸腾至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15分钟。
（注：单料其他成分不变，水分加倍）（3）煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤配置：称取40g于1L蒸馏水中，热沸腾至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15分钟。
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品）药品：1、平板计数琼脂2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）4、氯化钠设备材料：烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。
一、准备工作（指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加）1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定（a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。
（b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。
（c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。
4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。
5、准备8个培养皿，用布包扎好。
6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。
7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。
二、使用灭菌锅灭菌1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。
2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。
3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。
4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。
中国药典中对微生物的测定
中国药典中对微生物的测定
中国药典对微生物的测定包括以下方面：
1. 菌落总数测定：该方法用于测定制剂和原料药中的菌落总数。
通过将样品接种在特定的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的菌落总数。
2. 大肠菌群测定：该方法用于测定制剂和原料药中的大肠菌群的数量。
通过将样品接种在含有特定抑制剂的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的大肠菌群数量。
3. 霉菌测定：该方法用于测定制剂和原料药中的霉菌的数量。
通过将样品接种在含有特定抑制剂的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的霉菌数量。
4. 周赤霉糖的测定：该方法用于测定制剂和原料药中的周赤霉糖的含量。
通过将样品提取，使用特定试剂反应后，测定反应产物的吸光度，通过比对标准曲线计算出样品中的周赤霉糖含量。
5. 大肠杆菌测定：该方法用于测定制剂和原料药中的大肠杆菌的数量。
通过将样品的提取液接种在含有特定抑制剂的培养基上，培养一定时间后，进行菌落计数，计算出单位重量或单位体积中的大肠杆菌数量。
以上是中国药典对微生物测定的一些常见方法，用于评估药品和药物原料的微生物质量。
菌落总数测定与大肠菌群计数准备工作
菌落总数测定与大肠菌群计数准备工作1、5个平板培养明（用报纸包封好）一个空白，其他4个就两个稀释度分别做两个平板2、6条1ml吸管（用报纸包封好）吸管多包几条都没问题3、称取3.3g营养琼脂加100ml蒸馏水(加热煮沸制成液)《用500ml凸瓶装，用棉花蜜封瓶口，加报纸包蜜》以上三步就是菌落总数测定的准备工作4、称取0.85g氯化钠加100ml蒸馏水（摇匀制成生理盐水）《用500ml凸瓶装，用棉花蜜封瓶口，加报纸包蜜》5、（装有9ml盐水2支小试管，多放一支预做空白）做样品稀释（装有9ml肉汤9支小试管，多放一支预做空白）做三个稀释度，每个稀释度做三支小试管6、称取?克LST肉汤100ml蒸馏水（摇匀分装下以下9支小试管，每个9ml）9支小试管要倒放小试管（装有9ml LST肉汤1：10 / 1：100 / 1：1000）每个稀释度做三支小试管7、量斗、量杯(以上全部放入高压锅消毒121~126℃约15~30分)8、5g样品菌落总数（以下步骤为已消毒好，要进入已消毒的室内及消毒台操作）5g样品加入45ml 生理盐水配成1：10的样品A试剂↓在其中一支装有9ml生理的小试管中加入1ml A试剂配成1：100的样品B试剂↓↓在其中一支装有9ml生理的小试管中加入1ml B试剂配成1：1000的样品C试剂↓（以下要在洒精灯下操作要在消毒台操作菌落总数我们一般做两个稀释度在A管中抽取2次，每次1ml，分别至于两个已经倒好营养琼脂的培养基中在B管中抽取2次，每次1ml，分别至于两个已经倒好营养琼脂的培养基中倒一个空白营养培养基，做空白对照大肠菌群我们做三个稀释度在A管中抽取三次，每次1ml，分别至于3支已经消毒好的9mlLST肉汤小试管中在B管中抽取三次，每次1ml，分别至于3支已经消毒好的9mlLST肉汤小试管在C管中抽取三次，每次1ml，分别至于3支已经消毒好的9mlLST肉汤小试管中放入培养箱中36℃48小时培养睇结果。
食品中细菌菌落总数和大肠菌群的检测
二0一三年一月
概念认识——菌落总数ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱerobic plate count
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、 培养温度和培养时间等）培养后，所得每 g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
概念认识——大肠菌群coliforms
在一定培养条件下 能发酵乳糖、产酸 产气的需氧和兼性 厌氧革兰氏阴性 无芽孢杆菌
食品微生物学检验 菌落总数测定
解读标准——GB/T 4789.3-2003
食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
为规范食品中大肠菌群指标的检测工作，现公告如下： 现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或 MPN/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大 肠菌群测定》（GB/T4789.3-2003）进行检测；以“MPN/克或 MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用《食品 卫生微生物学检验大肠菌群计数》（GB/T4789.3-2008）进行 检测。 特此公告。
二○○九年十月二十六日
解读标准
GB 7099-2003 糕点、面包卫生标准
GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验 糖果、糕点、蜜饯检验 GB 4789.1-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则
GB 4789.2-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
解读标准——GB 7099-2003 糕点、面包卫生标准
解读标准——GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验
糖果、糕点、蜜饯检验
解读标准——GB 4789.1-2010 食品安全国家标准
食品中菌落总数大肠菌群数测定
国际上常见的取样方案
一、国际食品微生物规范委员会取样方案 1、采样原则 - 各类微生物对人的危害程度不同 - 食品经不同条件处理后，危害度变化情况：降 低、未变、增加 2、采样方法 - 三种危害度： 1）老人和婴幼儿 2）可立即食用的食品，在食用前危害基本不变 3）食用前经过加热处理
ICMSF取样方案：分为二级法和三级法 解释四个代号： n：系指一批产品采样个数。 c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的 检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。 m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接 受的数量区别开。 M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量， 表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的 界限。 它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多 少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该 产品的质量而设定的
12.3 大肠菌群测定操作流程 （任务一）
梯度稀释样品
大肠菌群测定操作注意事项
1、检验步序：三步法（乳糖发酵、分离培养、证 实实验），也可称（初发酵、平板分离、复发酵） 2、抑菌剂 3、挑选菌落 4、产气量
大肠菌群测定操作注意事项
5、接种量是指实际接入试管中的、相当于原样品 的量 例如： 稀释度1：10 接种10ml，取液量是10ml，但接 种量就是1ml(g)，即相当于原样品的1ml(g) 6、接种量若是大于１ml的话全部用双料管，等于 或小于１ml用单料管
乳糖胆盐发酵管
配方： 蛋白胨 2 % 猪胆盐（或牛胆盐）0. 5 % 乳糖 1 % 溴甲酚紫酒精液 0 . 06ml pH 7.4
• 双料乳糖胆盐发酵管：除蒸馏水外其他成分加倍
原理 •溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸 性时呈黄色 •如果颜色不变（呈蓝紫色），说 明无产酸的大肠菌群 •如果颜色变黄色，说明可能出现 能分解乳糖产酸的大肠菌群 •胆盐可以抑制G+细菌生长繁殖 分解乳糖产酸产气的大肠菌群， 看杜氏管中的气体
食品微生物学检测中菌落总数和大肠菌群检验的质量控制
食品微生物学检测中菌落总数和大肠菌群检验的质量控制摘要：目的在对食品进行微生物学检测的时候菌落总数以及大肠菌群两项指标容易出现相应的检测问题，为了能够保证检测结果的科学性和正确性，就需要制定相关的质量控制措施，这样才能保证食品的安全。
本文阐述了两项指标检测的基本要求，并在此基础上对两个指标的控制分别进行了论述，以期能够加深人们对这两个指标质量控制的了解。
关键词：食品；菌落总数；大肠菌群；基本要求食品从生产到销售需要经过各个环节，在这些环节中很可能受到微生物的污染，从而造成腐败、产生毒性，为了能够保证人们能够吃到健康的食品，就需要对食品中菌落总数以及大肠菌群作为其主要的检测项目。
只有对其检测进行严格的把控，才能保证食品的安全，才能确保消费者的健康，才能更好地促进经济的发展。
1 质量控制的基本要求要确保对菌落总数和大肠菌群的检验能够更加准确，就需要对一些基本要求进行确保。
1.1 检验人员为了能够对食品的菌落总数和大肠菌群进行有效的检验，就需要检验人员具备相关的技术知识，这样才能确保检测结构更加准确。
作为食品的检验，首先就要求检验人员能够对食品微生物学理念以及相关的检验技术能够有比较深入的了解，并且在其参加工作之前需要对其进行必要的考核。
其次就是要了解相关的法律法规，我国的食品法对相关的标准有明确的规定，只有了解这些才能有更好地执行检验。
最后就是要了解计量学的内容，因为检验工作十分精细，只有了解计量学的基本知识才能更好地进行实验。
1.2 仪器设备为了能够保证检验能够正常的进行，需要准备好必要的仪器和设备，这样才能为检验的进行提供必要的基础。
1.3 试剂与培养基对菌落总数和大肠菌群的检验需要利用必要的培养基、染色剂以及一些必备的试剂，并严格按照相关的标准进行相关的操作。
1.4 检验环境由于空气中本身就存在着细菌和微生物，为了能够对菌落总数和大肠菌群进行有效的检测，需要在无菌室进行检验。
为了达到理想的检测效果，工作人员应该进行良好的卫生处理，这样才能达到很好的效果。
微生物学检验：菌落总数、大肠菌群检测实验及思考
用 ｌ ｍＬ灭菌吸管吸取 １ ｍＬ样 品均液接 种 于 １ 盛有 １ｍＬ月 桂 基 硫 酸 盐 胰 蛋 白胨 支 ０
大肠 菌群检测 实验及思考
刘逸泠 曲阜 师范大学生命科学 学院 ２ ５ ６ ７ １５
ｆ污染 有关 的细 菌污 染的程 度 。如 果某 食
微 生物 对 食 品 的 污 染 问题 是 全世 界 食 品安
业 实验 室的 支持下 进行 的 ，实验 室 条件 较 好 ， 实验 设 备 、材 料 等均 已准 备妥 当 ，而且 实验 室也 已帮 助准 备 了检 测所 需 的培养 基和 试 剂 ，可以直 接进 行项 目
基于检测实验是在福州某高校学科专
—
—
１０ ９
均 液 用 ｌ ｌＬ Ｎａ ｍｏ／ ＯＨ调 节 为 ７ ０ 随 后 ， ．。
面 、详细 ，从中获得的信息更 为丰 富。世
界各先进国家都在致力于发展现代的微生
黄色葡萄球 菌 ）等 多项 ，本文仅检测其 中 两个项 目，而且检测的样 品数 有限 ，因此 实验结果并不构成本地区 自动售水机纯净
一
两 个平 皿 ，之后 即刻 从恒 温箱 中取 出 已
群进行检测 实验 。对检测实验 结果 ，对 照 Ｇ ７２— ０３ （ ） Ｂ１３ ４ ２ ０ 瓶 桶 装饮用纯净水卫
凉至４ ６±ｌ ℃的平板计数琼脂培养基倾注
此数次颁布食品微生物检验标准 。按照食 品安全国家标准要求 ，菌落总数和大肠菌 群是食品企业 出厂时必检 的微生物指标 。
生 物 学检 验 标 准 ， 自动 售 水 机 纯 净 水 的 对
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菌落总数测定
2020/8/9
倾注培养
2020/8/9
培养结果
2020/8/9
菌落总数测定
• 实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废
• 计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数×稀释倍数
5.解此方程，得x=MPN 6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解 7.日常实验时采用查表法推算MPN值。 8.表格在教材第260-261页。
2020/8/9
2020/8/9
x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数
2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管 数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生 的概率为：
n
其中C为常系数i1
Vi(
Pi eVix /V
1
Qi)
0
2020/8/9
MPN法原理
3.当y(x)max，XMPN 4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即
• 目的：对某种细菌进行选择性计数 • 核心思想：泊松分布 • 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释
度分别接种若干培养管，根据阳性管数估 算MPN值
2020/8/9
MPN法原理
MPN法（Most Probable Number Method）
1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=e-x ×xk/k!
2020/8/9
液体接种
2020/8/9
复发酵
• 复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管 内有气体产生
2020/8/9
大肠菌群数测定
• 注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种
2020/8/9
MPN法原理
• MPN法（Most Probable Number Method ）
2020/8/9
媒染
2020/8/9
脱色
2020/8/9
复染
2020/8/9
革兰染色法
革兰氏染色阴性
2020/8/9
n
C(PiQi)!/(Pi!Qi!) i1
革兰氏染色阳性
复发酵
• 器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接
2020/8/9 种环、复发酵管
大肠菌群数测定
• 实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌 落1-3个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养：37℃，24h （4）观察指标：产酸，产气
革兰染色法
• 涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀
• 热固定：通过火焰若干次 • 初染：结晶紫一滴，1min，水洗 • 媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗 • 脱色：95%乙醇，30s或至无色为止 • 复染：复红一滴，30s
2020/8/9
涂片
2020/8/9
热固定
2020/8/9
初染
2020/8/9
分离培养
• 器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平
2020/8/9 板培养基
分区划线法
2020/8/9
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
分区划线法
• 操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条 线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平 板上滑动
2020/8/9
菌落总数测定
• 计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比>2，选较小值 菌落数之比<2，取平均值 （3）所有稀释度均>300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均<30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者
• 结果单位：CFU/ml（g）
2020/8/9
初发酵结果
• 右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。
2020/8/9
• 实验步骤 3.复发酵 （1）选取产气试管 （2）接种至10mlBGLB肉汤中 （3）培养：36℃，48h （4）观察指标：若产气则报告大肠 菌群阳性。
2020/8/9
大肠菌群数测定
• 实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 36℃，48h
2020/8/9
大肠菌群数测定
• 实验步骤 2.分离培养：
（5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深
（6）革兰染色、镜检：选特征菌落
2020/8/9
革兰染色法
• 器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、
2020/8/9 生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸
2020/8/9
菌落总数测定
• 注意事项：
2020/8/9
1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识
大肠菌群数测定
• 实验目的 • 实验原理
36 ℃，48h，产气（小倒管） 三步法：初发酵、复发酵 • 器材与试剂 样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤 1ml吸管、10ml吸管、试管测定 • 大肠菌群测定 • MPN法原理（拓展内容）
2020/8/9
菌落总数测定
• 掌握菌落总数测定方法 • 实验原理
不同稀释度的样品，营养琼脂培养 基，36 ℃，48h（水产品30 ℃，72h ），菌落数
2020/8/9
菌落总数测定
• 器材与试剂： 样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培
2020/8/9
初发酵
• 器材与试剂 样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉
汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球
2020/8/9
大肠菌群数测定
• 实验步骤： 1.初发酵
2020/8/9
2020/8/9
2020/8/9
吸取样品方法
2020/8/9
加注样品