疟原虫血片制作方法共27页
疟疾血片制作
薄 血 膜 制 作
▲将推玻片向1的方向稍抽回，当 血液充满推玻片适当宽度（约 2cm）后，以一定均匀的速度 向2的方向滑动（约2.5cm）。
制作薄血膜：
制作薄血膜：
◆血涂片质量评价： 血膜均匀、厚薄度合适、无空泡、无划痕
薄血膜头体尾位置和形状好、无停顿起伏、 两侧留出空间
注意： 血滴大，速度快、角度大 血滴小，速度慢、角度小
血片的制作续…
2、采血时间：症状发作后数 小时至10小时之内。
3、采血部位消毒：用沾有碘 酒的棉棒在患者手指末端、 耳垂、拇趾或足跟（婴幼 儿）从内向外画同心圆。
4、采血：将采血针迅速刺入 取血部位1~2mm深，用大 拇指、食指协同挤出血滴。 第一滴血因含有酒精，用 棉签擦去。再挤出第二滴 血用于制作血片。
二、血片染色
▲血片染色在血片的制作过程中是 一个重要的环节，染色质量的好坏， 直接影响到疟原虫的检出率，也是 直接影响疟疾病例确诊与否的关键。
▲ 疟疾血片的染色有瑞氏染液和吉 氏染液两种，我们现在重点介绍吉 姆萨染液染色法。
血片染色续…
▲ 染液为省寄生虫病防治所统一配制的吉
姆萨染液；为方便开展工作，经省寄生虫 病防治所反复试验，缓冲液选择市面上供 应的娃哈哈矿泉水为佳（在条件允许时配 制pH7.0~7.2的缓冲液为最佳选择）。 ■注：珠海贝索生物技术有限公司生产的 Baso姬姆萨染液：
疟疾血片制作
临沧市疾病预防控制中心
史爱军 2016年3月
主要内容
■血片的制作 ■血片的染色 ■影响血片制作质量的因素及
注意事项
◆重点应掌握的要点：
▲疟疾血片厚、薄血膜的制作要领。 ▲疟疾血片制作注意事项。
▲掌握血片制作技巧、反复练习。
疟原虫血片制作
疟原虫血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。
2 .染色材料：①姬氏原液②.蒸储水或纯净水：①稀释姬氏原液②染色时冲洗染液③固定剂：①用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%）,固定薄血膜②用无水乙醇擦洗油镜头。
④脱油剂：无水乙醍或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。
油镜头脱油可用无水乙醍：无水乙醇的7:3混合液擦拭。
⑤擦镜纸。
二、采血前准备：1.玻片准备⑴我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。
⑵新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。
⑶已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好2.玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。
玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。
3.采血时间：⑴间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。
所以在发作后的6〜8小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。
⑵。
恶性疟原虫；从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此,较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。
环状体的数量和构造。
有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作7〜10日后才能在末梢血液在由现，应当注意。
4.采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。
疟原虫镜检血片的制作与染色课件
厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱 落，过薄达不到检出率的要求。
4.推制薄血膜
用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘 平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间 向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25~35° 角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，厚度 应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。
吉姆萨（Giemsa）染液由天青、伊红组成。染料中天青是 碱性的,伊红是酸性的。染色的原理是基于在酸性染料中具 有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合，而碱性染 料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合，所以酸性的细胞 成分被碱性染料所染色，而碱性的细胞组分则被酸性染料染 色。
嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色， 称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与 碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中 性颗粒呈等电状态与伊红和天青均可结合，染淡紫色，称为 中性物质。
(2) 采血针：使用一次性釆血针。
(3) 玻片盒：
(4) 75％乙醇棉球：用于采血前后的消毒。
(5) 标签记号笔：用于玻片上书写号码。
2. 采血部位及取血方法 采血部位以耳垂较为 合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或 足跟取血。先用75％乙醇棉球消毒取血部位后， 以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深， 然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出 血滴。
2. 染色用水
常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中 性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、 河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好，应用 pH7.0～7.2水效果最佳。
可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。 配制pH6.6~7.4缓冲液时，先制备好两种贮备液。 贮备液Ⅰ为每1 000ml蒸馏水含9.5g 磷酸氢二钠， 贮备液Ⅱ为每1 000ml蒸馏水含9.07g 磷酸二氢钾。 配制pH6.6~7.4的缓冲液时，将两种贮备液按一定 比例混合后，用蒸馏水稀释成各种浓度的溶液。
疟原虫的制片技术
位 置： 玻片左半部分或第4格前缘到第6格中部。 外 观： 舌状，厚薄均匀，无划痕。在玻片上形成
平铺的红细胞，红细胞之间互相接触而不相互重叠。
注 意： 推制时速度要均匀。血滴大小、推片与载
玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等会影响血 膜的厚薄。
正确的推片姿势
标准的疟原虫血片
制片注意事项
疟大滋养体和裂殖体。
注 意：（1）用抗疟药之前取血（用药后镜检结果
往往是阴性）；（2）取血后应尽快制片（血细胞和 疟原虫的形态保存完好）。
血膜的种类
用于检查疟原虫的血膜用两种： 一种是将血液涂成薄膜状，称为薄血膜； 一种是将血液涂成圆盘状，称为厚血膜。
要求：一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜！！
血膜的位置
管等
记号笔：写标签 水、纸巾：用于清洗、拭干推片
样本要求
末梢全血：指尖、耳垂末梢全血，婴幼儿可取拇趾
或足跟部全血。现场取血现场制片。
静脉全血：采用抗凝管采血。最好取血后立即制片，
如果血液放置时间过长会影响镜下形态。冷冻后的血 液不能用于制片。
骨 髓：临床上可用于确诊恶性疟感染，可查到恶性
影响染色效果的因素
血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染色 技术等有关外，还受到以下因素的影响： （1）染液稀释后使用）血片制作 （二）染 色
容
所需设备
载玻片：清洁无油污，以免血膜受污染或脱落 推 片：边缘光滑，用完后及时清洗，以免影响下次使
用
微量采血吸管：20ul，取血时可供参考 胶 头：与微量采血吸管配套，注意不要吸进血液 取血所用的设备：75%酒精棉球、一次性采血针、抗凝
注 意：（1）固定薄血膜时甲醇一定不要碰到
疟原虫血片制作及染色
血膜染色 （二）染色的原理
染色化学反应反应的示意图：
疟原虫细胞浆的阴离子（COO—）＋ 美蓝阳离子—→呈蓝色
┏天青（染媒作用） 疟原虫核的阳离子（NH3+）＋┫
┗伊红阴离子
－→ 呈紫红色
血膜染色 （二）染色的原理
蛋白质本身是阴阳电荷是相等，带有两基性的。所 以其所带阴阳电荷的数量可受周围液体的酸碱度（ PH）而改变，在偏酸的溶液中阳离子增加，易于伊 红结合，着色偏红。在偏碱的溶液中阴离子增加， 易于美蓝结合，着色偏蓝。这就说明了为何配制染 液的酸碱度直接影响了血片染色的质量，偏酸着色 过红，偏碱着色过蓝。所以在染血片时稀释液要控 制在PH7.2，最为适宜，疟原虫的结构才能清晰可见 。
血膜制作（工具准备）
一次性采血针、75%酒精、棉棒（球）,载玻片， 推片，记号笔或铅笔。
血膜制作（取血操作）
取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头， 通常在耳垂取血。先用75%酒精棉球消毒 取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后 再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方，右手持消毒采血针（ 一人一针，避免血传疾病）迅速刺入耳垂 下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻向上挤压出血。
成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸， 倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水 98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分 钟，然后用清水注入染缸将染液通过溢出方式洗去， 再用清水浸洗1-2次，干净后将血片标本（血膜面朝 下）插于晾干板上，待干后镜检。
单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用中 性蒸馏水（或娃哈哈矿泉水）1ml，加吉氏 母液1~2滴，混合均匀后滴入血片标本上， 染色10~20分钟，然后用清水轻轻将片上的 染液冲洗干净，晾干镜检。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术1）薄血膜（thin blood film）制作方法（1）采血：临床上取病人耳垂或指尖血（2）操作方法：取病人末梢血1滴，置载玻片的中部，使推片和玻片保持30～40度夹角，将血滴在推片边缘展开后，匀速向前推动，即形成舌状血膜。
2）厚血膜（thick blood film）制作方法（1）采血同薄血膜法（2）操作方法：厚血膜可置于薄血膜的另一端。
取病人末梢血2-3滴，自里向外顺着一个方向徐成直径约1cm大小，厚薄均匀的血膜。
厚、薄血膜间用蜡笔画线分开。
充分晾干后，滴加蒸馏水于厚血膜上溶血，将水倾去，晾干后与薄血膜一起染色。
3）固定、染色（1）瑞氏染色：先用蜡笔在血膜两端划上线，以防染液外溢。
瑞氏染液为甲醇溶液，血膜不需预固定、此染色法快速，适于临床检验，但较易褪色，保存时间不长。
滴加瑞氏染液数滴，使之覆盖血膜，约1～2min后血膜被染液中的甲醇固定，再加与染液等量的缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使染液与稀释液混匀，3～5min后用缓冲液或自来水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。
4）注意事项(1）玻片要洁净，无油脂。
血量适中，推速均匀，以防血膜过厚、过薄或出现条状横纹。
血片在干燥过程中，避免灰尘或苍蝇脱吸。
(2）厚薄皿膜制备在一张载玻片时，应注意在厚血膜溶血前必须先用甲醇固定薄血膜，以避免接触水而使薄血膜上的红细胞溶解。
厚血膜溶血时间不可太长，不要振荡，以防血膜脱落。
(3）染液是甲醇溶液，切忌混入水滴，否则发生沉淀，妨碍染色，故染液发现有沉淀时不可再用。
(4）滴加染料切忌太多，否则染料残渣粘在血膜上无法洗净，影响检查。
加水后必须与染料充分混合，否则发生染色不均。
冲洗血膜时应流水直接将染液冲去，避免染料粘着血膜。
2013.4.15疟原虫血片制作染色
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
注意：蛋白质是二性电解质，当其处于较等电点为酸的溶液中时， 便呈碱的作用，即与酸或阴离子结合，这就说明为何在染液偏 酸时，伊红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫 的胞浆着色不显著；反之，蛋白质在偏碱的溶液中呈酸的作用 而中和碱基，也就说明为何染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细 胞的颗粒等被染成紫兰色。
2014-6-27 12
制作血膜的注意事项
3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤， 干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可 能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过 72小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血， 染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先 用甲醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水或自 来水对厚血膜溶血，晾干后包好置干燥器于冰 箱内保存，用时将干燥器置室温中1~2小时后 取出染色。
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染色原理：伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性 水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离 解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸 性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、 嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的 沉淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰 离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的 胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合 染成兰色。
2014-6-27
7
薄血膜血量及涂片法
薄血膜 取洁净的载玻片2张， 1 张平置在桌上，以左手拇 指，食指夹持载玻片两端 （手指切勿接触玻片表面）， 用另一张边缘平滑（最好为 磨口边缘）的载玻片做推片， 用推片一端边缘的中点从取 血部分刮取约1~1.5微升的 血量（相当于 1/4火柴头大 小），使血滴与平置的载玻 片接触，并形成 25~35 度 夹角，待血液向两侧扩展约 2 厘米宽度时，均匀而迅速 地轻轻向左推出（约 2.5 厘 米长）且边缘带有“舌状” 的薄血膜。
疟原虫血片制作方法
第2页
血膜制作（取血操作）
取血方法 采血部位普通人为耳垂, 指头, 通常在耳垂取血（现场取血提议用大头针 采血, 一人一针, 防止血传疾病）。先用 75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手 捻动耳垂使其充血后再行消毒）, 待酒精 干后, 用左手拇指和食指紧捏耳垂上方, 右 手持消毒针快速刺入耳垂下端1~2毫米, 不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向 挤压出血。
疟原虫血片制作方法
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影响染色效果原因
（7）染色后不要直接将染液倒掉, 应沿玻 片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出, 并轻轻冲洗, 以免染液色素颗粒沾污血膜。
疟原虫血片制作方法
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显微镜普通结构
1.镜座
9.粗调整器
2.镜柱
10.细调整器
3.镜臂
11.齿板
4.倾斜度关节 12.镜台
5.镜筒
疟原虫血片制作方法
第22页
影响染色效果原因
（6）染色用水 染液稀释用水和染色后冲洗用水 应选择Ph7.0~7.2清洁水, 通常使用新鲜蒸馏水 或过滤冷开水, 以及自来水、井水、河水、泉水和 雨水等。假如偏酸或偏碱, 可用缓冲蒸馏水调整。 染色后发觉血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸） 时, 可用与之相反酸、碱度水冲洗血片给予纠正。
疟原虫血片制作方法
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血片染色 （一）染液种类及染色原理
染色原理: 伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性 水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离 解为带阳电和阴电离子。伊红主要离解为酸性 阳离子，在碰到碱性蛋白质如血红蛋白、嗜伊 红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水沈淀物 染成红色。美兰主要离解为碱性美兰离子，美 兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞胞浆、嗜碱 性白细胞颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。