高中生物线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察【实验目的】掌握一 ...

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线粒体和液泡系的超活染色与观察(“观察”文档)共7张

观察动、植物活细胞内线粒体、液ห้องสมุดไป่ตู้系的形态、数量与分布；
(燥2)，实必验要者时用(可2牙再)签加用宽滴头双染在液自面)，己刀盖口上腔片盖颊玻把粘片膜初，处用稍生吸用的水力纸刮小吸取去麦上四皮或周细溢胞黄出，豆的将染刮幼液下，的苗置粘根显液微状尖镜物下(放约观入察1载。~玻2片c的m染液长滴)中小，染心色切10~一l5m纵in(注切意面不可，使染液干 (器3)材吸：去显染微液镜，、滴恒放一温滴入水R浴i载n锅ge、玻r液剪，片刀盖、中上镊盖内子玻、片的双，面1并刀/用片3镊、0子载0轻玻0轻片中地、下性盖压玻红盖片玻染、片表，液面使皿滴根、尖中吸压管，扁、，牙染利签于色、观吸5察水~。纸1。0min。观人察口动腔、粘植膜(物上3活皮) 细细吸胞胞去内线线粒染粒体体的液、超，液活泡染滴系色的与一形观滴态察、R数in量g与e分r布液；，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻观(2)察实动验、者植用物牙活签细片宽胞头，内在线使自粒己体根口、腔尖液颊泡压粘系膜扁的处形稍，态用、利力数刮于量取与观上分皮察布细；胞。，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10~l5min(注意不可使染液干燥(2)，用必双要面时刀(可4片再)把加进初滴生行染的液镜小)，麦检盖或。上黄盖豆玻幼片苗，根用尖吸(约水1纸~2吸cm去长四)小周心溢切出一的纵染切液面，，置放显入微载镜玻下片观中察内。的1/3000中性红染液滴中，染色5~10min。
观察动、植物活细置胞显内线微粒体镜、下液泡观系察的形。态、数量与分布；
线粒体和液泡系的超活染色与观察
人人口口腔腔粘粘膜膜(上上3皮皮) 细细在胞胞低线线倍粒粒体体镜的的下超超活活，染染选色色与与择观观平察察展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。

线粒体的活体染色

实验四线粒体的活体染色实验目的：1.掌握线粒体的活体染色原理及方法。

2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞法处死兔子的方法。

3.了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。

实验原理：线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。

细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。

活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。

詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。

线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

不同细胞中线粒体的形态和数目不同。

在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。

线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。

线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。

一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。

脊的横切面呈囊状或管状。

脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。

实验用品：一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。

二、器材和仪器普通光学显微镜、手术器材一套、解剖盘、腊盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、20ml注射器、吸管。

三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、0.9%Ringer氏液(哺乳类用)。

实验内容和方法：一、兔肝细胞线粒体的活体染色（一）方法1.用空气栓塞法处死兔子（见图4-1），置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（约2～3mm3大小）。

2.放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，再用吸管吸去Ringer 氏液。

3.在平皿内滴加1／300詹纳斯绿B（Janus green B）染液，，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。

当组织块边缘染成蓝色时即可，一般需要染色30分钟。

mitochondria

微粒体游离核糖体多核糖体细胞质
内含物异体吞噬泡自体吞噬泡分泌自噬泡
细胞氧化质子动力势氧化磷酸化基粒
电子传递链（呼吸链）
1.何谓内膜，内膜的存在对细胞有什么意义？ 2.内质网和高尔基体都可对蛋白质进行加工，试
比较两者所进行的加工有何不同？ 3.细胞质中有哪些有形成分？ 4.核糖体在蛋白质的合成过程中起到了哪些作
（化学梯度、膜电位）
质子动力势的作用
电子传递链
化学渗透偶联磷酸化作用 return
ATP合成
结合－改变机制（binding-change mechanism）
三种构象的循环改变；O(open) L(low) T(tight)
氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）
第七节线粒体
（mitochondrion）
线粒体是真核细胞进行氧化和能量转换的主要场所，被喻为细胞的“动力工厂”或“换能中心”。
一、线粒体的形态特性
显微结构：线状，颗粒状
亚显微结构：两层单位膜构成的膜囊结构
（一）、外膜(porin,孔蛋白) 外腔（膜间腔）
（二）、内膜（通透性很低，多种转运蛋白）嵴（cristae）基粒（elementary particle）
氧化过程
物质氧化高能电子氧 energy
质子动力势
energy
ADP+Pi
ATP
磷酸化过程
将生物氧化所释放能量的转移过程与ADP的磷酸化过程结合起来，而将生物氧化释放的能量转移到 ATP的高能磷酸键中，又称氧化磷酸化偶联。
2e-
1/2O2
H2O
to
glucose
（二）线粒体与细胞凋亡(apoptosis)

线粒体遗传病

2、线粒体脑肌病
3、线粒体心肌病
4、帕金森病
5、其他病变
线粒体疾病的遗传规律和特点
1、母系遗传（maternal inheritance）
2、阈值效应（threshold effects）
突变型DNA达到一定数量（阈值）才足以引起细胞的功能障碍，这种现象称为阈值效应。
3、表型的高度多态（polymorphism）
在一个家系中，患病个体的表现可以完全不同；有的以血管病变为主，如中风、冠心病等；有的表现为不同程度的肌无力；有的以精神症状为主；有的以眼科疾病为突出表现。发病的年龄差异也很大。
小
结
一、掌握线粒体遗传病的概念和特点二、了解线粒体基因组的特点
三、了解线粒体病遗传规律
线粒体遗传病
（mitochondrial diseases）
线粒体电镜图
mtDNA
第一节人类线粒体基因组
• 含义：
线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）是独立于细胞核染色体外的又一基因组，称为25号染色体。非孟德尔遗传方式。
特点
1、裸露环形双链，H链和L链 2、分为编码区和非编码区，无内含子，基因之间间隔极短或无间隔。 3、非孟德尔遗传，又称核外遗传 4、分子量小，进化速度快，细胞中含量丰富。
5、半自主性。（M染色体，25号染色体）
mtDNA能独立复制、转录和翻译。但受核DNA影响（线粒体内大部分功能和结构蛋白依赖于核 DNA）。 6、两条链都有编码功能，部分遗传密码与核不同
7、突变率极高（比核基因大10-20 线粒体病
• 定义：
指由于mtDNA的突变所导致的遗传病。
• 分类
一、生化分类：底物转运缺陷、底物利用缺陷、 Krebs循环缺陷、电子传到缺陷和氧化磷酸化偶联缺陷5种类型二、遗传分类：nDNA缺陷、mtDNA缺陷、nDNA和mtDNA 联合缺陷

实验三线粒体活体染色

油镜下小鼠骨髓细胞染色体
油镜下观察
染色体标本观察
线粒体活体染色
线粒体活体染色
线粒体电镜观察
A
C
M
C
N
M
线粒体电镜观察
C C C
N M
MV L
线粒体电镜观察
B M
M
N L
MV
MV
N
L
N
1、人口腔粘膜上皮细胞活体染色显示线粒体（1）用消毒牙签刮取口腔粘膜细胞，用力应稍重些，以便得到生活力教旺盛的细胞，将刮取物涂在载玻片中央。（2）滴1滴詹纳斯绿B染液于细胞涂片处，2~3分钟后盖上盖玻片。（3）用显微镜观察，在高倍镜下可见细胞质中散在一些被染成亮绿色的短棒状和圆形颗粒，即为线粒体。
实验三线粒体活体染色
线粒体活体染色
实验目的：掌握线粒体活体染色的方法与原理
实验原理：
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线粒体的专一性活体染色剂。呈碱性，具有脂溶性，能够穿过细胞膜进入细胞内，并通过其结构中带有正电荷的染色基团结合到带负电荷的线粒体内膜上。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
线粒体活体染色
活体染色：是使生活有机体的细胞或组织特异性着色，但对该样本又没有毒害作用的一种染色方法。目的：既显示活体细胞内的某些结构，又不影响细胞的生命活动和产生任何物理和化学变化以致细胞的死亡。应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和细胞生理、病理状态
线粒体活体染色

线粒体的超活染色与观察

【实验目的】掌握动物细胞活体染色的原理和相关的技术。

【实验原理】活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。

它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。

活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。

体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。

碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。

但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。

一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。

詹纳斯绿 B（ Janus green B）和中性红（ neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

詹纳斯绿 B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

【实验用品】1、材料：小白鼠肝脏、睾丸2、试剂：Ringer 溶液： NaCl 0.85g + KCl 0.25g + CaCl 2 0.03g + 蒸馏水 100ml；1%、1/5000 詹纳斯绿 B 溶液：称取 50mg 詹纳斯绿 B 溶于 5ml Ringer 溶液中， 30-40 ℃加热，使之溶解，用滤纸过滤后，即为 1%原液。

16-17线粒体-36

4.与“通用密码子”不同。 (p149，表12-3)
5.突变频率高，为 nDNA的10倍以上。
6.遗传方式：母系遗传及不完全母系遗传。原因是某些突变的线粒体基因组不能够通过遗传瓶颈。
遗传瓶颈：卵细胞形成过程中线粒体数量急剧减少(10万到少于100个)的过程。这使得只有少数线粒体真正传给后代，也是造成子代差异的原因。如果通过遗传瓶颈保留的一个线粒体携带一种突变，这种突变就会在个体中占有一定的数量。 7.遗传的异质性、阈值效应、广谱性。 (p149)
化学渗透学说
当电子沿呼吸链传递时，所释放的能量将质子从内膜基质侧泵至膜间隙，由于线粒体内膜对离子是高度不通透的，从而使膜间隙的质子浓度高于基质，在内膜的两侧形成pH梯度（△pH）及电位梯度（Ψ），两者共同构成电化学梯度，即质子动力势（△P）。质子沿电化学梯度穿过内膜上的ATP酶复合物流回基质，使ATP酶的构象发生改变，将ADP和Pi合成ATP。
ATP合成酶工作特点：双向复合酶
线粒体、叶绿体、细菌中的ATP合成酶
（三）线粒体内外膜转位接触点
线粒体蛋白质分别定位于外膜、内膜、基质以及内外膜间隙。它们的运送途径不尽相同。定位于基质的蛋白质的运送途径，即多肽链穿越线粒体双层膜的过程：前导肽(leading peptide) 引导，与线粒体外膜受体识别结合，通过外膜及内膜蛋白转运体进入线粒体基质，期间分子伴侣蛋白协同作用，消耗ATP。
线粒体
（Mitochondrion，Mit，mt）
细胞生物学及遗传学教研室蒲淑萍
细胞内各种供能物质的氧化中心及细胞能量(ATP)产生、储存和供应中心——氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）。 Mit还与细胞中氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞的信号转导、细胞内多种离子(如Ca2+)的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控有关。（p147）

细胞生物学实验手册

细胞生物学实验手册前言这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制临床专业和研究生班。

细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。

为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。

大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。

选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。

全书内容共23个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。

本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。

荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。

教材初稿曾于1989年《全国医学细胞生物学实验课培训班》试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。

现在第四版在1993年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。

由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。

目录前言实验室规则 (1)常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2)细胞生物学实验绘图方法与要求 (4)实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量 (5)实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察 (8)实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察 (10)实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察 (13)实验六细胞生理活动的观察 (16)实验七细胞组分的化学反应 (20)实验八细胞核与线粒体的分级分离 (23)实验九细胞分裂的形态观察 (26)实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)实验十一细胞融合 (36)实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本 (38)实验十三培养细胞的形态观察和计数 (40)实验十四细胞的原代和传代培养 (43)实验十五酸性磷酸酶的显示 (46)实验十六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定 (48)实验十七电镜生物标本的制备及镜下观察 (50)实验十八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察 (54)实验十九免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原 (56)实验二十姊妹染色单体互换标本制备与分析 (58)实验二十一银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察 (60)实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察 (63)实验二十三细胞显微摄影 (65)附录一离心机转数与离心力的换算表 (67)附录二溶液的配制 (68)主要参考资料 (77)实验室规则一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。

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线粒体(Mitochondrion)的活体染色
及电镜照片观察
【实验目的】
掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。

【实验用品】
一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。

二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml 注射器、吸管。

三、试剂 l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。

【实验内容】
一、兔肝细胞线粒体的活体染色
（一）原理
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。

细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。

活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。

詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。

线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

（二）方法
用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。

当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。

染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。

将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。

(三)结果
显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。

二、线粒体的光镜切片观察
用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。

三．线粒体的电镜照片观察
不同细胞中线粒体的形态和数目不同。

线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。