流式检测细胞周期要点
流式细胞术检测细胞周期的技术流程
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细胞周期的流式检测方式技巧
细胞周期的流式检测方法细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为G0/G1期、S期、G2/M期。
在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。
细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI从而测定细胞群体的周期分布。
因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson）公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪测定PI标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。
一、PI染色步骤概略1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min，弃上清。
2、PBS 1ml离心，弃上清。
3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。
4、PBS 1ml离心，弃上清。
5、RNase A的PBS溶液(20ug/ml)，500ul，37℃，30min，离心弃上清。
6、PBS 1ml离心，弃上清。
7、PI的PBS溶液(50ug/ml)，500ul，室温避光孵育30min。
8、吹打混匀，300目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。
二、Calibur仪器设置及数据收集1、依次打开Calibur机器电源、电脑开关和CellQuest Pro软件，按快捷键Command+B连机，按快捷键Command+1、2、3、4调出Detectors/Amps面板、Threshold面板、Compensation 面板和Status面板，软件的操作界面如图1所示。
图1. Cell Quest Pro软件操作界面2、建立实验模板，包括FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图和FL2-A直方图。
因为PI 在Calibur上是由488nm的激光器激发，530/30滤光片收集信号，所以选择FL2通道进行检测。
细胞周期是2N和4N的循环，所以FL2通道的Mode参数应设置为Lin模式，同时阈值（Threshold）的Primary Param参数设置为FL2-H，Four Color DDM Param参数设置为FL2，如图2、图3所示。
流式细胞术测定细胞周期
流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。
值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。
二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。
2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。
3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。
4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。
5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。
流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程
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流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程
流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程哎呀，这可是个不简单的活儿啊！今天我们就要聊聊流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程。
话说这个方法可是科学家们研究细胞生长和分裂的重要工具呢，那咱们就好好聊聊吧！咱们得明白什么是细胞周期。
简单来说，就是细胞从一个生命周期阶段到另一个阶段的过程。
就像人一样，从出生到长大再到老去，每个阶段都有不同的特点和任务。
而细胞也是这样，它们也有自己的生命周期，从分裂开始，到分化成不同的细胞类型，再到死亡或修复损伤。
如何知道这些细胞在什么时候开始分裂、什么时候结束呢？这就需要用到流式细胞术了。
流式细胞术的原理其实很简单，就是通过激光或其他光源对细胞进行照射，然后利用特殊的摄像头捕捉不同颜色的荧光染料标记的细胞。
这些荧光染料会因为细胞内部的某些分子而发光，所以我们可以通过观察荧光的颜色和强度来判断细胞的状态和位置。
咱们就来看看流式细胞术的技术流程吧。
第一步，准备工作。
先要把待检测的细胞样本准备好，然后把它们稀释到一定浓度，这样可以让更多的地方都能看到荧光信号。
接着，要把样品放到流式细胞仪上，这里有一个小技巧：要尽量让样品均匀分布，这样才能保证检测结果的准确性哦！第二步，激光照射。
这时候要用到激光器或者其他光源对样品进行照射。
记住啊，这个过程一定要快，否则荧光信号可能会减弱或者消失。
不过不用担心，现在的流式细胞仪都设计得很聪明，能够自动调整激光功率和时间长度，以获得最佳的检测效果。
第三步，数据采集。
照射完成后，流式细胞仪就会自动记录下每个荧光信号的位置、强度和持续时间等信息。
这些数据会被传输到电脑上进行分析和处理。
别看这步骤听起来简单，实际上需要非常高的精度和速度才能做到哦！第四步，数据分析。
这一步主要是通过软件对收集到的数据进行分析和比对，找出其中的规律和异常情况。
比如说，我们可以通过观察不同细胞的荧光信号强度来判断它们的生命周期阶段；也可以通过比较不同样品之间的荧光信号差异来寻找潜在的疾病标志物等等。
整理)流式细胞检测细胞周期
流式细胞检测细胞周期一、所需试剂1、细胞周期检测试剂盒（1）PI：Propidium Iodide，碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，如果自己买，那就10mg用200mlPBS 溶解，4℃避光保存（0.05mg/ml）（2）RNAase：PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解，如果自己买，那就100mg用20mlPBS溶解，200μl分装-20℃避光保存（5mg/ml）2、预冷70%-75%酒精：可用无水乙醇和纯水配制3、预冷PBS4、流式管：可以去医研中心拿二、实验步骤<一>、细胞处理1、种板处理等同功能实验（保证细胞有2-5×10*5个）2、消化细胞，离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。
3、用预冷的PBS清洗细胞1-2次。
4、离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀5、固定细胞：用0.2ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入2ml预冷70-75%酒精，震荡，4℃固定过夜。
（直接向细胞加入酒精容易使细胞成团，震荡不要过猛，容易使细胞破碎）<二>、细胞染色和检测1、离心（1000r/300g 5min）收集固定的细胞2、2mL的预冷PBS洗细胞一次，离心再次获取细胞沉淀3、染色：加入50μlRNA酶和250μl-450μl PI染色剂（用量根据试剂盒说明书），避光染色5-10min（一般加300μl，保证适当细胞浓度，浓度太高检测速度太快，结果不准；浓度太低检测速度太慢，时间太长）4、上机检测三、注意事项1、流式细胞仪原理看ppt非荧光信号（1）前向角散射光（FSC Forward scatter）细胞相对大小及其表面积（2）侧向角散射光（SSC side scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性2、PI(碘化丙啶)不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
流式细胞仪细胞周期图详解
1
流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
②G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
③
3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA 含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA 的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
流式检测细胞周期protocol
PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。
试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。
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1.收集细胞；
～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀；
％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h；
4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）；
5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h；
目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。
1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？
A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。
我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.
2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：
Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？
A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？
A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。
Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？
A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。
Q：（5）不用试剂盒行不行啊？
A：完全可以不用试剂盒。
以下提供一个自己的实验步骤供参考：
（1）200×g离心10min收集细胞；
（2）弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上；
（3）进行流式细胞仪检测前，200×g离心10min收集固定后的细胞；
（4）PBS洗涤一次，200×g离心10min收集细胞；
（5）将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min；
（6）将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。
3、Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？
A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为R NA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。
不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。
至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。
上流式前细胞用75％乙醇固定行吗？
4、Q：我养肿瘤细胞，测周期。
看到帖子说70％乙醇必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有帖子说PBS和乙醇配会出现絮状物。
上流式前细胞用75％乙醇固定，就用买来的现成的瓶装75％乙醇，行吗？必须那么严格吗？
A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。
之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。
不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。
乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5、Q：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。
这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？
A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：
（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机
（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿
（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。
6、Q：流式细胞PI单染中为什么用RNAse？
A：在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI很容易透过细胞膜和DNA结合，但RNA也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用RNAse降解RNA。
这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。
7、最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期，发现有几个问题：
Q：（1）我所用的是肿瘤细胞，但是同样的细胞类型，同样的处理因素，虽然两次独立实验作出来的结果总体趋势都是在某种药物干预后，S期比例下降，但两次结果S期比列具体数值相差很大，同样，G 2/M期在干预前后无变化，但两次独立实验数值却相差很大，那么可以说，做流式是每次细胞状态不一样，结果也会相差很大，是不是细胞密度会对结果产生很大影响，那么如果细胞密度在60-70%时和细胞已经长满（90%以上）也会导致各期数值的差异？如果是这样，长满的细胞（不再增殖）是表现的G1或S或G2/M 上升还是下降？
A：应该是两批细胞在实验时本身所出周期不同所致，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。
实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。
自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。
Q：（2）其次就是结果分析，细胞周期特异性药物如抗代谢药作用后主要表现的是S期比例下降，细胞被阻滞在G1期，自然G1期比列升高。
而有些植物药如长春碱类或紫杉醇类，主要作用于M期，那么结果是否表现为G2期比例升高，还是S期也相应升高？还有就是细胞经抗肿瘤药物作用后反而出现的S期升高，可能是那些原因，如何分析？
A：周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其它阶段细胞增多。
8、Q：我用流式做胃癌细胞周期分析时不出现S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能为PI没染上色，是不是染色时间太短呢？
A：你用了多少PI染色多久呢？一般来说30分钟够了.我觉得可能是打孔或者rna没有处理掉没有成功，染色时间并不是关键。
9、Q：做流式细胞时，PI 染色，PI的浓度应该是多少?还有就是400目的筛网是什么？不用可以吗？谢谢。
A：100ug/ml，一般用400目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也可以gate掉的。
如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色
10、Q：流式细胞仪观察细胞周期样品怎样准备？
A：给你介绍一下我的实验方法，我做的是周期检测，要做平行样，六孔板做的。
（1）收集先弃液，将你要实验（你已经处理好的）的细胞PBS洗两次，加胰酶消化（注意：如果要是加药物或者其他处理过的细胞，弃液和PBS洗液均收集）；
（2）加培养基终止消化，打匀在分别收到各自离心管中（注意，收集过程中及后续过程中枪头不要混用，要不平行样也就没意思了）；
（3）离心，1000rpm，5min弃液；
（4）4度PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液；
（5）加入负20度70%酒精（1到2ml）打匀，固定，至少半个小时以上，（不做的话，可放入4度冰箱保存2-3周问题不大）；
（6）离心，1000rpm，5min弃酒精；
（7）4度PBS（1到2ml）洗，离心1000rpm，5min弃液；
（8）4度PBS（1到2ml）洗，打匀后，将细胞悬液用100 目的纱布直接过滤到流式检测管中；
（9）离心，1000rpm，5min弃液；
（10）加PI染液染色（浓度为50ug/ml），，PI ，Rnase ，（Triton-X-100 ，枸橼酸钠50mg，这两我没加也效果不错）加PBS至50ml，4度避光保存数月。
106细胞中加入1ml PI染液，振荡器振匀，避光染色至少30 min，上机检测；
（11）统计分析。