可溶性蛋白质含量测定
植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。
[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。
(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。
(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。
(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。
B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。
使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。
(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。
H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。
之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。
待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。
使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。
因此在使用前应进行标定。
实验6可溶性蛋白质的测定
水（mL） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量
（μg）
0 20 40 60 80 100
取6支10mL具塞试管，按上表加入试剂 ，混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮 蓝G-250溶液，稀释至刻线10mL（则蛋白质
浓度分别为0、2、4、6、8、10μg/mL ），
摇匀，放置5min后于595nm波长下比色。以 蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘 制标准曲线。
3. 实验材料、仪器与试剂 材料：豆芽 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶
，移液管，具塞刻度试管，研钵，漏 斗，铁架台，玻璃棒。 试剂：考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，磷酸， 牛血清蛋白。
试剂配制： 考马斯亮蓝G-250试剂：称取0.1000g考马斯 亮蓝G-250，溶于50mL95%乙醇中，加入 85%磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL。
左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速 ，其结合物在室温下1h内保持稳定。
考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比 较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对 电泳条带染色。
（3）样品的测定
另取3支10mL具塞试管，分别吸取样 品溶液0.6mL，各加入5mL考马斯亮蓝G250溶液，稀释至刻线10mL，充分混合， 放置5min后于595nm波长下比色，测定吸 光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
5. 结果计算
蛋白质含量（%）=
C×V2×V0 m×V1
× 100
式中： C——从标准曲线上查得的蛋白质浓度，g/mL
标准蛋白质溶液（100μg/mL）：称取
0.ห้องสมุดไป่ตู้100g牛血清蛋白（BSA），溶于100mL蒸 馏水中。
4. 实验步骤 （1）样品处理：
可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。
常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。
方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。
其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。
LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。
LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。
但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。
植物可溶性蛋白的测定
植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法更新时间2015-5-191、目的：测定植物组织的可溶性蛋白含量，测定范围为100-1000ug/ml，高浓度需要稀释后测定。
小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。
2、提取：用测定SOD （0.05M pH7.8磷酸缓冲液）或者POD （0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （pH6.0）的提取液或者用水提取均可，但混匀后要放置0.5-1小时再离心，以充分提取。
单独测定时，取样品5g，加水50ml，破碎，冷藏存储，测前10000rpm离心10分钟备用，取样0.1-0.2ml测定（如果加水比较少，计算时应考虑材料水分）。
3、测定：以提取液为对照，以牛血清标准蛋白为标准，以考马斯亮蓝G-250为显色剂，显色2-30分钟内，在595nm 比色。
4、计算：可溶性蛋白含量（ug/g鲜重）=测定含量（ug）*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。
5、试剂配制：5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取0.100g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液，此液不用时应冷藏保存，可用15天。
将1000μg／mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍，作为工作液，浓度为100μg／mL。
5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂：称取0.050g考马斯亮蓝G-250，溶于25mL95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸50mL，最后用蒸馏水定容到500mL。
此溶液在常温下可放置1个月。
标准曲线及样品配制表 蛋白含量（μg） 100μg/ml标准蛋白（μl） 提取液 （μl） 考马斯亮蓝G-250显色剂 （ml）0 0 10002.5 20 200 80040 400 600 60 600 400 80 800 200100 1000 0样品* X（一般叶片为1000） 1000-x*注1：样品量依据显色调整，生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。
可溶性蛋白质含量的测定
可溶性蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G—250染色法一．原理考马斯亮蓝G—250染色法是利用蛋白质与染料结合的原理，定量地测量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。
考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二．实验材料、试剂与仪器设备1．实验材料水稻不同萌发时期的种子2.试剂（1）标准蛋白质溶液（100μg/mL牛血清白蛋白）。
称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40Ml,用蒸馏水稀释至100mL即可。
（2）考马斯亮蓝试剂。
称取100mg考马斯亮蓝G—250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
3.仪器和设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
三．实验步骤1.标准曲线的绘制取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品测定（1）样品提取。
称取鲜样0.25—0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min 离心10min，上清液备用。
（2）吸取样品提取液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复2次），加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质的含量。
(完整word版)可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定方法:考马斯亮蓝G－250染色法1.原理：考马斯亮蓝G－250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内（1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小,除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
2.仪器：721分光光度计;10ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶;移液管；1ml3支;5ml3支；10ml 具塞刻度试管14支。
3.试剂:90乙醇％(无水乙醇20瓶以下8元1瓶,每瓶500ml)；85%磷酸（500ml磷酸标准溶液0。
1mol/ml，16元钱1瓶)；考马斯亮蓝G－250（80元钱1瓶，1瓶10g）；牛血清白蛋白。
考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250,溶50ml90％乙醇，85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
4。
标准曲线的绘制4.1、0～100μg/ml标准曲线的制作:取6支试管，按表1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml.准确吸取所配各管溶液0。
1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G—250试剂，盖塞,反转混合数次，放置2min后,在595nm下比色，绘制标准曲线。
可容蛋白含量测定
植物生理学模块实验指导李玲主编科学出版社可溶性蛋白含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的基本原理和方法。
【实验原理】蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在此基础上发展了蛋白质染色测定方法，涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
考马斯亮蓝是目前广泛使用的染料之一。
考马斯亮蓝G-250（Goomassie brilliant blue G-250）是测定蛋白质含量的一种染料。
该染料依其存在形式的不同表现为红色和蓝色，游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质结合后可变为蓝色，2~5min后在595nm处具有最大光吸收，可以稳定1h以上。
蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量（1~1000μg）呈正比，所以，利用这一特征进行蛋白质的定量测定。
该方法简便迅速、消耗样品量少、重复性好，但是不同种类的蛋白质之间差异大，当蛋白质含量偏高时，标准曲线线性较差。
【器材与试剂】1.实验仪器与用具电子天平、分光光度计、离心机、研钵、刻度试管及试管架、移液管、容量瓶2.实验试剂考马斯亮蓝G-250染色液：称取考马斯亮蓝100mg，用50ml 95%乙醇溶解，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1L，储于棕色瓶中。
标准蛋白溶液（0.1mg/ml）：称取10mg牛血清蛋白，用0.9%的氯化钠溶解，定容至100ml。
3.实验材料苹果、梨、香蕉、柑橘等果实【实验步骤】1.取7支试管，按照表1加入试剂。
混合摇晕，放置5~20min。
用分光光度计测定OD595值。
以OD595为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
表1 考马斯亮蓝法标准曲线的各种试剂加入量0 1 2 3 4 5 6牛血清蛋白(mg/ml)0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水（ml） 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 52. 称取果肉样品2g放入研钵中，加2ml蒸馏水研磨成匀浆，移到离心管中，用6ml蒸馏水分次洗涤研钵，转移至林新馆中，4000r/min离心15min，上清液转入容量瓶，蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。
可溶性蛋白质含量测定
考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量一、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000µg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。
其结合物在室温下1h内保持稳定。
此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、材料、仪器设备及试剂1、材料：小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料2、仪器设备：分光光度计、研钵、烧杯、移液管3、试剂（1）标准蛋白质溶液：100µg·ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
三、实验方法及步骤1、标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂。
混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（µg）0 20 40 60 80 100图1 蛋白质质量数与吸光度值线性关系图（雷恩，2016）2、样品测定（1）样品提取：氨基酸含量测试结束后，剩余的样品提取液可以作为该实验的样品提取液，如果没有上述提取液，则按照下面的方法进行提取。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量
一、原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000µg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。
其结合物在室温下1h内保持稳定。
此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、材料、仪器设备及试剂
1、材料：小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料
2、仪器设备：分光光度计、研钵、烧杯、移液管
3、试剂
（1）标准蛋白质溶液：100µg·ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
三、实验方法及步骤
1、标准曲线的绘制
取6支具塞试管，按表加入试剂。
混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
管号123456
标准蛋白质（ml）0
蒸馏水量（ml）0
蛋白质含量（µg）020*********
图1 蛋白质质量数与吸光度值线性关系图（雷恩，2016）
2、样品测定
（1）样品提取：氨基酸含量测试结束后，剩余的样品提取液可以作为该实验的样品提取液，如果没有上述提取液，则按照下面的方法进行提取。
取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。
（2）吸取样品提取液，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
（3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·V
T ）/（1000·V
S
·W
F
）
式中：C—查的标准曲线值（µg）V
T
—提取液总体积（ml）
W
F
—样品鲜重（g）
V
S
—测定时加样量（ml）。