最新转录组分析(RNA-Seq)
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。
2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。
深度为10-30 Million reads。
）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。
大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。
我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。
这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。
首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。
接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。
然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。
再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。
对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。
这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。
也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。
因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。
转录组数据分析
转录组数据分析引言：转录组数据分析是研究生物体在特定条件下细胞内mRNA的表达情况的一种方法。
转录组数据分析的目的是识别差异表达的基因，揭示其在生物学过程中的功能和调控机制。
随着高通量测序技术的发展，转录组数据的获取变得更加容易和可行，因此转录组数据分析也成为生命科学研究中的重要工具之一。
本文将介绍转录组数据分析的基本流程和常用的分析方法。
一、转录组数据的获取转录组数据的获取通常使用高通量测序技术，例如RNA-Seq和microarray。
RNA-Seq是一种基于测序的转录组分析技术，可以直接测定细胞或组织中的mRNA的序列，无需参考基因组序列，因此能够检测到新的转录本和未注释的基因。
Microarray是一种基于杂交的转录组分析技术，通过固定的探针阵列检测RNA样本中的mRNA的水平。
两种技术各有优劣，研究人员可以根据自己的研究目的选择适合的方法。
二、转录组数据分析的基本流程转录组数据分析的基本流程包括数据预处理、差异表达分析和功能注释。
数据预处理是对原始转录组数据进行筛选、过滤和归一化处理，以得到可靠的表达量信息。
差异表达分析通过统计学方法找出在不同条件下差异表达的基因。
功能注释则针对差异表达基因进行功能分析，识别其参与的生物学过程和通路。
三、数据预处理数据预处理是转录组数据分析的第一步，其目的是筛选和过滤掉噪声数据，并对数据进行归一化处理。
常见的数据预处理步骤包括：读取原始数据、去除低质量读段、去除接头序列和低质量碱基、去除rRNA序列、对碱基进行质量修剪、进行序列比对和表达量计算、基因表达量归一化等。
数据预处理的目的是为后续的差异表达分析做好准备。
四、差异表达分析差异表达分析是转录组数据分析的核心步骤，它通过统计学方法找出在不同条件下差异表达的基因。
常见的差异表达分析方法有DESeq2、edgeR和limma等。
这些方法利用统计学模型和假设检验来计算基因表达的显著性差异，并生成差异表达基因列表。
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
RNA-seq方法原理、数据分析、数据库及工具介绍
RNA-seq⽅法原理、数据分析、数据库及⼯具介绍RNA-seq⽅法原理、数据分析、数据库及⼯具介绍能够对RNA序列数据进⾏分析的新⽅法可以让我们从头开始构建转录组。
对RNA进⾏测序⼀直以来都被认为是⼀种发现基因的有效⽅法，⽽且这种⽅法还被认为是对编码基因以及⾮编码基因进⾏注释的⾦标准。
与以前的⽅法相⽐，⼤规模平⾏RNA测序⽅法（massively parallel sequencing of RNA）极⼤增强了RNA测序技术的处理能⼒，使我们得以能够对转录组进⾏测序。
在本⽂中即将介绍到的这两种RNA测序⽅法就能以前所未有的精度对转录组进⾏分析。
Trapnell⼩组使⽤的⽅法是⼀种名为Cufflinks的软件。
这种软件能够随时发现⼩⿏⽣肌细胞（myoblast cell）内新出现的转录⼦，还能在细胞分化时对转录⼦表达⽔平进⾏监测，从⽽分析基因表达情况和剪接情况。
Guttman⼩组也使⽤了与 Trapnell⼩组相类似的软件⽅法，不过他们使⽤的是另⼀种名为Scripture的软件。
Scripture软件可以对源⾃三个⼩⿏细胞系的转录组进⾏再注释（reannotate），从⽽对数百个最近新发现的lincRNA（large intergenic noncoding RNA）进⾏完整的基因模式注释。
虽然RNA测序技术已经出现了将近20年，但直到最近才开始构建克隆⽂库。
对⼈类、⼩⿏以及其它重要模式⽣物进⾏全长基因克隆构建的科研项⽬需要⼏年的时间才能够完成。
但是有了最新的测序技术，我们将不再需要构建克隆⽂库，可以直接对cDNA⽚段进⾏测序。
我们现在可以只需要花费⼏天，仅⽤以往同类项⽬科研经费的很少⼀部分就能够得到⼀个⽐较满意的完整的细胞转录组。
但是这种新技术也存在⼀点问题。
不⽤构建克隆，我们就⽆法知道哪⼀个“结果（mRNA或蛋⽩）”来⾃哪⼀个转录⼦。
最近已经有⼈开始通过对已知的或者预测出来的转录⼦的短RNA序列进⾏测序的⽅式来对基因表达和可变剪接进⾏分析研究。
RNA-Seq项目常见问题与解答
RNA-Seq项目常见问题与解答这两年随着测序成本的下降和转录组研究的日渐火热，RNA-seq俨然已经成为了分子生物学课题组推进项目的首选方向。
在我们接触的转录组项目中，有些老师对项目分析结果存在或多或少不清楚或有疑惑的地方。
那么春天来了，花儿开了，今天福利也到了，我们特意将转录组项目中常见的一些问题进行了汇总，各位老师可以按需自取哈。
1．如何判定生物学重复一致性的高低？生物学重复统计方法及公式答：（1）皮尔逊相关系数r可以作为生物学重复相关性的评估指标，理想的生物学重复试验r2≧0.92。
考虑到个体差异、取材环境、时间以及人员操作熟练程度等因素对测序数据的影响，一般r2≧0.8为可接受范围。
（2）Pearson（皮尔逊）相关系数：皮尔逊相关也称为积差相关（或积矩相关）是英国统计学家皮尔逊于20世纪提出的一种计算直线相关的方法。
2．DEG基因用Transcripts还是Unigenes？答：DEG基因用的是Unigene。
3．transcript-id代表什么意思？为什么有的基因有多个transcript-id？答：基因转录本id；因为可变剪切的缘故，一个基因可能有多个转录本。
4．在miRNA鉴定中，可能成为miRNA的reads是怎样计算的？哪些条件会影响到mrd值？micro RNA在不同组织有异构体的存在，是如何处理的？答：与 Rfam， miRbase， RepBase和 Exon\Intro 序列库进行比对，获得 sRNA 注释信息，以此作为预测新的 miRNA 的基础。
miRNA的鉴定是利用miRDeep2软件进行已知及新（保守及非保守）的miRNA鉴定。
miDeep2会在reads比对到基因组上的位置两端分别延伸75、15bp进行结构预测，此软件认为极可能与可能是miRNA的根据是通过mrd值来区分的，mrd>-10为可能，mrd>0为极可能；影响mrd值的有reads在基因组上的分布和碱基结合的自由能等；5．对于有生物学重复的项目，怎样计算差异基因？答：两两比对使用的是R的EBseq包, 是基于负二项分布检验的方式对reads数进行差异显著性检验，重复间的比对使用的是R的DEseq包，是基于分层贝叶斯模型的原理对组合内样品进行分析。
rnaseq数据分析流程
rnaseq数据分析流程RNA-seq数据分析流程。
RNA测序（RNA-seq）是一种用于研究转录组的高通量测序技术，它可以帮助科研人员了解基因表达和转录本结构。
在本文中，我们将介绍RNA-seq数据分析的一般流程，包括数据预处理、基因表达分析和功能注释等步骤。
1. 数据预处理。
首先，我们需要对原始的RNA-seq数据进行质量控制（QC）。
这包括使用软件如FastQC来评估测序数据的质量，检测是否存在低质量的碱基或测序错误。
接下来，我们需要对数据进行去除接头（adapter trimming）和过滤低质量读（quality filtering）。
这些步骤可以使用工具如Trimmomatic或Cutadapt来完成。
最后，我们需要对清洗后的数据进行比对到参考基因组（alignment），这可以使用软件如HISAT2或STAR来完成。
2. 基因表达分析。
一旦我们获得了比对到参考基因组的数据，我们就可以开始进行基因表达分析。
首先，我们需要对比对结果进行计数，这可以使用软件如featureCounts或HTSeq来完成。
然后，我们需要对表达数据进行标准化，例如使用DESeq2或edgeR来进行基因表达的差异分析。
最后，我们可以使用一些可视化工具如ggplot2或heatmap 来展示基因表达的模式和差异。
3. 功能注释。
最后，我们可以对不同表达的基因进行功能注释。
这包括对差异表达基因进行富集分析（enrichment analysis），例如富集在特定的通路（pathway）或生物学过程（biological process）中。
这可以使用工具如DAVID或Enrichr来完成。
此外，我们还可以对差异表达基因进行蛋白质-蛋白质相互作用分析（protein-protein interaction analysis），例如使用STRING数据库来预测蛋白质之间的相互作用网络。
总结。
综上所述，RNA-seq数据分析是一个复杂的过程，涉及到数据预处理、基因表达分析和功能注释等多个步骤。
转录组测序（RNA-seq）技术
转录组测序（RNA-seq）技术转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。
转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。
相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。
技术优势：数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。
高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。
任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。
同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。
更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。
应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。
图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异康成生物提供的RNA-se q技术服务实验流程：1. 样品RNA准备2. 测序文库构建使用oligo dT微珠纯化mRNAmRNA片段化处理反转录反应合成合成双链cDNA双链DNA末端修复及3’末端加‘A’使用特定的测序接头连接DNA片段两端高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库3. DNA成簇（Cluster）扩增4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）5. 数据分析原始数据读取与数据库比对并进行注释深层次数据分析6. 提供实验报告原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等。
RNA-seq数据分析
RNA-Seq数据分析从原始的数据开始，进行reads回帖，到拼接转录本，计算表达量，分析差异表达，最后可视化分析结果。
TopHat是一个把reads回帖到基因组上的工具。
首先用Bowtie把reads 回帖到基因组上，然后通过拼接，我们就可以在基因组上看到一些reads堆叠起来的区域，称为consensus,这些consensus可能是一个真的外显子，也有可能是几个外显子拼在一起的，或者一些别的情况。
我们知道，经典的剪切位点一般都有GT和AG这样的序列标志，在consensus的边界和内部，TopHat会去找这样的剪切位点，并且得到他们可能的组合。
然后对于那些没有被Bowtie贴到基因组上的reads,TopHat会对他们建立索引，去和这些可能的剪切位点比对，这样就把跨越剪切位点的reads准确地贴到基因组上。
一些比较重要的命令行选项。
关于插入片段长度的选项：在RNA-Seq中，会把mRNA打断成小的片段，然后对片段长度进行iding筛选后拿去测序，如果选择的片段长度是300bp，两端各测序75bp的reads,中间的插入片段长度就应该设为150bp.下面是设置插入片段长度的标准差，如果选择的片段长度比较集中，这个值可以设置的小一些，反之应该设置得大一些。
-G选项是提供哦呢一个已有的注释文件。
如果你分析的基因组被注释得比较好了，最好能够提供这个文件，这时TopHat就会先把reads往转录组上贴，没有贴到转录组上的再往基因组上贴，最后把结果合并起来。
我们知道大多数的转录组都是比基因组小得多的，而且junction reads可以直接贴到转录本上，所以这样回帖的效力和准确度都可以得到提高。
标准的Illumina平台是不分链的，我们无法知道配对的reads哪个方向和转录本一致，哪个和转录本反向互补。
对于分链的数据，也有两种情况，在firststrand这种分链方法中，第二个read和转录本方向一致，第一个read和转录本反向互补，在另一种fr- secondstrand分链方法中，就刚好反过来了。