葡聚糖凝胶色谱柱
SephadexG10凝胶色谱柱
Sephadex G10 凝胶色谱柱在药物质量控制中的应用（大连依利特公司应用实验室）1.前言目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。
由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。
因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。
在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。
中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。
但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。
针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。
2年来用户使用得到很好的效果。
2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述中国药典2000版采用Sephadex G-10色谱柱分离表1所示的四种头孢化合物中的聚合物，定量方法均为自身对照外标法，药物对照品的分析采用相同的流动相条件（0.01％十二烷基硫酸钠溶液），但是样品的分析用流动相组成和盐的浓度不完全相同。
评价色谱柱柱效和拖尾因子均采用蓝色葡聚糖2000。
以下分别在上述条件下评价了依利特Sephadex G-10色谱柱的性能指标及其在药物分析中的应用谱图。
3．Sephadex G-10色谱柱的性能评价表2 在药典规定条件下蓝色葡聚糖2000评价色谱柱性能Sephadex G-10凝胶色谱柱能够分离分子量小于700的肽、蛋白及葡聚糖等高分子化合物。
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项(包含各种溶剂的溶胀系数)
(1)选择条件：
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。
(2)饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
Tetrahydrofuran四氢呋喃3.3～3.6
Dioxane二氧杂环已烷3.2～3.5
Acetone丙酮2.4～2.6
Acetonitrile***乙腈2.2～2.4
Carbon tetrachloride四氯化碳1.8～2.2
Benzene苯1.6～2.0
Ethyl acetate乙酸乙酯1.6～1.8
(3)样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。
(4)湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
(5)洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。
再生以备下次使用。
6分离的技巧，最后说说我的使用心得
（1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。
2 Sephadex LH20的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
葡聚糖凝胶G-25的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。
(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。
同时大开下口慢速流出蒸馏水。
装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。
否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。
(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。
然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。
本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。
洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。
据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。
但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。
(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。
若使用数次，就需要再生处理。
用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。
若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
G-10葡聚糖凝胶色谱柱是一种常用的分离和纯化生物大分子
的柱子，特别适用于分离寡聚糖和多糖混合物。
该柱子采用葡聚糖作为固定相，具有一定的孔隙大小和分子筛效果。
G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于分离多糖、寡糖和其他大分
子化合物。
在使用之前，需要将柱子进行激活和平衡，具体步骤如下：
1. 将G-10葡聚糖凝胶色谱柱放入柱子支撑架上，并连接到色
谱系统上。
2. 将适当的缓冲液（如适应于样品的缓冲液）通过柱子进行激活，以去除可能存在的杂质和污染物。
3. 进行柱子平衡：将适当的缓冲液通过柱子流经，直到柱子和系统达到平衡状态。
4. 加载样品：将待分离的样品按照柱子载样方法加载到柱子上。
5. 进行色谱分离：根据需要，控制缓冲液的流速和浓度梯度，使待分离的目标化合物在柱子上进行分离。
6. 收集分离物：根据其他方法（如按时间段收集、检测波长等）进行分离物收集和检测。
值得注意的是，G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于相对较小的
生物大分子分离，如寡聚糖和多糖，对于更大分子的分离可能需要使用其他类型的色谱柱。
此外，在操作过程中需要根据具体样品的特性和需要进行柱子条件的调整。
葡聚糖凝胶柱的特点
葡聚糖凝胶柱的特点
葡聚糖凝胶柱是一种常用的色谱柱，用于分离和纯化生物大分子，如蛋白质、核酸和多糖等。
它具有以下几个特点：
1. 大孔结构：葡聚糖凝胶柱内部存在着大量的孔隙，这些孔隙可以提供足够的表面积和空间来容纳样品分子。
这种大孔结构使得样品分子可以在柱内自由扩散和迁移，从而实现有效的分离。
2. 选择性：葡聚糖凝胶柱的选择性主要取决于其孔径大小和孔隙结构。
不同孔径的葡聚糖凝胶柱可以用于分离不同大小的生物大分子。
较大孔径的葡聚糖凝胶柱适用于分离较大分子，而较小孔径的葡聚糖凝胶柱适用于分离较小分子。
3. 高效性：葡聚糖凝胶柱由于具有大孔结构和选择性，可以提供高效的分离和纯化。
样品分子可以在柱内快速扩散和迁移，从而实现高效的分离。
此外，葡聚糖凝胶柱还具有较高的样品加载容量，可以处理大量样品。
4. 稳定性：葡聚糖凝胶柱具有良好的化学和物理稳定性。
它们可以在不同的溶剂和温度下使用，并且可以承受较高的压力。
这种稳定性使得葡聚糖凝胶柱可以在多种条件下进行分离和纯化。
5. 可重复使用：葡聚糖凝胶柱可以反复使用。
在使用后，可以通过适当的清洗和再生方法将其恢复到初始状态，以便下一次使用。
葡聚糖凝胶柱在生物分离和纯化领域具有广泛的应用。
它们常用于蛋白质和核酸的分离和纯化，如蛋白质层析、核酸净化和多糖分析等。
葡聚糖凝胶柱的特点使其成为生物大分子分离和纯化的重要工具，为科学研究和生物制药提供了有力支持。
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量一、本文概述多糖作为一种重要的生物大分子，广泛存在于自然界中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等。
因此，对多糖的纯度及分子量的准确测定对于其研究和应用具有重要意义。
高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种常用的多糖纯度及分子量测定方法，具有操作简便、分辨率高、重现性好等优点。
本文旨在介绍HPGPC法测定多糖纯度及分子量的原理、实验步骤、数据处理及注意事项，以期为多糖的研究和应用提供参考。
二、实验材料与方法1 多糖样品：选择待测定的多糖样品，确保其来源清晰，无杂质污染。
2 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）柱：选择适当型号的HPGPC柱，以适用于待测多糖样品的分子量范围。
3 流动相：通常选用适当的溶剂或缓冲液作为流动相，以保证多糖样品在色谱柱上的良好分离。
4 检测器：使用示差折光检测器（RI）或紫外检测器（UV）等，以监测多糖样品在色谱柱上的分离情况。
5 其他试剂与仪器：包括样品制备所需的试剂、色谱仪、注射器、进样针等。
1 样品制备：将多糖样品溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的溶液，以便进行后续分析。
2 色谱条件优化：通过预实验，优化色谱条件，包括流动相的选择、流速、柱温等，以获得最佳的分离效果。
3 进样与分离：将制备好的多糖样品溶液通过注射器注入HPGPC 仪中，通过色谱柱进行分离。
在分离过程中，利用检测器监测多糖样品的分离情况。
4 数据收集与处理：收集分离过程中的数据，利用相应软件对数据进行处理和分析，包括分子量计算、纯度分析等。
5 结果评价：根据分析结果，评价多糖样品的纯度及分子量分布情况，为后续研究提供依据。
通过以上实验材料与方法，可以高效地进行多糖纯度及分子量的测定，为后续多糖的结构研究、质量控制等提供重要支持。
三、实验结果与讨论在本研究中，我们采用了高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对多糖样品的纯度和分子量进行了测定。
葡聚糖凝胶 G-50 Medium 使用说明书
葡聚糖凝胶G-50 Medium使用说明书为确保产品的性能和无忧的操作，使用前请仔细阅读本手册，有任何疑问请咨询本公司售后技术支持或销售人员。
1. 产品介绍葡聚糖凝胶G-50 Medium是一种凝胶过滤层析介质（也叫体积排阻色谱），适用于生物分子的脱盐、缓冲液置换、组群分离、精细纯化。
特点如下：a. 经典的葡聚糖介质，选择性好。
b. 生物大分子（>30kDa）的快速脱盐和缓冲液置换（一步完成）。
c. G-50 Medium，可用于组群分离和杂质的去除（以排阻限30kDa为分界点）。
d. G-50 Fine，可用于小分子蛋白的分离纯化（1.5-30kDa）。
表1：性能参数2.选择2.1 介质级别的选择a. 快速脱盐、缓冲液置换、组群分离和杂质的去除：选择G-50 Medium，粒径大、流速快。
b. 小分子蛋白分离纯化：选择G-50 Fine，粒径小、分辨率高。
2.2 层析柱的选择a. 快速脱盐、缓冲液置换、组群分离和杂质的去除（上样量可达到30%CV）：选择粗短型层析柱（柱床高度低，例如XK 16/20），流速快、周期短。
b. 小分子蛋白分离纯化（上样量为0.5%-4%CV）：选择细长型层析柱（柱床高度高，例如XK 16/70），柱效高、分辨率好。
备注：CV指柱体积。
3. 使用3.1 溶胀取一定量的干粉，加入过量的纯化水（缓冲液：干粉≥20ml：1g），在室温（25℃）溶胀24小时或沸水浴溶胀3小时。
备注：溶胀过程中可进行柔和的搅拌，杜绝使用高速或剧烈的搅拌方式（例如磁力搅拌等）。
3.2 清洗待介质自然沉降后，小心的倒出上清液（包括极少量没有溶胀好的干粉和一些漂浮的小颗粒介质），再加入3-5倍体积的纯化水进行重悬。
重复此步骤5次。
备注：用于清洗产品中残留的微量有机试剂和碱性物质。
3.3 重悬在清洗好的介质中加入一定量的缓冲液（缓冲液:介质=1:3），用玻璃棒或其它搅拌装置柔和搅拌3-5分钟。
凝胶色谱柱怎么清洗和存放
凝胶⾊谱柱怎么清洗和存放 凝胶⾊谱技术是六⼗年代初发展起来的⼀种快速⽽⼜简单的分离分析技术，由于设备简单、操作⽅便，不需要有机溶剂，对⾼分⼦物质有很⾼的分离效果。
凝胶⾊谱法⼜称分⼦排阻⾊谱法。
凝胶⾊谱主要⽤于⾼聚物的相对分⼦质量分级分析以及相对分⼦质量分布测试。
⽬前已经被⽣物化学、分⼦⽣物学、⽣物⼯程学、分⼦免疫学以及医学等有关领域⼴泛采⽤，不但应⽤于科学实验研究，⽽且已经⼤规模地⽤于⼯业⽣产。
那么，凝胶⾊谱柱应该如何进⾏清洗和存放呢？ 1.凝胶⾊谱柱的清洗。
为了不使被测物质和杂质停留在⾊谱柱中，在每次的样品分析⼯作完成之后，都应及时地清洗凝胶⾊谱柱。
⾸先要⽤对被测样品洗脱能⼒强的溶剂来洗脱凝胶⾊谱柱，以分析⼯作中常⽤的反相⾊谱分析法为例，因其先流出的物质是极性⼤的物质，此时应⽤100%的甲醇或使⽤异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性⼩的物质洗脱下来，洗脱液的⽤量⼀般为柱体积的20倍即可。
如果流动相是缓冲溶液，则应先⽤蒸馏⽔来冲洗凝胶⾊谱柱，以冲掉凝胶⾊谱柱内的盐，然后再⽤合适的溶剂来冲洗。
2.凝胶⾊谱柱的存放。
如果凝胶⾊谱柱暂时不⽤，存放时要注意以下⼏点：1.将凝胶柱⽤蒸馏⽔冲净后充上0.02%-0.05%的叠氮钠⽔溶液封存,或三氯丁醇(0.015%) 苯基汞代盐(0.001-0.01%)将⾊谱柱封闭后低温保存(温度在5℃左右)在冰箱。
2.再次使⽤时,⽤蒸馏⽔将保护溶液冲洗掉即可使⽤。
3.如果第⼆天还要使⽤也要从系统中取下，将柱封闭后存于4~8度的冰箱中冷藏。
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葡聚糖凝胶色谱柱
概述
葡聚糖凝胶色谱柱（dextran gel filtration column）是一种分离生物大分子的常见方法之一。
它是利用生物大分子在不同孔径的凝胶中的分布系数不同，实现分离的原理。
具体来说，大分子无法进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留更长时间，而小分子能够进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留时间更短，从而实现分离。
实验过程
使用葡聚糖凝胶色谱柱进行分离实验的步骤如下： 1. 制备样品：将所需的大分子混合液或生物组织样品制备好。
2. 将样品滴到色谱柱顶部，并保持柱顶刚好覆
盖样品。
3. 添加移液管中的洗脱液，并在细流下加缓冲液。
4. 在必要的时候，可
以连续添加洗脱液、缓冲液和样品，直到滤出大分子为止。
5. 收集样品，并进行
下一步实验。
应用领域
葡聚糖凝胶色谱柱广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
常见的应用包括：1. 分离蛋白质：通过分离分子量不同的蛋白质来研究其结构和功能。
2. 分离核酸：通过分离不同长度的DNA片段和转录产物来研究基因的组成和调控机制。
3. 分离
糖类：例如分离化合物，如淀粉和糖原，以研究其结构和功能。
4. 生物大分子纯化：通过纯化生物大分子（如酶和抗体）来研究其特性和应用。
常见问题解答
葡聚糖凝胶色谱柱可以重复使用吗？
可以。
只要正确使用和保持清洁，色谱柱可以反复使用多次，提供不断稳定的
分离能力。
色谱柱如何保养？
在每次使用后，应使用清洁试剂对色谱柱进行冲洗，以防止残留的生物大分子
或洗脱液。
还应防止色谱柱干燥，避免损坏凝胶。
如何选择正确的分离柱？
对于不同种类的分析样品，应选择不同孔径的凝胶柱。
一般来说，较小的分子
要使用较小的孔径凝胶柱，而较大的分子要使用较大的孔径凝胶柱。
此外，应选择适当的缓冲液，以保证生物大分子的稳定性和稳定性。
总结
葡聚糖凝胶色谱柱是一种有效的生物分离方法，具有广泛的应用领域，特别是在研究蛋白质、核酸和糖类方面。
正确选择和使用凝胶柱，以及正确维护和保养，可以确保稳定的分离效果。