《微生物学实验》操作步骤
微生物学实验教程
微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。
微生物学实验
称量---溶解----调节pH值----过滤---分装及包扎----灭菌----灭菌后试管 摆放斜面、倒平板
(2) 高压蒸汽灭菌
一般培养基用0.1Mpa，121.5℃,15～30min 实验步骤：
加水
装待灭 菌物品
加盖
加热
灭菌时间到后 断电源
压力降为零 开箱取物
摆斜面
倒平板
将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养 皿中，然后将融化，凉至50℃左右的培养基，在每个培养皿内各倒入 约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。
微生物学实验
基础综合实验一
2. 器皿的清洗包装及干热灭菌 3. 实验室环境和人体表面微生物的检查 4. 无菌接种技术
培养基配方： 蛋白胨 1g
琼脂 水
2g 100ml
牛肉膏蛋白胨固体培养基：加1.5-2％琼脂 400ml 牛肉膏蛋白胨培养基：液体培养基 200ml
(1)培养基的配制：
先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置 在离管口1/3管身处。 注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。
气、硬币等 (3)培养：37 ℃培养24h-48h
4. 微生物接种技术
常用的几种方法如下：
斜面接种 液体接种 平板接种
1)斜面接种示意图
2)平板划线法：
将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌 液，将接种环通过稍打开皿盖的缝隙（约30℃）伸入平板，将菌液点种在平板边 缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷 却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面 成30-40℃，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培 养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完 毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
微生物学实验教学案例
微生物学实验教学案例一、实验背景。
同学们，咱们都知道啊，土壤就像是一个超级神秘的微观宇宙，里面住着数不清的小居民微生物。
今天呢，咱们就像一群小探险家一样，钻进这个微观世界，去看看这些微生物到底都在土壤里干啥呢！二、实验目的。
简单说啊，咱们这个实验呢，就是要把土壤里的微生物给揪出来，看看有哪些种类，然后了解一下它们大概的数量。
就好像是给土壤里的微生物来一次小小的人口普查。
三、实验准备阶段。
1. 材料的收集就像准备探险工具。
首先呢，咱们得找些干净的小铲子，就像咱们探险的小锄头一样，去挖取不同地方的土壤。
这里我建议啊，咱们可以去花园里、农田里还有树林里各挖一点土。
为啥呢？因为不同的地方就像不同的小星球，里面住着的微生物可能大不一样呢！然后就是各种瓶瓶罐罐啦，像那些经过灭菌处理的小玻璃瓶，这就是咱们用来装土壤样品的小房子，得让微生物们住得干净又卫生，这样咱们才能准确研究它们嘛。
还有啊，培养基就像是微生物的美食广场。
咱们要准备好适合多种微生物生长的营养琼脂培养基，这可是吸引微生物们现身的法宝。
2. 仪器设备如同探险装备。
天平这个小秤砣可不能少，咱得精确称取土壤的重量，就像探险家精确计算物资一样。
高压灭菌锅就像是一个超级消毒卫士，把那些瓶瓶罐罐还有培养基都消消毒，把杂菌都赶跑，可不能让它们来捣乱咱们的微生物普查。
恒温培养箱那可是微生物的小温室，能给它们提供最舒服的生长温度，一般37℃就很适合大多数微生物生长啦，就像给它们开了个小空调。
四、实验操作过程。
1. 采集土壤样本挖掘微生物的家园。
咱们拿着小铲子，小心翼翼地把土壤挖出来。
比如说在花园里，咱们就在那些花草旁边挖个小坑，取个几克的土就够啦。
在农田里呢，就找那些作物根周围的土，这里的微生物可能和农作物关系可密切了呢。
树林里呢，就挑那些落叶下面的土，那里的微生物可能正在忙着分解落叶呢。
把取来的土分别装进贴好标签的小玻璃瓶里，可别弄混了哦，不然咱们就不知道哪个土是从哪儿来的啦。
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
2、首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只 有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以 该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总 数（见下表，例1）。 3、若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之 间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值 小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其 中稀释度(倍数)较小的计算菌落总数（见下表， 例2及例3）。
10-4 稀释度 细 菌 cfu数/平板 每g土壤的CFU数 10-5 10-6
1
2
3
平均 1
2
3
平均 1
2
3
平均
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
2、培养时为什么要将培养皿倒置培养？
其它微生物的分离纯化方法
（一）、稀释混合平板法
①按无菌操作要求，用胶头滴管依次吸取10-6、 10-5 、 10-4稀释液各200 uL，分别加入编号为10-6、 10-5 、 10-4的培养皿中。
正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿
计算公式：
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
平均菌落数——某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数； CFU——菌落形成单位（colony-forming units，CFU）； 0.2mL——每个平皿加入的菌悬液体积； 100mL——10-1菌悬液的体积； 10g——称取的土壤重量。
交叉划线法
连续划线法
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例6）。
微生物学实验操作规范说明
微生物学实验操作规范说明一、普通光学显微镜的正确使用方法1、遵循“低倍镜→高倍镜→油镜”的原则；2、利用同焦现象进行聚焦：装上待观察的玻片后，将低倍镜（4倍镜）转换到工作位，用粗调节将载物台上升到最高，再用粗调节反方向调节，初步聚焦后再用细调节聚焦，将目标物调到视野中心后才能转换10倍镜到工作位，此时将出现同焦现象，即不需要调节视野中就有目标物的模糊影像；紧接着就可以只通过细调节就可以聚焦，此后不允许再用粗调节进行聚焦，避免粗调节的误操作压迫玻片，损坏镜头；在10倍镜下聚焦后，又将目标物移到视野正中间，然后转换40倍镜头到工作位，继续利用同焦现象用细调节进行聚焦；聚焦后将目标物移到视野正中间，装上油镜，在不动载物台高度，也不拿下玻片的情况下用胶头滴管滴加香柏油，然后将油镜转换到工作位，利用同焦现象用细调节进行聚焦。
3、聚焦注意事项：（1）初步聚焦后不允许再使用粗调节进行聚焦；（2）每次转换镜头之前，物象应该是最清楚的，而且应该将目标物移到视野正中心，否则可能不出现同焦现象；（3）记得再使用40倍镜和油镜前，检查镜头是否干净，若有堵塞或香柏油，应该用二甲苯进行擦拭。
4、显微镜使用后的处理：（1）关掉电源，拿下玻片，用洗衣粉清洗干净后放入75%酒精瓶中浸泡；（2）卸下油镜，将油镜用二甲苯擦拭干净后装回塑料套中，放回干燥器中进行保管；（3）擦拭显微镜上的灰尘或油迹，将剩余的镜头摆回“八”字位；（4）在登记本上记录使用情况后，套上布套，将显微镜放回柜中。
二、无菌器材的准备1、微生物实验过程中使用的各种器材均需要进行严格的灭菌。
2、培养皿的包扎和灭菌：（1）培养皿应该干净干燥，一砸八个到十个，要按一致方向进行摆，用报纸进行包扎，要求培养皿全部包住，没有露出来的，两端报纸叠痕整齐美观，包好后用棉线进行捆绑，方便拎取；（2）培养皿也可以用专门的金属器皿进行包装；（3）培养皿灭菌可以采用干热灭菌，灭菌条件：160~170℃，1~2h；也可以采用高压蒸汽灭菌，条件121℃20min；（3）灭菌后的培养皿应该放到烘箱进行干燥，干燥温度105℃，时间视情况而定，尽量多烘一段时间，保证干透，以免培养出来的菌落生长不规则；（4）烘干的培养皿在使用之前不应该打开包装；（5）在无菌室进行杀菌时，可以将烘干的培养皿放到无菌室或超净工作台上，连同无菌室一起进行消毒；（6）使用时，打开无菌培养皿，应该让培养皿一叠盖子在上底在下，一个方向放好。
医学微生物学实验：细菌的分布
一、实验题目：细菌的分布
二、实验目的：
1.熟悉细菌分布的常用检查方法。
2.了解细菌分布的广泛性，树立“有菌”观念，认识“无菌操作”对于微生物学及医学实践的重要意义。
3.了解常规消毒方法
三、实验原理
通过不同途径，采集各种状态下的细菌标本，经过培养观察，证明细菌的分布状态。
四、实验材料
1.自来水、土壤悬液、碘液
2.无菌普通琼脂平板培养基、血平板、酒精灯、接种环、恒温培养箱
五、实验方法及步骤
1.空气中细菌的分布：采用暴皿沉降法，取5个无菌普通琼脂平板培养基，分别置于实验室、办公室、无菌室、卫生间、走廊，在空气中暴露30min后盖上盖子，37℃恒温培养48h。
2.水中细菌的分布：采用划线法。
①取1个无菌普通琼脂平板培养基，在培养皿底部用记号笔划线将培养皿平均分成两部分。
②用酒精灯外焰灼烧接种环杀菌，用接种环接取中段自来水，在培养基一侧表面划线。
③再次灼烧接种环，用接种环取土壤悬液，在培养基另一侧表面划线，再次灼烧接种环。
④盖上盖子，37℃恒温培养48h。
3.手上细菌的分布：采用涂抹法。
取1个无菌普通琼脂平板培养基，在皿底将其平均分为3个部分。
①用手指在第一个区域内轻轻压涂两下；②用自来水简单冲洗手，在第二个区域内轻轻压涂两下；③用碘液将手指消毒，风干后在第三个区域内轻轻压涂两下。
④盖上盖子，37℃恒温培养48h。
4.咽喉部细菌的分布：取1个血平板，近皿咳嗽4-6次，确保有飞沫进入培养皿。
盖上盖子，37℃恒温培养48h。
六、实验结果及分析。
幼儿园微生物科学实验教案 幼儿园科学
主题：幼儿园微生物科学实验教案一、教学目标1. 让幼儿了解微生物的存在和作用；2. 引导幼儿培养观察、探索和实验的能力；3. 培养幼儿的科学素养和动手能力。
二、教学准备1. 实验器材：显微镜、玻璃片、盖玻片、移液管、培养皿、琼脂培养基、小瓶、棉签等；2. 教具：微生物模型、幼儿科学图书、幼儿启发问题卡；3. 教师准备：制定实验方案，准备教具及实验器材。
三、实验步骤1. 引入：通过展示微生物模型，跟幼儿简单介绍微生物的概念和形态特征，引发幼儿的好奇心；2. 观察：让幼儿用显微镜观察不同的微生物，包括酵母菌、乳酸菌等，并观察它们在不同环境下的生长状态；3. 实验：通过将不同微生物分别移植到培养皿上，让幼儿观察和记录微生物的生长情况，引导幼儿学会使用移液管和培养皿；4. 总结：带领幼儿讨论实验结果，引导幼儿总结微生物的特点和作用。
四、拓展活动1. 制作微生物手工：让幼儿利用纸板、毛线等材料，制作简单的微生物手工，加深对微生物的了解；2. 游戏互动：设计微生物相关的游戏活动，如“捉微生物”、“微生物大冒险”等，增强幼儿对微生物的兴趣和认识；3. 角色扮演：组织角色扮演活动，让幼儿扮演微生物研究员、微生物警察等角色，激发幼儿的想象力和创造力。
五、教学评价1. 知识水平：通过观察实验结果，看幼儿是否能够正确观察、记录微生物的特点；2. 动手能力：观察幼儿在实验中使用显微镜、移液管等实验器材的操作是否熟练；3. 综合素养：通过互动游戏和角色扮演，看幼儿是否能够积极参与、合作并表达自己的观点。
六、教学反思1. 教学方法：是否能够充分利用幼儿的好奇心，激发他们的学习兴趣；2. 实验器材：是否能够提前准备好所需的实验器材，并保证实验的顺利进行；3. 教学效果：观察幼儿对微生物实验的反应和成果，反思教学方案和方法，如何更好地引导幼儿学习。
七、教学心得通过本次微生物实验教学，让幼儿不仅对微生物有了初步的认识，同时也培养了他们的动手能力、观察能力和合作意识。
微生物学实验
实验八
放线菌的形态观察
一、实验目标与基本要求： 学习并掌握观察放线菌形态的基本功 方法，了解放线菌的形态特征。
二、实验内容： 观察放线菌菌落形态。 三、材料： 1、菌种：白色链霉菌、红色链霉菌。 2、0.1%美蓝染液、载片和盖片。
四、步骤 1、菌落形态及菌苔特征： 以无菌操作分别取白色链霉菌、红色链霉菌 制成菌悬液在平板培养基上用划线法接种，2528℃培育5-7天，观察菌落的表面形状、大小、 颜色和边缘等；并注意放线菌在基质上着生紧 密情况。 区别基内菌丝，气生菌丝及孢子丝的着生部 位，取斜面培养的白色链霉菌、红色链霉菌观 察菌苔特征，注意孢子颜色，营养菌丝颜色和 色素分泌情况等。
2、步骤 1）单用紫外灯 在无菌室内或在接种箱内打开紫外线 灯开关，照射30min，将开关关闭。 2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用 在无菌室内，先喷洒化学消毒剂溶液， 再用紫外线灯照射15imn
四、实验报告 记录无菌检查结果 五、问题和思考 1.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内 冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力 降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 2.过滤除菌应注意哪些问题?
1)斜面接平板
a.划线法：见平板划线分离法。
b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻 轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母 可点3-4点）即可。
2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到 的单菌落接种到斜面，以便作离时，为何要将融化的培养基冷却 到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？ 2.接种时，为何要尽量使试管平放？
5、子囊孢子的观察 将面包酵母接种于麦芽汁或豆芽汁液 体培养基中，28-30度培养24h，如此 连续传代3-4次，使其生长良好，然后转 到醋酸钠斜面培养基上25-28度培养3 天。用水浸片法制片或用芽孢染色，观 察子囊孢子形状，并注意每个子囊内的 子囊孢子数目。
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实验一培养基的制备与灭菌实验步骤：（一）伊红美蓝培养基（EMB，用成品，分离大肠杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。
按成品说明称量、放入搪瓷杯，加水，加热完全溶化，倒入三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，作标记（培养基名称、批次组别、日期，下同），灭菌。
（二）营养琼脂培养基（即牛肉膏蛋白胨培养基，用成品，分离芽孢杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基，方法同上，灭菌。
（三）PDA培养基（即马铃薯蔗糖培养基，分离酵母菌、根霉用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。
培养基配方：马铃薯20%、蔗糖（白砂糖）2%、琼脂 2%，加水至所需体积，pH自然。
配制方法：马铃薯去皮，称量，切成小方块，放入搪瓷杯，加水适量，煮沸20 min，取汁液，补水至所需体积，加入蔗糖（白砂糖），加热溶化，最后加入琼脂（琼脂要预先单独用水浸泡，然后挤干再加入），加热至琼脂完全溶化，分装三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，灭菌。
培养基统一高压蒸汽灭菌（121℃25 min）。
（四）无菌平皿准备（下次实验倒平板用）每组10套，报纸包扎，高压蒸汽灭菌（121℃25 min）后，置干燥箱80℃烘干1 h。
（五）枯草样预处理及预培养（下次实验分离芽孢杆菌用）枯草样预处理：每组1瓶。
100 ml三角瓶＋自来水约50 ml，加5%可溶性淀粉，溶解。
枯草若干，剪短，浸入三角瓶水中，牛皮纸封口，包扎，置水浴中煮沸10 min，然后置培养箱30℃预培养3～7 d。
（六）葡萄样（或其它水果）酵母菌预培养（下次实验分离酵母菌用）每组1瓶。
葡萄（或其它水果）适量，捏碎，皮渣与汁液一起放入250 ml 三角瓶（装量1/2～2/3），封口，置培养箱25℃预培养3～7 d，观察自然发酵过程。
实验二微生物的分离与纯化实验步骤：（一）污水中大肠杆菌的分离（稀释倒平板法）1）用三角瓶取污水样适量。
2）每组取1套无菌平皿，底部作标记（样品名称、批次组号、日期）。
3）在平皿中加入100 µl污水样。
4）融化伊红美蓝培养基，冷却至45℃左右，倒入平皿（每皿约15～20 ml，平皿侧面高度1/3～1/2），轻轻旋转摇匀，静置，冷却至凝固。
5）置培养箱37℃倒置培养24～48 h。
（二）枯草中芽孢杆菌的分离（平板涂布法）1）每组取1套无菌平皿，底部作标记。
2）融化营养琼脂培养基，冷却至45℃左右，倒入平皿（每皿约15～20 ml），静置，冷却至凝固。
3）在平板中央加入100 µl枯草样预培养液，用玻璃涂棒涂布样品。
4）置培养箱30℃倒置培养36～48 h。
（三）葡萄样中酵母菌的分离（平板划线法）1）每组取1套无菌平皿，底部作标记。
2）融化PDA培养基，加入青霉素储存液，轻轻摇匀，冷却至45℃左右，倒入平皿（每皿约15～20 ml），静置，冷却至凝固。
3）取葡萄样酵母预培养液1环，用平板划线法划线分离。
4）置培养箱25℃倒置培养48～72 h。
（四）酒药中根霉的分离（曲末弹射法）1）每组取1套无菌平皿，底部作标记。
2）融化PDA培养基，加入青霉素储存液，轻轻摇匀，冷却至45℃左右，倒入平皿（每皿约15～20 ml），静置，冷却至凝固。
3）取少量酒药研磨成细粉（统一研磨）。
4）用曲末弹射法分离根霉（禁止在超净台内操作，以免霉菌孢子污染超净台）。
5）置培养箱30℃倒置培养24～48 h。
（培养24 h即可见菌丝）（五）培养物的观察与收捡按培养时间按时收捡平板，观察平板菌落生长情况并做好记录，然后置冰箱冷藏室（4～10℃）保存备用。
（六）培养基的处理和三角瓶的清洗实验三微生物主要类群的形态观察与显微镜的使用（显微镜低倍、中倍、高倍镜的使用）实验步骤：（一）霉菌（根霉）的形态观察水浸片载玻片→加1滴无菌水→取少量根霉入无菌水，用牙签或火柴头稍作分散→盖玻片压片→镜检（用显微镜观察：菌丝、孢子囊、孢子、假根、菌丝有无隔膜，低倍（4×10=40倍）调焦、看整体、移动视野→中倍（10×10=100倍）、高倍（40×10=400倍）看细节）→作图（实验报告不得用照片贴图）（二）酵母菌的形态观察水浸片载玻片→加1滴无菌水→取1环酵母菌入无菌水涂匀→盖玻片压片→镜检（用显微镜观察：菌体、出芽，低倍调焦→中倍看整体→高倍看细节）→作图（实验报告不得用照片贴图）（三）水体中水生微生物的观察每组取水样1瓶（各组分别取湖水、污水）直接取水样1滴观察载玻片→加1滴水样→盖玻片压片→镜检（用显微镜观察：蓝细菌、微藻、原生动物，注意区别蓝细菌和微藻、观察微生物的运动和原生动物的吞食行为，低倍调焦→中倍看整体→高倍看细节）→作图（实验报告不得用照片贴图）（四）霉菌、酵母菌平板等的处理和清洗平板煮沸消毒后，倒掉培养基，清洗平皿、取样瓶（三角瓶）等，按规范方式桌面放置实验四细菌染色与油镜的使用（显微镜油镜的使用）实验步骤：（一）细菌的简单染色（单染）材料：枯草芽孢杆菌分离样1.涂片：载玻片→1滴无菌水→取1环菌种，涂匀2.干燥：风干（自然干燥）或烘干（火焰上空，以手背测试载玻片背面，以不烫手为宜，防止温度过高引起细胞变形）3.固定：载玻片背面快速过火焰2～3次4.染色：单染（即染1种染液，选用美兰），1～2 min5.水洗：自来水细水冲洗至流水无色为止6.吸干：用吸水纸（滤纸条）7.镜检：用油镜观察（加香柏油，不要加盖玻片），1000×，学会油镜使用，注意观察和区分菌体、芽孢囊和芽孢，记录结果8.油镜镜头的擦拭清理：用擦镜纸（或棉签）浸二甲苯擦拭油镜镜头，擦掉香柏油，然后再用擦镜纸擦干镜头，及时洗手（注意：严禁用棉签坚硬部分擦伤镜头）（二）细菌的革兰氏染色（双染）材料：污水分离样、枯草芽孢杆菌分离样1.制片：涂片→干燥→固定（方法同上，用2种样品各制1片）2.初染：结晶紫1～2 min，水洗3.媒染：碘液1 min，水洗4.脱色：95%酒精20～30 s（秒），水洗5.复染：用吸水纸吸去残留水，番红（即沙黄）2 min，水洗6.吸干：用吸水纸（滤纸条）吸干，或在酒精灯火焰上空（温度较低处）烘干7.镜检：油镜观察，直到观察到G＋、G－菌各一为止，记录结果8.油镜镜头的擦拭清理：同上（三）细菌平板的处理和清洗先灭菌（121℃25 min）或煮沸至培养基融化，培养基及培养物倒入垃圾桶，清洗平皿，按规范方式桌面放置。
实验五 微生物数量的测定（酵母菌的血球计数板计数）实验步骤：1. 血球计数板准备（清洗、熟悉）清洗：血球计数板→自来水冲洗→吸水纸（滤纸条）吸干（严禁酒精灯火焰烘干） 熟悉：低倍镜找计数区域→中倍镜找计数室（即中央大方格，由25个中方格、400个小方格组成）→高倍镜找中方格（边缘为双线，1个中方格由16个小方格组成，小方格边缘为单线）2. 加样品血球计数板上盖盖玻片（或血盖片）→用毛细滴管吸细胞悬浮液（酵母发酵液）在盖玻片边缘滴1滴→细胞悬浮液渗透入计数室→用镊子轻压盖玻片→静置3～5 min ，使细胞自然沉降、静止。
3. 显微镜计数显微镜操作步骤同1，高倍镜下计数。
数计数室中的5个中方格（计数室的四角及中央各1个中方格。
边缘线上的细胞计数原则：数上不数下，数左不数右），记录各中方格中的细胞数，5个中方格细胞数合计为A ，细胞悬浮液（酵母发酵液）稀释倍数为B （未稀释原液B=1），按公式进行换算：悬浮液细胞数（个/ml ）＝5A ×25（计数室的中方格总数）×104×B 注意：亮度、反差（光栅）调至适当4. 血球计数板清洗和收捡自来水冲洗→吸水纸吸干→装盒→收捡实验六微生物的应用（酸奶的制作）实验步骤：1.装瓶：1瓶/组，鲜牛奶200 ml/瓶2.加糖：加5～6%蔗糖（白砂糖，采用6%），搅拌溶解3.巴氏消毒：水浴中80℃15 min或90℃5 min（采用后者，或沸水中放15 min）4.冷却：至45℃以下再接种5.接种：接种5～10%（采用6%）市售发酵酸奶（菌种：嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌），摇匀6.发酵：培养箱（或水浴）40～42℃静置4～6 h（采用42℃，时间以凝固为准）7.后熟：置冰箱4～7℃冷藏24 h8.品尝：质量判断：1）凝乳状况（凝固、不流动）；2）光泽度（断面光滑、细腻）；3）风味（有香味、无异味）；4）酸味（pH4.0左右）实验七水中细菌总数的测定实验步骤：（一）准备（在上次实验准备）1. 营养琼脂培养基：1瓶/组，200 ml/瓶，用成品，加水加热溶化，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，121℃灭菌25 min。
2. 无菌水（或无菌生理盐水，即0.85% NaCl水溶液）：1瓶/组，装水100 ml，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，121℃灭菌25 min。
3. 无菌试管：3支/组，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，121℃灭菌25 min。
4. 无菌取样瓶：1个/组，250 ml三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，121℃灭菌25 min。
5. 无菌平皿：6套/组，报纸包裹，121℃灭菌25 min。
6. 无菌吸管：3支/组（1支10 ml，2支1～2 ml），报纸包裹，121℃灭菌25 min。
3～6项高压蒸汽灭菌后，置烘箱中80℃烘干后备用。
（二）测定1. 取水样：九洲湖水，每组约100 ml，用无菌取样瓶取样。
2. 融化培养基：电炉上融化，注意用电安全！融化后置桌面自然降温备用（冷至约45℃再倒平板）3. 水样稀释：在超净工作台内操作。
用10 ml无菌吸管分装无菌水试管3支，每支装无菌水9 ml，作好标记10－1，10－2，10－3（可简写为－1，－2，－3），水样作10倍系列稀释。
4. 倒平板：在超净工作台内操作。
6套平皿底部边缘标记10－1，10－2，10－3（可简写为－1，－2，－3，每1稀释度作1重复），每皿加样（水样稀释液）1 ml，倒培养基15～20 ml（侧面高度约1/3即可），在台面上旋转摇匀，6块平板/组。
5. 培养：置培养箱37℃倒置培养24 h。
6. 平板菌落计数（讲解计数方法）7. 计算：…CFU/ml水样计算菌落总数方法举例注：46000÷29500=1.6；60000÷27100=2.2实验八 微生物大小的测定（酵母菌的大小测定）实验步骤：目镜测微尺：100小格（或50小格），每1小格代表的实际长度由镜台测微尺校正，然后在显微镜下用目镜测微尺去度量细胞大小（使用镜台测微尺校正时相同的放大倍数）。
目镜测微尺格线上标有数字（镜台测微尺格线上没标数字）。
镜台测微尺：总长1 mm ，100小格，每1小格长10 μm 。