第五章 分子发光分析分解

五、 荧光分析法的应用
(1) 无机化合物的分析
与有机试剂形成配合物后测量；可测量近70多种元素。 配合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使得无荧 光或荧光弱的物质转变为强荧光物质。
二 pH=5.0,与Al3+→黄绿色荧光物 元 荧光镓 pH=3.0,与Ga3+→黄色荧光物 配 与硼酸盐→绿蓝色荧光物 合 安息香 碱性介质中 与Zn2+→绿色荧光物 物
四、 定量分析方法
1 定量依据
当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之 间的关系式为 If=2.3φfI0εbc 式中：φf为荧光效率，I0为激发光的强度，ε荧光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。 在一定条件下，φf、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成 If =K c 即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀（A<0.05）的 溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。
检出限：比分光光度法低2～4个数量Fra Baidu bibliotek；
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围较分光光度法小。
二、基本原理
(一)分子荧光光谱的产生 1.分子能级与电子能级的多重性
能 量 π* π* π*
a. 基态 S0 b. 激发单重态 Sn c. 激发三重态 Tn 2S+1=1 2S+1=3
(四)荧光的激发光谱和发射光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发 射波长)，化合物发射的荧光 强度与照射光波长的关系曲 线 (图中曲线I ) 。 2.荧光(磷光)的发射光谱曲线 固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光与 发射光波长关系曲线(图中曲线 II)。
3.激发光谱与发射光谱的关系
荧光激发光谱 荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光分析仪器
测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器和显示器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色器 光源：氙灯和高压汞灯 样品池：石英 检测器：光电倍增管。
(二)荧光效率及其影响因素
1、荧光效率：又称荧光量子产率，就是指激发
态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用f表示， f为0~1，即
发射的光量子数 发荧光的分子数 f 吸收的光量子数 激发态分子总数
荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大， 物质发射的荧光也就越强。 Kf f K f Ki
21.5
38.8
405
410
0.055
0.064
(2)温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，一般来说，溶液的荧光强度 随着温度升高而降低。
(3) 溶液pH
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一
般都与溶液的pH有关，因此在荧光分析中要严格控制溶液的
pH值。 如苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性溶液中，无荧光
磷光测定。
（2）磷光镜 有些物质同时会发生荧光和磷光，为了能在同时有
荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发光单色器
和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个斩 波片，并由一个同步马达带动，这种装置称作磷光镜。
三、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用较少， 它主要用于测定有机化合物。 (1) 稠环芳烃分析
三 元 配 合 物
罗丹明B + Au3+ 、Ga3+ 等与Cl-、Br-等先形成二元络合物
(2) 有机化合物的分析 芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发 生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂肪族化合物 的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某 些试剂反应后才能进行分析。 如：测定丙三醇
芳香族化合物适当的与某些试剂作用后测定可 提高灵敏度。
第二节 磷光分析法
磷光是从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射
分子磷光分析法是依据分子磷光光谱进行定性，以 磷光强度进行定量的一种分析方法。
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长 （2）磷光的寿命比荧光长
一、基本原理
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系 当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质
3、环境因素对荧光的影响
(1) 溶剂的影响
由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质
在不同的溶剂中的荧光光谱的位置和强度都会有显著的不同 如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂
四氯化碳 氯仿
介电常数
2.24 5.2
荧光峰λ/nm
390 398
荧光效率
0.002 0.041
丙酮
乙腈
π a
π b
π c
单重态与三重态的区别 电子的自旋方向不同 三重态的能量稍低于单重 态
单重态和三重态的 电子分布图
2.荧光的产生
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和非辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 非辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转移
外转移
振动弛豫
激发态 → 基态：多种途径和方式 ( 见下页能级图 ) ；速度最 快、激发态寿命最短的途径占优势；
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环
芳烃和杂环化合物（致癌物质）
(2) 农药、生物碱、植物生长激素的分析
(3) 药物分析 见下表
浓度c之间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc
式中： φp 为磷光效率， I0为激发光的强度， ε磷光物
质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。 在一定条件下， φp 、 I0 、 ε 、 b 均为常数，所以 上式可写成： 浓度c成正比。 Ip=Kc 即磷光强度与磷光物质的
2.温度对磷光强度的影响
随着温度的降低，磷光逐渐增强。 低温磷光:用液氮作冷却剂
2 定量分析方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线， 再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求 出未知试样的浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
Fs F0 Cs Fx F0 Cx
Fx F0 Cx Cs Fs F0
内转换
振动弛豫 系间窜越
内转换
S2 S1
能 量 吸 收 发 射 荧 光
T1
外转换 发 射 磷 光
T2
振动弛豫
S0
l1
l2
l 2
l3
荧光发射： 电子由第一激发单重态的最低振动能级 → 基 磷光发射： → 基态 外转换：电子由第一激发三重态的最低振动能级 激发分子与溶剂或其他分子之间产生 ‘ 的荧光； 10-7～ 态（ 多为 S → S 跃迁），发射波长为 l （ T → S 跃迁）； 内转换 内转换 1 0 1 0 相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 振动弛豫 2 S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S2 -9 s 电子由 10 。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小， 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间窜跃
（2）胶束增稳的溶液室温磷光法
当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶
束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微环境
和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理
性质，减小了内转化和碰撞能量损失等非辐射去
活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，
从而可以实现在溶液中测量室温磷光。
二.磷光分析仪
和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计上 配上磷光附件后，即可用于磷光定量。 （1）试样室 将试样放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温
叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移 至低振动能级，而将多余的能量以热 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如的形式发出。 S1→T1就是一种 至低能级。
发 发 射 射 外转换 吸 荧 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重 磷 振动驰豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转 收 振动弛豫 光 光
再如 苯胺在pH7～12溶液中有蓝色荧光，而在pH小于2大于
13的溶液中都不发荧光。 另外金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受到溶液的
pH影响
(4)表面活性剂的影响
表面活性剂的存在，使得处于激发单重态的的 荧光物质分子起到保护作用，减少了非辐射跃迁几 率，提高荧光效率。
(5)顺磁性物质的影响
顺磁性物质的存在，使得处于激发单重态分子 向三重态的体系间穿越速率增大， 荧光效率降低。 如O2 。
(6)溶液荧光的猝灭
荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引
起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低
的物质称为猝灭剂。 （1）碰撞猝灭 （2）静态猝灭 （3）转入三重态的猝灭 （4）发生电子转移反应的猝灭 （5）荧光物质的自猝灭 M+hγ—M*,M*+Q—M+热 M+Q—MQ 非荧光 三重态O2 M+Q—发生电子转移 荧光物质浓度较高
第五章 分子发光分析
分子发光
基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，
当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回
基态时，便产生分子发光。
分类：依据激发模式不同
光致发光，场致发光，热致发光，化学发光等
光致发光：按激发态的类型分
荧光和磷光
第一节
一、概述
荧光分析法
分子荧光分析法是依据分子荧光光谱进行定性， 以荧光强度进行定量的一种分析方法。 特点：（1）灵敏度高
a.斯托克斯(Stokes)位移 指激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光 谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
荧光发射光谱 荧光激发光谱 磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620
b.发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如
能级图l
2
,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单
重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的 荧光(如l ‘2 )。
S2
能 量 内转换 振动弛豫 系间窜跃 发 射 荧 光 发 射 磷 光 内转换
S1
吸 收
T1
T2
外转换
振动弛豫
S0
l1
l2
l 2
l3
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与激发光谱成镜像对称关系。
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越 振动弛豫 → T1 荧光的发射波长比吸收波长要长； l ‘2 > l → > l ； 2 1 -4 发光速度很慢： S1 10 ～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间 T T2 能
内转移
量
1
系间窜跃
系间窜跃。 S0 通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态 l3 的最低振动能级。 l 2 l1 l2
3.重原子效应
使用含有重原子的溶剂或在磷光物质中引入 重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度， 这种效应称作重原子效应。 机理：重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级 交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合 作用，从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大，有 利于增大磷光效率。
4.室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择 的限制，发展了以下几种室温磷光法： （1）固体表面室温磷光法 基于测量室温下吸附于固体基质(载体)上的 有机化合物所发射的磷光。理想的载体是既能 将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加 刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活 化过程，而本身又不产生磷光背景。
2、荧光与分子结构的关系
（1）跃迁类型： * → 的荧光效率高，系间跨跃 过程的速率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并 产生红移 含 → * 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强 化合物（在环己烷中） 苯 联苯 对-联三苯 φf 0.07 0.18 0.93 λ/nm 283 316 342
（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂 的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞 有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
（4）取代基效应：芳环族化合物苯环上不同取代基 对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响，可 归为下列几种类型： 第一 给电子基团使荧光增强 -OH、-NH2、-NR2、-OR； 第二 吸电子基团会减弱甚至破坏荧光-COOH、 -NO2 ； 第三 卤素等重原子取代基，常导致荧光减弱和磷光 增强。 第四 将一个高原子序数的原子引入，常常增强磷光 而减弱荧光； 第五 双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的 平面性，则荧光增强，反之，则荧光减弱。