Sanger双脱氧链终止法课件
DNA及测序ppt课件
如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核 苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4组 独 立 的 DNA合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4种 不 同 的 ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
5´
G A C T G A A G C T G T T
5´
C
T
G
A
C
T
T
C 读出待测 G
序列
A C
A
A
3´
（二）化学裂解法测序原理
用化学试剂处理末端放射性标记的 DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此 产生的一组具有不同长度的DNA链的反应 混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自 显影之后，便可根据x光底片上所显示的 相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷 酸序列。
一、传统测序方法
（一）双脱氧链终止法(Sanger法) （二）化学裂解法（Maxam-Gilbert）
（一）双脱氧链终止法测序原理
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸 （2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖 的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷 酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷 酸链的延伸终止。
如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP， 则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列 长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中， 分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将 分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸 链进行高分辨变性聚CGGTAGCAACT 5´ 引物 5´ GG 3´
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因序列拼接和分析PPT课件
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9
制得的四组混合 物全部平行地点加在 变性聚丙烯酸受凝胶 电泳板上进行电泳， 每组制品中的各个组 分将按其链长的不同 得到分离，从而制得 相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即 可直接读得DNA的碱 基序列。
分子生物学实验
双脱氧末端终止法测序的原理、 过程和目标基因序列的分析
教 师：程 琳 2011 年 11 月
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实验目的
1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原 理，掌握DNA测序的基本方法；
2、学会序列查询、核酸及蛋白质技术主要有两种方法，都是 在20世纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸 链来读取待测DNA分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产 生切口，用同位素标记进行测序。
5
6
2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上
述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷 三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然 后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机 地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的 DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继 续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A 就终止了。
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双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件
测序的原理
主讲：氧气yun
.
Frederick Sanger .
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基
ddNTP——双脱氧 核苷酸
.
基本原理：
DNA复制 ddNTP的结构 聚丙烯酰胺凝胶
电泳
.
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶
.
.
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影 5. 阅读测序结果
.
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA
单链DNA
火加加 热入 ，引 退物 ，
带引物的模板单链DNA
.
链延伸---终止反应
苷双 脱 氧 鸟
核素标记的dNTP
分成四管
腺双 苷双 苷双 苷脱 脱 脱
氧 氧氧 胸胞
EDTA
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
.
聚丙烯酰胺凝胶电 泳
95℃加热 变性
冰上冷却
点样 开始电泳
电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
.
放射自显影
固定凝胶 真空抽干
放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
.
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
双脱氧终止法的原理(一)
双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。
它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。
•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。
2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。
这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。
dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。
•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。
反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。
•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。
DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。
•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。
•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。
碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。
电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。
•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。
•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。
3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。
•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。
Sanger双脱氧链终止法课件
——DNA测序的基本方法
Sanger双脱氧链终止法
基本原理：
核苷酸的连接方式：磷酸二酯键
将2’ ，3’ –双脱 氧核苷酸（ddNTP） 参入到新合成的 DNA链中，由于参 入的ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与 下一位核苷酸反应 形成磷酸二酯键， DNA合成反应将中 止。
其耐热性极强, 在 95 ℃ 40 min, 仍具有 很强的聚合活性; 利用重组酶在常规PCR 条件下, 成功扩增了5.3 kb的拟南芥Timeless 基因片段.
Sanger双脱氧链终止法
关于引物：
Sanger双脱氧链终止法
可以购买通用 引物或实验室 合成15bp ～ 26bp长度的引 物，通常以 2μg/ml的浓度 贮存于-20℃ 备用。
Sanger双脱氧链终止法 Nhomakorabea假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个 碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生 一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列 GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP 掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延 伸, 产生GATCCGAT.
Sanger双脱氧链终止法
dATP与ddATP的区别：
dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸，生物用dNTP 来合成DNA 。 ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，核糖2号3 号C上羟基的O被脱去，由于它掺入DNA后DNA 的合成就终止了，所以ddNTP是用来测序的。
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法
DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法一、测序原理Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法（chain termination method），又称酶法或Sanger法。
其原理是利用DNA聚合酶，以单链或双链DNA为模板，以dNTP为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记（或引物末端核素标记），在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成4组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA的互补序列（图-1）。
DNA聚合酶能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′-磷酸二酯键。
通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA 从5′→3′不断延伸。
ddNTP比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，便发生了特异性的链终止效应。
在4组独立的反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP/ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于模板DNA上的每个可能掺入ddNTP的位置都有可能发生终止，结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置的一系列长度的寡核苷酸链。
在这种测序方式中，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由退火引物所决定的5′端和终止于某一ddNTP的不定的3′端，延伸产物片段长度相差仅一个碱基。
通过高分辨率测序凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出待测DNA的互补链的核苷酸顺序（图-2）。
二、测序体系（一）待测模板单链DNA与双链DNA均可作为Sanger法测序的模板。
1.单链DNA模板按照经典的测序反应，一般是将靶DNA片段克隆于M13mp载体中，从而得到单链的DNA模板进行测序。
DNA聚合酶Klenow片段3Sanger双脱氧链终止法基本
How DNA Sequence Is Determined?
DNA fragments having a difference of one nucleotide can be separated on gel electrophoresis
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
32P
ATCGATCGAT
32P
ATCGATCGA
基本技术流程（The basic technical process）
PCR
PCR扩
电泳
测序
增
分离
反应
放射 自显影
单链DNA
碱变性DNA
3.Sanger双脱氧链终止法基本方法
（Basic method of Sanger Dideoxy chain termination method）
（1）准备DNA模板 单链DNA和碱变性的双链DNA。
DNA多态性
在基因组DNA中，不同 碱基结构的等位基因所形 成的多态性称为DNA多 态性。
DNA长度 多态性
差异表现在 DNA片断长
度上
DNA序列 多态性
差异表现在 DNA碱基
序列上
第六章 DNA序列多态性
第一节DNA序列测定及多态性分析 第二节等位基因特异性探针杂交技术 第三节限制性片段长度多态性 第四节MVR-PCR序列多态性
一.双脱氧核苷酸链终止法（Sanger ）
1.原理（Principle ）
在DNA合成时，在PCR反应体系中加入双脱氧核苷 三 磷酸(2′, 3′- ddNTP),它与dNTP竞争掺入到新生的 DNA链上， ddNTP使链终止。
一.双脱氧核苷酸链终止法（Sanger ）
1.原理： 设置A、C、G、T 4种PCR反应体系，在4种反应体 系
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析PPT共48页
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
双脱氧末端终止测序法原理 过程和目 标基因cDNA序列拼接和分析
51、山气日夕佳，飞鸟相与还。 52、木欣欣以向荣，泉涓涓而始流。
53、富贵非吾愿，帝乡不可期。 54、雄发指危冠，猛气冲长缨。 55、土地平旷，屋舍俨然，有良田美 池桑竹 之属， 阡陌交 通，鸡 犬相闻 。
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Sanger双脱氧链终止法
Sanger双脱氧链终止法
假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个 碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生 一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列 GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP 掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延 伸, 产生GATCCGAT.
Sanger双脱氧链终止法
通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，纯单链DNA模板， 带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、 dGTP、dTTP和dCTP）， ddNTP 。
Sanger双脱氧链终止法
所需模板及其获得方法：
单链DNA可以由双链DNA完全变性而得到。 其方法，简单的来说， 将反应体系加热至95℃即可得到。
Sanger双脱氧链终止法
——DNA测序的基本方法
Sanger双脱氧链终止法
基本原理：
核苷酸的连接方式：磷酸二酯键
将2’ ，3’ –双脱 氧核苷酸（ddNTP） 参入到新合成的 DNA链中，由于参 入的ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与 下一位核苷酸反应 形成磷酸二酯键， DNA合成反应将中 止。
其耐热性极强, 在 95 ℃ 40 min, 仍具有 很强的聚合活性; 利用重组酶在常规PCR 条件下, 成功扩增了5.3 kb的拟南芥Timeless 基因片段.
Sanger双脱氧链终止法
关于引物：
Sanger双脱氧链终止法
可以购买通用 引物或实验室 合成15bp ～ 26bp长度的引 物，通常以 2μg/ml的浓度 贮存于-20℃ 备用。
1 产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。
将得到如下结果： 2 产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC
3 产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG
4 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT Sanger双脱氧链终止法
制得的四组混合物全 部平行地点加在变性 聚丙烯酸受凝胶电泳 板上进行电泳，每组 制品中的各个组分将 按其链长的不同得到 分离，从而制得相应 的放射性自显影图谱。 从所得图谱即可直接 读得DNA的碱基序列。
Sanger双脱氧链终止法
dATP与ddATP的区别：
dATP为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸，生物用dNTP 来合成DNA 。 ddATP为三磷酸腺嘌呤双脱氧核苷酸，核糖2号3 号C上羟基的O被脱去，由于它掺入DNA后DNA 的合成就终止了，所以ddNTP是用来测序的。
Sanger双脱氧链终止法
DNA聚合酶的特点：
Sanger双脱氧链终止法的具体操作：
测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分 别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸 (称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP), 然后进行 聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代 替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA 链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反பைடு நூலகம்中所产生的DNA链都是到A就终止 了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反 应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就 可以读出序列了.