1,3-β-D-葡聚糖检验简介
真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测操作SOP文件--血清
真菌（1-3）-β-D葡聚糖测定规范操作1.目的建立真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测标准操作规范，保证实验结果的准确性。
2.授权操作人经培训合格的微生物实验室检验人员。
3.实验原理（1-3）-β-D葡聚糖检测原理：真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白，根据其所引起的浊度变化对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。
4．产品性能指标4.1 灵敏度10pg/ml4.2 精密度批内差CV≤10% 。
4.3 准确性回收率75-125%。
4.4 标准曲线相关系数r绝对值≥0.9805．实验组成5.1实验仪器及器具：MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪，20~200µl加样器、100~1000µl加样器、旋涡混合器、定时器。
5.2实验耗材：200µl无热原吸头、1000µl无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。
5.3试剂盒组成：真菌（1-3）-β-D 葡聚糖检测试剂盒（光度法）：试剂盒包括反应主剂和样品处理液。
6．工作环境相对湿度：20%~80%；温度控制：10~30℃；电源电压：220V±10%，50Hz±2%。
7．标本采集及保存7. 1检测样本：血液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等。
7.2采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管。
常规病人早上用药治疗前采血/取样（血透患者透析前采血）。
7.3样本保存：样本采集后应在3000转/分离心10分钟，若不能及时检测，应将血清转移至无热原转移管内，在-20℃冰箱中冷冻保存，一周内使用，实验之前取出复溶。
8．操作程序8.1 打开MB-80微生物快速动态检测系统主机、电脑及恒温仪预热30min。
8.2 打开MB-80微生物快速动态检测系统软件，录入病人信息、样本种类及检测项目等信息后点击采集。
8.3 血液前处理过程，无菌操作，用专用无热原真空采血管抽取静脉血4ml轻轻混匀，按转速3000r/min离心10分钟。
血清（1-3）-β-d葡聚糖检测判断肺部侵袭性真菌感染的诊断价值
572014年2月第21卷第3期血清（1-3）-β-D 葡聚糖检测判断肺部侵袭性真菌感染的诊断价值谢 颖肺部侵袭性真菌感染（PIF I ）的诊断目前主要根据患者痰培养或肺组织活检，但操作复杂，尤其是肺组织活检，临床可操作性差，不易开展。
（1-3）-β-D 葡聚糖为一种多糖，普遍存在于真菌的细胞壁中，约占真菌细胞壁干重的50％。
笔者对我院送检痰标本患者的血清进行（1-3）-β-D 葡聚糖检测，评价其在PIFI 中的诊断价值。
1 资料与方法1.1 一般资料与分组 2008年6月至2012年11月，送检我科的支气管镜吸引痰标本及其患者血清各77份。
有广谱抗生素应用史41例（53.2%），糖皮质激素使用史31例（40.3%），体内置留导管22例（28.6%），恶性肿瘤史8例（10.4%）。
痰标本培养真菌阳性28例，设为感染组；阴性49例，设为非感染组。
1.2 血清（1-3）-β-D 葡聚糖检测 检测流程按试剂盒要求逐步进行。
① 将事先准备待检的静脉血2ml 置入离心管中以2900r /min 的转速离心6min ，然后吸取上层血清100μl 置入900μl 处理液中，振荡摇匀。
将其放置在恒温水浴箱中70℃孵育10min ，然后快速放置到冰水中。
② 将制备好的标本200μl 放入含有主反应试剂A 的管中，充分振荡混匀并移植标准玻璃反应管中，放入MB-80微生物快速动态检测系统中进行反应。
③ 反应1h 后进行结果判断。
1.3 统计分析 计量资料以（x-±s ）表示，组间比较用t 检验。
计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验。
Stata 12.0统计绘制ROC 曲线，并根据敏感性和特异性的最佳组合判断血清（1-3）-β-D 葡聚糖的临界值，并给出相应的该临界值下的诊断PIF I 敏感性和特异性，计算曲线下面积，双侧P ＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果2.1 两组基本情况比较 年龄：感染组（66.8±9.2）岁，非感染组（67.4±11.1）岁，差异无统计学意义（t =0.24，P ＞0.05）。
支气管肺泡灌洗液(1,3)-β-D-葡聚糖检测对慢性呼吸系统疾病合并真菌感染诊断的临床价值
支气管肺泡灌洗液(1,3)-β-D-葡聚糖检测对慢性呼吸系统疾病合并真菌感染诊断的临床价值卢岳虹;潘玲;谭玉萍;冯原;陆彩云;冯玉清;苏齐鉴;罗珍贞【摘要】目的:探讨支气管肺泡灌洗液(1,3)-β-D-葡聚糖(BG)检测对慢性呼吸系统疾病合并真菌感染的诊断价值.方法:选取2013年5月至2016年12月在广西中医药大学附属瑞康医院呼吸科与重症医学科二区住院的90例慢性呼吸系统疾病患者作为研究对象,根据具体病情,这些患者被分为真菌感染组、普通感染组、非感染组,每组30例,分别采集患者的血浆和肺泡灌洗液标本进行葡聚糖检测试验,比较三组患者血浆和肺泡灌洗液BG浓度及对真菌感染预测效果.结果:三组患者血浆及肺泡灌洗液BG浓度比较,真菌感染组>普通感染组>无感染组,差异有统计学意义(P<0.05).血浆G试验浓度为66.07pg/mL时的约登指数值最大为0.584,敏感性为66.7％,特异性为91.7％;肺泡灌洗液G试验浓度为78.3pg/mL时的约登指数值最大为0.733,敏感性为80％,特异性为93.3％.结论:肺泡灌洗液G试验较血浆G试验对早期真菌感染的诊断更有临床价值,值得临床推广应用.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2019(021)002【总页数】4页(P73-75,81)【关键词】支气管肺泡灌洗液;(1,3)-β-D-葡聚糖;真菌感染;早期诊断【作者】卢岳虹;潘玲;谭玉萍;冯原;陆彩云;冯玉清;苏齐鉴;罗珍贞【作者单位】广西中医药大学,广西南宁 530001;广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011;广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011;广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011;广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011;广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011;广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011;广西中医药大学附属瑞康医院,广西南宁 530011【正文语种】中文【中图分类】R519;R56慢性呼吸系统疾病主要包括慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张、间质性肺疾病等，其在世界范围内具有较高的患病率、死亡率以及病程长和治疗成本高等特点，成为2015年全世界第3大死因[1]。
G试验和GM实验的区别及其临床意义
G试验和GM实验的区别及其临床意义在医学领域，为了诊断和监测某些感染性疾病，常常会运用到各种实验室检测方法，其中 G 试验和 GM 实验就是比较重要的两项。
这两种试验在检测原理、适用范围以及临床意义等方面存在着明显的区别。
G 试验，全称为（1,3）βD 葡聚糖检测试验。
（1,3）βD 葡聚糖是真菌细胞壁的一种重要成分，但在细菌和病毒中并不存在。
当人体受到真菌感染时，真菌细胞壁的（1,3）βD 葡聚糖会释放进入血液、脑脊液等体液中。
G 试验就是通过检测这些体液中（1,3）βD 葡聚糖的含量来判断是否存在真菌感染。
GM 实验，全称是半乳甘露聚糖检测试验。
半乳甘露聚糖是曲霉菌细胞壁的一种成分。
GM 实验主要用于检测人体血清、肺泡灌洗液等标本中半乳甘露聚糖抗原的水平，从而辅助诊断曲霉菌感染。
接下来，让我们详细了解一下这两种试验的区别。
首先，从检测的病原体范围来看，G 试验检测的范围相对较广。
它对除隐球菌和接合菌以外的大多数真菌感染都有一定的提示作用，如念珠菌、曲霉、毛霉等。
而 GM 实验则主要针对曲霉菌感染，对于其他类型的真菌感染检测价值相对较低。
其次，在检测标本方面，G 试验可以使用血清、血浆、脑脊液、腹水、胸腔积液等多种体液标本。
而 GM 实验通常使用血清和肺泡灌洗液，其中肺泡灌洗液对于诊断侵袭性肺曲霉病的意义更大。
再者，检测的时机也有所不同。
一般来说，G 试验在真菌感染的早期即可出现阳性结果，甚至在临床症状出现之前。
而 GM 实验在感染后的数天才可能呈现阳性，并且需要连续检测以提高诊断的准确性。
此外，两者的结果解读也存在差异。
G 试验结果阳性，提示可能存在真菌感染，但不能明确感染的真菌类型。
而且，某些因素可能导致假阳性结果，比如使用某些含有葡聚糖的生物制品、血液透析、输注白蛋白等。
GM 实验阳性对于诊断曲霉菌感染具有较高的特异性，但也可能出现假阳性，例如使用某些抗生素、食用含有半乳甘露聚糖的食物等。
1,3-β-D-葡聚糖检验简介
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质
麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶
14位还原和7－8位异构酶
角鲨烯环氧化酶
17
1,3-β-D-葡聚糖结构
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁
糖蛋白类
中
1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成
葡聚糖
分50%以上，是真菌细胞壁上
几丁质
的特有成分 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄
9
镜检和培养方法
敏感性低
血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证 实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。
培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区 分定植和感染困难
培养时间长 有些标本采集困难
10
非培养方法优点
快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检
真菌（1-3）-β-D-葡聚糖 与革兰氏阴性菌脂多糖检测
器械部 广东金羽医药发展有限公司
1
鲎
20世纪六十年代，人们 发现一种古老的海洋生物， 被称为“海洋活化石”的 鲎，它的血液与内毒素接 触后会发生特异性的凝集 反应，人们经过大量研究 和实验从它的血液中提取 出了用来检测内毒素的 “鲎试剂”。
2
真菌特异的代谢产物
D-阿拉伯糖醇
真菌 DNA 的检测
12
临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养 ≥2次分离到同种真菌
2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性
在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来， 故其在体液中的量不增高。
G试验介绍、影响因素和用药指南
趋向性诊断，早期筛查真菌感染——临床医生的诊断帮手1-3-β-D葡聚糖本质及特点(1-3)-β-D葡聚糖特性G试验的特点耗时短，１小时左右；灵敏度高，特异性强，定量检测；对于念珠菌血症，Ｇ试验是首选；葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中。
研究表明，（1-3）-β-D葡聚糖是占真菌壁50%以上的成分。
血液葡萄糖检测可在拟诊早期为临床医生提供机体是否感染真菌的可靠信息，1,3-β-D葡聚糖可用于真菌感染的早期诊断。
对热极为稳定，高压１２１℃并不能使其灭活。
在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对Ｇ试验灵敏。
有效早期筛查，可检测多种致病真菌感染，如念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，毛孢子菌等； 当真菌进入人体血液或深部组织中后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，（１－３）－β－Ｄ葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。
当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。
在浅部真菌感染中（痰液、皮肤、粘膜等属于浅部真菌感染的范畴），（１－３）－β－Ｄ葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。
［１］［２］［３］［４］［５］Ｇ试验检测的临床意义——抢先治疗G试验和GM试验的比较易感因素广谱抗生素治疗；骨髓和实体器官移植；长期激素治疗；AIDS等免疫缺陷症；抗肿瘤药物和免疫抑制剂治疗；插管等侵袭性治疗；基础类疾病：糖尿病、肝硬化等；是早期诊断IFI 无创检测手段之一；快速诊断：在1-2小时内为临床诊断侵袭性真菌感染症提供试验依据；指导用药：根据结果有针对性使用抗真菌类药物立即治疗；评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测，评价药物的有效性；监护病程：监护侵袭性真菌感染易感人群的病发状态；［６］Ｇ试验检测结果判读１、趋向性诊断儿童阈值比成人偏高，建议用50pg/m l 为阈值趋向性诊断——G 试验阴、阳性意义早期有效抗真菌治疗可极大改善患者预后美国四大医疗中心做的关于IF I 的一项回顾性研究*IFI: Intensive Fungal Infection 侵袭性真菌感染对于IFI 的患者，如不及时治疗会造成很高的死亡率（如图），因此早期有效抗真菌治疗至关重要。
真菌(1-3)-β-D葡聚糖
附1真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测标准操作规程1.目的规范真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测的操作规程，保证结果准确性。
2.原理实验条件下，来源于某些真菌细胞壁的(1-3)-β-D葡聚糖能够特异性地激活本试剂盒反应试剂的酶促凝集系统，使反应溶液的透光度发生变化。
利用(1-3)- β-D葡聚糖标准品建立β-D-葡聚糖生物效应与透光度变化关系的标准曲线，便可定量地测定人血液的(1-3)- β-D葡聚糖含量。
3.试剂真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测试剂盒，湛江安度斯生物有限公司。
试剂盒包装规格：20人份/盒。
复溶后的试剂溶液应在10分钟内使用。
若当次试验有剩余，可将剩余的试剂溶液置-20℃以下冷冻保存，一周内使用。
不能反复冻融试剂溶液。
4.检测设备：LKM动态试管检测仪。
5.实验用具：250 μl无热原吸头、20-200 μl移液器、75℃试管恒温仪、旋涡混合器、塑料试管架、无热原真空采血管（肝素抗凝剂）。
6.标本采集及送检要求6.1标本采集要求6.1.1采集过程要求无菌操作，用指定的肝素类抗凝、无菌、无β葡聚糖采血管；6.1.2常规住院病人早上用药前空腹采血，血透患者透析前采血。
6.2标本的送检和保存要求标本采集后应在半小时内离心，4小时内检测完。
若当日不能及时检测的标本应将离心后的血浆转移至无β葡聚糖的容器内-20℃以下冷冻保存，一周内使用。
7.实验操作7.1在试验开始前，先开启LKM动态试管检测仪，预热，一段时间后发出哔的一声，试管仪温度达到37℃，待用；7.2取本试剂盒所配的无热原真空采血管取受试者静脉血1～2 ml，以400 g离心10分钟；7.3取富含血小板的血浆100 μl，加到样品稀释瓶中，在旋涡混合器上轻轻混匀，然后插入75℃试管恒温仪中加热10分钟；7.4加热10分钟后，将样品稀释瓶从75℃试管恒温仪中取出，使其降至室温即可，即为1:10稀释的样品供试溶液；7.5取β-G试剂1支，开启；7.6取β-G试剂复溶液1支，开启后用移液器取0.25 ml加入β-G试剂中，轻轻摇匀，澄清后得试剂溶液备用；7.7打开检测软件连接LKM动态试管检测仪，进入临床检查采集数据界面，点击“开始”按钮，使检测软件进入待采集状态；7.8取本试剂盒所配的专用反应试管，先取已制备好的样品供试溶液100 μl加入反应试管中，然后加入50 μl试剂溶液，每个样品供试品溶液平行两管；7.9加样完毕，依次拿起试管在旋涡混合器上轻点一下，使试管中的溶液均匀混合，然后把各试管逐一插到LKM动态试管仪中，反应开始，37℃反应75分钟，在反应结束前填写试验相关的信息；7.10反应完毕，检测软件将自动处理数据，计算出样品供试溶液中的（1-3）-β-G葡聚糖测量值，进入“临床检查数据报告”可查看检验结果，进入“临床检查数据分析”可查看反应曲线。
G试验与GM试验的区别
G试验与GM试验的区别G试验概念：G试验是检测1，3-β-D-葡聚糖的试验，采用的方法是动态显色法。
1，3-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁的一种成分，广泛存在与各种真菌，只有当真菌进入体内被吞噬细胞吞噬，细胞壁被感染，对于念珠菌血症而言，G试验检测是首选检查方法。
G试验检测一般先于临床症状平均4天，平均早于发热5天，是早期检测的重要手段。
G试验检测值<70 pg/ml定义为阴性，此时不建议抗真菌治疗，当检测值在70-95 pg/ml时定义为灰区，此为观察期，应连续监测，当检测值>95 pg/ml定义为阳性，建议结合临床症状诊断治疗。
GM试验概念：GM试验是检测半乳甘露聚糖抗原的试验，采用的方法是酶免法。
半乳甘露聚糖（GM）是曲霉细胞壁的一种成分，GM从薄弱的菌丝顶端释放，曲霉菌感染的患者血液内存在GM，曲霉菌不入血，主要是侵袭血管壁，沿血管壁进行侵袭，进入血液。
GM试验是曲霉菌病早期诊断的筛查指标。
GM常于临床症状前5-8天和影像学出现异常之前7.2天出现。
GM释放量与菌量呈正比，可以反映感染的程度，若两次检测阳性即可以诊断侵袭性曲霉菌感染，GM试验也可作为疗效判断的重要指标。
GM实验检测值<0.65 ug/l定义为阴性，此时不建议抗真菌治疗。
当检测值在0.65-0.85 ug/l时定义为灰区，此为观察期，应连续监测，当检测值>0.85 ug/l时定义为阳性，建议结合临床症状诊断治疗。
G试验和GM试验的区别及其临床意义1,3-β-D葡聚糖检测（简称G试验）半乳糖甘露醇聚糖抗原检测（简称GM试验）原理：G：1,3-β-D葡聚糖可特异性激活鳌变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固。
GM：是一种微孔板双抗体夹心法。
采用小鼠单克隆抗体EBA-2，检测人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。
半乳甘露聚糖是一种对热稳定的水溶性的物质，是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类多糖。
诊断：G：侵袭性真菌感染。
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
注：＊原发性者可无宿主因素，△肺组织、胸液、血液真菌培养阳性（除外肺孢子菌）
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（1,3） - β- D-葡聚糖检测
16
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 b1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶 14位还原和7－8位异构酶 17 角鲨烯环氧化酶
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小结
1,3-β-D-葡聚糖是侵袭性真菌感染早期 诊断、疗效观察、预后评估有价值的实 验诊断。 1,3-β-D-葡聚糖检验其敏感性优于GM 侵袭性真菌感染的诊断与治疗是一个复 杂过程，实验室与临床应密切联系，为 临床医生提供诸如显微镜检查、真菌培 养、血清学标志物等多方面信息。
31
内毒素定量检测
23
1,3-β-D-葡聚糖检测临床价值
早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无 特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死 亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早 期诊断。 指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有 针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗 效高，价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚 糖浓度变化，评价选用药物的有效性。 监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察：易感人群，监测临床疗效。
危重病人的存活期延长
延长了真菌感染 的 高 危 期
使此类患者业已增加 的人数进一步扩大
严重真菌感染迅速上升势头
是日益严重的威胁！
5
真菌感染的危险因素：
中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间
6
感染之前定殖
侵袭性真菌感染
条件致病性真菌
真菌（1-3）-β-D-葡聚糖 与革兰氏阴性菌脂多糖检测
器械部 广东金羽医药发展有限公司
1
鲎
20世纪六十年代，人们 发现一种古老的海洋生物， 被称为“海洋活化石”的 鲎，它的血液与内毒素接 触后会发生特异性的凝集 反应，人们经过大量研究 和实验从它的血液中提取 出了用来检测内毒素的 “鲎试剂”。
2
内毒素的理化性质
耐热性：彻底灭活需250高温干烤一小时 可滤过性：能够穿透滤过膜 水溶性：LPS的O-特异性Ag呈亲水性 被吸附性：可被活性碳所吸附 易被强酸、强碱和强氧化剂破坏 不挥发性：加热时，不随水蒸气挥发
38
39
人体内毒素的来源
开放性创伤 烧伤 注射药品 及溶液 外 骨折
26 Carmen Pazos, Jose Ponton, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005
例2
儿童1,3-β-D-葡聚糖水平研究
120名儿童 7月—8岁 1,3-β-D-葡聚糖定量检测结果： 中位数 32 pg/ml 平均值 68±128 pg/ml
9
镜检和培养方法
敏感性低
血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检 证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。
培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区 分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难
10
非培养方法优点
快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检 测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效 评估
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临床医生关注的问题
检测的临床意义； 如何正确理解这些临床意义； 与微生物培养以及PCT的对比关系； BET的适应症和分段区间解释； BET测得值的影响因素有哪些？
34
前言
1892年,科学家Richard在研 究霍乱弧菌的时候,发现革兰 阴性菌细胞壁外膜中有一种 不溶性成分,它能够引起人体 发热、休克、器官损害等病 理表现，因其毒性效应和性 质与外毒素有显著差异，就 用内毒素这一术语来描述该 物质。随后多年对革兰阴性 菌细胞壁外膜的超微结构技 术和生物分析技术，证实内 毒素是磷脂双分子层结构。
宿主因素 临床特征 病原学
真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据）
CSF隐球菌抗原阳性——确诊 GM-test, G-test——临床诊断
Clinical Infectious Diseases 2008; 46
14
诊断IPFI的三个级别
宿主因素 确诊 临床诊断 拟诊 ＋ ＋ ＋ 临床特征 ＋ ＋ ＋ 微生物学 ＋ ＋ － 组织病理学 ＋ － －
鲎试剂的发明
1981年1月Jack Levin 和 Frederik B.Bang教 授在美国马塞诸塞州 Wools Hole海洋生物实 验室成功分离提取鲎血 细胞并研制成能够检测 细菌内毒素的鲎试剂， 开辟了人类认识和检测 内毒素的新纪元！
3
侵袭性真菌感染率上升↑
AIDS
4
医学Hale Waihona Puke 相关科学的进步19
“G”试验缘何而来？
20
检测原理（比色法）
旁路反应 β葡聚糖或LAL-RM 活化C因子 活化B因子 B因子 内毒素 C因子
G因子
活化G因子
凝固酶
凝胶法、比浊法
凝固蛋白（凝胶）
凝固酶原 显色法
凝固蛋白原
AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物） pNA（对硝基苯胺，黄色） 405nm测光度值
29 刘芳,吴彤,等. 中国实验血液学杂志 Journal of Experimental Hematology 2009
G试验对IF I诊断率的影响
•在所有162例患者中,若无G试验作为诊断标准,仅20例患者达到确诊+ 临床诊断真菌感染标准,占总病例数12.3%。 •若将G试验阳性作为微生物学标准,则有71例达确诊+临床诊断标准,占 总病例数的43.8%。 •在75例拟诊病例中,其中51例真菌培养阴性而G试验阳性的患者,均对 广谱抗生素无效而经过抗真菌治疗病情好转,经过临床回顾性分析符合 IFI,故G试验使IFI诊断率提高了31.4%。
临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养 ≥2次分离到同种真菌 2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性
13
侵袭性真菌感染的诊断标准 EORTC/MSG2008修订版
念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他
7
诊断方法
影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法：
传统的方法
Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）
8
真菌病实验室诊断主要内容
准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学
27 P.Brian Smith, Daniel K.Benjamin,Jr, etc. CLINICALAND VACCINE IMMUNOLOGY,July2007
非免疫功能低下儿童1,3-β-D-葡聚糖水平
28
例3
血浆1,3-β -D葡聚糖检测对血液病患者侵袭性 真菌感染的诊断价值
本研究收集疑为IFI的血液病患者血浆标本162例,其中化疗后患者85例,造血干细 胞移植后患者77例。 按照欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,所有病例中有 确定诊断2例,临床诊断18例,拟诊75例,排除诊断67例。 结果表明:以20 ng/m l为诊断界值,G试验的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和 阴性预测值(NPV)分别为75%、91%、72.4%和92.4%。
1,3-β -D-葡聚糖结构
糖蛋白类
葡聚糖 几丁质
麦角固醇
B1， 3葡聚糖合成酶
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁 中 1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成 分50%以上，是真菌细胞壁上 的特有成分 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄 糖残基骨架作为主链 以分支状1-6-β-D葡萄糖残 基作为侧链
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1,3-β -D-葡聚糖特性
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革兰阴性菌脂多糖（LPS）电镜下结构示 意图
O–特异性抗原
核心多糖
脂质A
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内毒素的定义和危害
内毒素（Endotoxin）是革兰阴性菌细胞壁外膜 的脂多糖（LPS）成分，是革兰阴性菌生长时释放 或死亡后裂解出来的毒性产物，其中起主要致病 作用的是非结合的游离脂多糖（FLPS）。
内毒素能够直接作用于人体，激活组织内的炎性 细胞和炎症因子，导致机体发热并产生全身性炎 症反应（SIRS），继而引起弥散性血管内凝血、 休克、多脏器功能衰竭等严重的病理生理症状， 危及生命，由于内毒素与革兰阴性菌关系密切， 所以内毒素血症在临床非常常见。 37
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AC-Ile-Glu-Ala-Arg-OH
分析前注意事项
采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8℃最多存放48h 检测环境应保持清洁
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1,3-β-D-葡聚糖相关影响因素
以下情况可出现假阳性：
使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其 他含有葡聚糖的材料； 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； 链球菌血症； 操作者处理标本时存在污染； 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食 物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也 可能造成假阳性。