《食品酶学》第2章 酶的分离纯化(精制)
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酶的分离纯化
本节 目录
梯度回收
1、穿刺法 采用针穿刺离心管底部，使梯度靠重力自由滴 出，然后依次作分布收集，此法适用于薄壁塑 料管，流出液部分收集于小试管中，经分析决 定取舍或合并。 此法对梯度扰动小，但离心管不能再用，不适 合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢 或厚壁塑料管。
2、取代法
浓 取 代 液
向上取代
优点：是不破坏离心管
收集 稀
，能用于较粘梯度，可借 浓 光学（放射性）系统进行 流出液跟踪，简化分析化 验工作。
缺点：开始取代操作时
收集 浓
稀
易引起扰乱，操作需特别 小心，梯度粘度太大时也 不合适。
向下取代
通入空气、轻液体
3、虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯 度， 它也不损伤离心管，尤其适用于不锈钢管中物质的分级 分离，但虹吸时易引起分离区带扰乱，最好使用专门的 装置。 除取代法和虹吸法外，有时从管上部直接仔细地用注射 器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。
⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）
⑷等电点沉淀 ⑸有机聚合物沉淀
1、盐析沉淀法（改变离子强度）
（1）. 基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生 两种现象： 1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
细胞结构与酶分布
2、酶分离原则：
在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、 过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失 活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活 力。
3、 酶的提取、分离纯化技术路线
发酵醪液 预处理
酶初步分离纯化 酶高度分离纯化 酶浓缩、干燥 酶产品 膜过滤、层析分离，电泳分 离 细胞破碎、离心、过滤
食品酶学本酶的分离纯化分离方法ppt课件
Kd
Ve Vo Vi
Ve：某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组 分出现高峰时所用洗脱液体积（mL）
Vo：外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积（mL） Vi：内（水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积(mL)
30 August 2021
19
（1）Kd值的意义
Kd=0时 即Ve=Vo，该组分足够大，不能进入微孔，最先流出。 Kd=1时 即Ve=Vo+Vi，该组分可进入全部的微孔，最后流出。 0<Kd<1 Kd小的先流出， Kd大的后流出。
分离方法分述
一、离心分离法 二、过滤与膜分离 三、沉淀分离法 四、层析分离法 五、电泳分离法 六、酶的结晶 七、浓缩与干燥
30 August 2021
1
四、层析分离法
原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程
度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组 分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。 吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物
②可将离子交换剂加到酶液中，待交换后，将离子交换剂过滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。
中性蛋白目酶可前在pH在6. 酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有 2洗、脱离液子的交D流换速E剂：的A流构速E成快：-分基纤辨质率、维低功。能素基团、（电A荷E基-团纤）、维反离素子。、CMC（羧甲基纤维素）等。
3、吸附层析方法 枯草杆菌α-淀粉酶在弱酸性条件下，
①吸附剂可装在吸附柱可上吸进附行在吸氧化附铝柱上层，析再；用pH8～9的
②把吸附剂加到酶液中N，a3吸PO附3溶后液过洗滤脱出；中来性，蛋再白加酶可洗脱剂， 使酶解吸而洗脱出来。在 附p，H再6在.5p～H89.～5条11件.5下的，2用%硅氯藻化土钠吸
酶的分离与纯化PPT课件
2）非机械法：酶法、化学法、物理法 • 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通
透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌 外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐 酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性 差，效率低，毒性
(NH4)2SO4饱和度表
• 温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液 中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质 的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强 度溶液中，25℃时的溶解度比0℃时明显减小。这主要是 因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升 高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除 非这种酶对温度比较敏感。
蛋白质的盐析
盐析应用最广泛的是硫酸铵
• 优点 1）溶解度大 25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大 约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶 都可以被盐析沉淀出来。 2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如 0℃时，硫酸 铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对 于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格 低廉，容易获得。 • 缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。
（五）沉淀分离
1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓 度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响
酶的分离纯化 (2)优秀课件
酶的分离纯化 (2)优秀课件
1
Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
2
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
8
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
17
3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
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Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
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第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
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有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
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3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
26食品酶学-教学大纲
《食品酶学》教学大纲课程编号：021330026课程名称：食品酶学总学分：2 总学负荷：56 自主学习：28课内总学时数：28先修课：食品酶学是一门应用性课程，以《食品加工工艺学》、《食品化学》、《食品生物化学》和《食品微生物学》等课程等为基础。
一、部分说明1、课程性质：为食品科学与工程专业和生物工程（食品方向）学生所设置的选修课。
2、教学目标及意义《食品酶学》课程的教学目的是向相关专业学生讲授酶在食品行业中的作用、使用原理、使用方法和工业化应用情况。
教学意义是通过本课程教学，使学生对食品酶学有比较全面、客观地进行了解和认识，认清酶在食品中的重要作用，为学生在今后的工作实践或从事相关科学研究打下良好的基础。
3、教学内容及要求本课程安排在学生完成《食品化学》、《食品生物化学》、《食品微生物学》等有关基础和专业课程之后。
《食品酶学》课程的教学内容要注意与以上课程的衔接，尤其是与《食品微生物学》的紧密结合。
本课程教学内容主要包括酶学基本理论和酶在食品加工及保藏中的应用两部分，理论部分主要包括酶的分离纯化及动力学研究，应用部分主要介绍了酶在食品工业中的应用。
另外，对今年来发展很快的固定化酶和酶在食品分析中的应用也作了较详细的介绍，并概述了有关酶的安全和毒理方面的问题。
4、教学重点、难点本课程教学重点：掌握酶的一般特征，酶的发酵及分离纯化方法，酶活的测定以及影响酶活的因素。
课程的教学难点主要是正确理解并掌握酶在食品工业上的应用。
5、教学方法与手段在理论教学方法上采取课堂讲授为主，辅以多媒体课件、视频教学、现场实验操作等，以加强学生对理论知识的消化和理解，在教学过程应注意启发学生的思维，培养学生发现问题和解决问题的能力。
6、教材及主要参考书课程教材：何国庆，丁立孝主编.食品酶学，化学工业出版社，2006.主要参考书。
1、食品酶学，郑宝东，东南大学出版；2、食品酶工程，李斌，中国农业大学出版社；3、酶工程，郭勇，中国轻工出版社；4、食品酶学，王璋，中国轻工出版社。
酶的提取和分离纯化-PPT课件
14
2.压力差破碎法
通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲 击、突然降压和渗透压差法等。
（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体 细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击 锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达 每平方厘米几百至几千kg。
15
Manton-Gaulin homogeniser valve
32
11.5.1 根据溶解度不同进行的纯化
盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法 液液分离法
33
一、盐析法
盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用 的方法。
盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的 溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大， 表现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓 度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度 又会先后以不同速度下降，分别“盐析 (salting out)沉淀析出。盐析纯化法就是根据 酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别 差别而建立的一种纯化方法。
此外可通过加入噬菌体去感染细胞，或通 过电离辐射等方法，使细胞自溶。
24
丙酮干粉的制备
破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetone powder)，一般程序是：
先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件 下，加入5~10倍预先冷至约-20 ℃的丙酮，迅速 搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。 丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁，另一方面 有利于除去大量的脂类杂质，同时还能使某些膜 结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便 于保存。
6
酶分离纯化的工艺流程设计
设计时需要考虑的因素：
酶源材料 前期工艺过程 产品对纯度的要求 酶存在的状态 设备条件 动力、原料成本及工时费用
2.压力差破碎法
通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲 击、突然降压和渗透压差法等。
（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体 细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击 锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达 每平方厘米几百至几千kg。
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Manton-Gaulin homogeniser valve
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11.5.1 根据溶解度不同进行的纯化
盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法 液液分离法
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一、盐析法
盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用 的方法。
盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的 溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大， 表现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓 度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度 又会先后以不同速度下降，分别“盐析 (salting out)沉淀析出。盐析纯化法就是根据 酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别 差别而建立的一种纯化方法。
此外可通过加入噬菌体去感染细胞，或通 过电离辐射等方法，使细胞自溶。
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丙酮干粉的制备
破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetone powder)，一般程序是：
先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件 下，加入5~10倍预先冷至约-20 ℃的丙酮，迅速 搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。 丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁，另一方面 有利于除去大量的脂类杂质，同时还能使某些膜 结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便 于保存。
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酶分离纯化的工艺流程设计
设计时需要考虑的因素：
酶源材料 前期工艺过程 产品对纯度的要求 酶存在的状态 设备条件 动力、原料成本及工时费用
第2章-酶分离纯化
6 相对活力
定义: 具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与 游 离酶活力的比值. 计算: 固定化酶活力/溶液酶总活力—残留酶 活力*100% 意义: 相对活力的高低表明了固定化酶应用 价 值的大小.它与载体结构,固定化 颗粒的 大小,底物的相对分子量及酶的结
第二节 酶的分离纯化
一、酶的提取与分离纯化技术路线 二、细胞破碎 三、酶的提取 四、酶的分离方法 五、酶的组合分离纯化策略
酶活力单位
IUBEC 1961年规定: 在最适反应条件下，每分钟(min)催化 1μ mol底物或1μ mol被作用基团或1μ mol 键转化为产物所需的酶量，定义为1个国际 单位，用IU表示； 1972年又用mol和秒(s)表示，活力单位为 卡托(kat) 1kat=1mol/s=60mol/min =6×107IU
一、 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 离心分离、过滤分离、沉淀 分离、层析分离，电泳分离 萃取分离、结晶分离等 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打 破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗 略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯 化，使用 各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精 制纯
酶活力回收率:
酶活力回收率=固定化酶的活力/固定化 之前游离酶的活力*100% 计算实例 将总活力为20万单位的α -淀粉酶固定化, 测得固定化活力为16万单位,固定化处理中 收集的残余溶液中酶活力为2万单位,计算 酶结合效率与酶活力回收率,和相对活力? 酶结合效率=20-2/20*100%=90 % 酶活力回收率=16/20*100%=80 % 相对活力=16/20-2*100%=88.88 %
第2章酶的生产与分离纯化
15
（8）啤酒酵母 ）
细胞呈圆形，卵形、 细胞呈圆形，卵形、 椭圆形到腊肠形。 椭圆形到腊肠形。菌 落呈白色，有光泽、 落呈白色，有光泽、 平滑。 平滑。 用于生产转化酶、 用于生产转化酶、丙 酮酸脱羧酶等。 酮酸脱羧酶等。
16
2.1.1.2 产酶菌株的选育
特定酶产生菌的筛选方法主要依据酶催化的反应性质、 特定酶产生菌的筛选方法主要依据酶催化的反应性质、作 酶催化的反应性质 用底物的特异性、底物和产物的特性以及 以及酶在细胞中所处 用底物的特异性、底物和产物的特性以及酶在细胞中所处 的位置来进行选育 来进行选育。 的位置来进行选育。 对于胞外酶 胞外酶， 对于胞外酶，可在培养基中加入酶作用的不溶性底物或酶 催化反应的产物，根据菌落周围的透明圈 透明圈、 催化反应的产物，根据菌落周围的透明圈、颜色变化来筛 选。 对于胞内酶 若酶作用底物分子量小可透过细胞膜， 胞内酶， 对于胞内酶，若酶作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶 催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色 催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色 变化来筛选。 变化来筛选。而多数胞内酶产生菌的筛选则通过细胞破碎 物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选 物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选 辅酶NAD）。 （辅酶 ）
22
重要
有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、 有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸 皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯 玉米、米糠等淀粉质原料； 苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品 橡子、石蒜等淀粉质原料。此外， 碳的成分来作碳源， 中12～16碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生 ～ 碳的成分来作碳源 物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。 物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。
（8）啤酒酵母 ）
细胞呈圆形，卵形、 细胞呈圆形，卵形、 椭圆形到腊肠形。 椭圆形到腊肠形。菌 落呈白色，有光泽、 落呈白色，有光泽、 平滑。 平滑。 用于生产转化酶、 用于生产转化酶、丙 酮酸脱羧酶等。 酮酸脱羧酶等。
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2.1.1.2 产酶菌株的选育
特定酶产生菌的筛选方法主要依据酶催化的反应性质、 特定酶产生菌的筛选方法主要依据酶催化的反应性质、作 酶催化的反应性质 用底物的特异性、底物和产物的特性以及 以及酶在细胞中所处 用底物的特异性、底物和产物的特性以及酶在细胞中所处 的位置来进行选育 来进行选育。 的位置来进行选育。 对于胞外酶 胞外酶， 对于胞外酶，可在培养基中加入酶作用的不溶性底物或酶 催化反应的产物，根据菌落周围的透明圈 透明圈、 催化反应的产物，根据菌落周围的透明圈、颜色变化来筛 选。 对于胞内酶 若酶作用底物分子量小可透过细胞膜， 胞内酶， 对于胞内酶，若酶作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶 催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色 催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色 变化来筛选。 变化来筛选。而多数胞内酶产生菌的筛选则通过细胞破碎 物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选 物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选 辅酶NAD）。 （辅酶 ）
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重要
有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、 有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸 皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯 玉米、米糠等淀粉质原料； 苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品 橡子、石蒜等淀粉质原料。此外， 碳的成分来作碳源， 中12～16碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生 ～ 碳的成分来作碳源 物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。 物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。
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温度差破碎法对那些较脆弱易碎的细胞破碎效 果较好，一般使用与对数生长期的细胞效果较 好。但在酶的提取时，不能在过高或过低的温 度下操作，以免酶的失活。
此法难以用于工业化生产。
(2)压力差破碎法
通过压力的突然变化使细胞破碎。 常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差等方
法。
（3）超声波破碎法
通常人的耳朵可听到的声音频率范围为16至 20kHz的波称之为超声波。
《食品酶学》 第2章 酶的分 离纯化(精制)
第2章 酶的分离纯机械运动所产生剪切力作用， 使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
分类：机械捣碎法、研磨法、匀浆法
(1)机械捣碎法
利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切 片将组织细胞破碎。转速可达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的 组织细胞破碎，也可用于微生物，特别是 细菌的细胞破碎。
此法在实验室和生产规模均可采用。
(2)研磨法
利用研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器 械所产生的剪切力将组织细胞破碎。
必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化 铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。
研磨法设备简单，可用人力操作也可电动 操作，但效率较低。
(3)匀浆法
利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。
匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质 塑料或不锈钢等制成。
通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒 细小的组织细胞。
大块的组织或细胞团需先用组织捣碎机或研磨 器捣碎分散以后才能进行匀浆。
匀浆器的细胞破碎程度较高，其机械切利对酶 的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。
在超声波作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。 超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效
果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。 但要在大规模工业生产中应用，困难很多。
3.化学破碎法
定义：化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞 膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。
常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂 两大类。
2.物理破碎法
定义：通过温度、压力、声波等各种物 理因素的作用，使组织细胞破碎的方法， 统称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
分类：温度差破碎法、压力差破碎法、 超声波破碎法
(1)温度差破碎法
通过温度的突然变化使细胞破碎。 例如将冷冻的细胞突然放进高温度中的细胞突
然冷冻都可使细胞破坏。
常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、 丁醇等。
注意事项：在酶的提取过程中，为提高提取率并 防止酶变性失活，必须注意几点：
（1）温度：为防止酶的变性失活，提取温度不宜 过高。
（2）pH值：溶液pH值对酶的溶解度和稳定性有显 著影响。
（3）提取液的体积：提取液的用量增加，可提高 提取率。
（4）添加保护剂：提高稳定性，防止酶失活。
本节复习题
1.酶的提取及分类 2.盐溶现象、盐析现象 3.盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取的定义 4.有机溶剂提取的定义、种类和注意事项
2.3离心分离
离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使 不同大小和不同密度的物质分离的技术。
在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、 细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要 使用离心分离。
表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别 有效，在实验室和生产中均已成功使用。
4.酶学破碎法
定义：在一定条件下，通过外加的酶或细胞本 身存在的酶的作用，使细胞破碎。
分类：外加酶处理、自溶法。
(1)外加酶处理
根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细 胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破碎。
分类：有机溶剂处理、表面活性剂处理。
（1）有机溶剂处理
常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯 仿等。
有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，改 变系薄膜的透过性，再经提取可使膜结合 酶或胞内酶等释出胞外。
（2）表面活性剂处理
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋 白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜 的通透性。
由于溶菌酶的酶价格较高，而外加酶本身混入细 胞破碎液中称为杂质。
外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生产。
（2）自溶法
将细胞在一定的pH值和适当的温度条件下保温一 段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏, 使胞内物质释出的方法称为自溶法。
自溶法效果的好坏取决于自溶条件。主要有温度、 pH值、离子强度等。
一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控 制在0.02~0.05mol/L。
（2）酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较 好，宜用酸溶液提取。
（3）碱溶液提取
有些在碱性条件下溶解度较大且稳定较好的酶， 应采用碱溶液提取。
（4）有机溶剂提取
有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基 团较多的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和 稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。
此外，可以通过加入噬菌体去感染细胞，或通过 电离辐射等方法，使细胞自溶。
本节复习题
1.酶的提取和分离纯化、分离纯化方法 2.细胞破碎的方法 3.机械破碎法及分类和应用 4.研磨法和匀浆法的定义和特点 5.物理破碎法的定义、应用和分类 6.温差破碎法的定义、特点和应用 7.压差破碎法的定义和分类 8.超声波破碎法的特点 9.化学破碎法的定义和分类 10.有机溶剂破碎过程(机理) 11.表面活性剂处理及其特点 12.酶破碎法的定义及其分类 13.外加酶处理及特点 14.自溶法及其特点
2.2酶的提取
定义：酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶 剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。 也称作酶的抽取。
方法：根据酶提取时所用的溶剂或溶液的不同， 酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、 碱溶液提取和有机溶剂提取等。
(1)盐溶液提取
大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件 下，酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，盐浓 度不能太高，否则溶解度降低，出现盐析现象。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的 大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、 离心方法和离心条件。
1.离心机的种类与用途
离心机的分类： ①按分离形式可分为沉降式和过滤式。 ②按操作方式有间歇、连续和半连续。 ③按用途有分析用、制备用及分析、制备两用。 ④按结构特点则有管式、吊篮式、转鼓式和碟式
此法难以用于工业化生产。
(2)压力差破碎法
通过压力的突然变化使细胞破碎。 常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差等方
法。
（3）超声波破碎法
通常人的耳朵可听到的声音频率范围为16至 20kHz的波称之为超声波。
《食品酶学》 第2章 酶的分 离纯化(精制)
第2章 酶的分离纯机械运动所产生剪切力作用， 使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
分类：机械捣碎法、研磨法、匀浆法
(1)机械捣碎法
利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切 片将组织细胞破碎。转速可达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的 组织细胞破碎，也可用于微生物，特别是 细菌的细胞破碎。
此法在实验室和生产规模均可采用。
(2)研磨法
利用研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器 械所产生的剪切力将组织细胞破碎。
必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化 铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。
研磨法设备简单，可用人力操作也可电动 操作，但效率较低。
(3)匀浆法
利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。
匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质 塑料或不锈钢等制成。
通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒 细小的组织细胞。
大块的组织或细胞团需先用组织捣碎机或研磨 器捣碎分散以后才能进行匀浆。
匀浆器的细胞破碎程度较高，其机械切利对酶 的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。
在超声波作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。 超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效
果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。 但要在大规模工业生产中应用，困难很多。
3.化学破碎法
定义：化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞 膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。
常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂 两大类。
2.物理破碎法
定义：通过温度、压力、声波等各种物 理因素的作用，使组织细胞破碎的方法， 统称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
分类：温度差破碎法、压力差破碎法、 超声波破碎法
(1)温度差破碎法
通过温度的突然变化使细胞破碎。 例如将冷冻的细胞突然放进高温度中的细胞突
然冷冻都可使细胞破坏。
常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、 丁醇等。
注意事项：在酶的提取过程中，为提高提取率并 防止酶变性失活，必须注意几点：
（1）温度：为防止酶的变性失活，提取温度不宜 过高。
（2）pH值：溶液pH值对酶的溶解度和稳定性有显 著影响。
（3）提取液的体积：提取液的用量增加，可提高 提取率。
（4）添加保护剂：提高稳定性，防止酶失活。
本节复习题
1.酶的提取及分类 2.盐溶现象、盐析现象 3.盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取的定义 4.有机溶剂提取的定义、种类和注意事项
2.3离心分离
离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使 不同大小和不同密度的物质分离的技术。
在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、 细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要 使用离心分离。
表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别 有效，在实验室和生产中均已成功使用。
4.酶学破碎法
定义：在一定条件下，通过外加的酶或细胞本 身存在的酶的作用，使细胞破碎。
分类：外加酶处理、自溶法。
(1)外加酶处理
根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细 胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破碎。
分类：有机溶剂处理、表面活性剂处理。
（1）有机溶剂处理
常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯 仿等。
有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，改 变系薄膜的透过性，再经提取可使膜结合 酶或胞内酶等释出胞外。
（2）表面活性剂处理
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋 白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜 的通透性。
由于溶菌酶的酶价格较高，而外加酶本身混入细 胞破碎液中称为杂质。
外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生产。
（2）自溶法
将细胞在一定的pH值和适当的温度条件下保温一 段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏, 使胞内物质释出的方法称为自溶法。
自溶法效果的好坏取决于自溶条件。主要有温度、 pH值、离子强度等。
一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控 制在0.02~0.05mol/L。
（2）酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较 好，宜用酸溶液提取。
（3）碱溶液提取
有些在碱性条件下溶解度较大且稳定较好的酶， 应采用碱溶液提取。
（4）有机溶剂提取
有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基 团较多的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和 稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。
此外，可以通过加入噬菌体去感染细胞，或通过 电离辐射等方法，使细胞自溶。
本节复习题
1.酶的提取和分离纯化、分离纯化方法 2.细胞破碎的方法 3.机械破碎法及分类和应用 4.研磨法和匀浆法的定义和特点 5.物理破碎法的定义、应用和分类 6.温差破碎法的定义、特点和应用 7.压差破碎法的定义和分类 8.超声波破碎法的特点 9.化学破碎法的定义和分类 10.有机溶剂破碎过程(机理) 11.表面活性剂处理及其特点 12.酶破碎法的定义及其分类 13.外加酶处理及特点 14.自溶法及其特点
2.2酶的提取
定义：酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶 剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。 也称作酶的抽取。
方法：根据酶提取时所用的溶剂或溶液的不同， 酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、 碱溶液提取和有机溶剂提取等。
(1)盐溶液提取
大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件 下，酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，盐浓 度不能太高，否则溶解度降低，出现盐析现象。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的 大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、 离心方法和离心条件。
1.离心机的种类与用途
离心机的分类： ①按分离形式可分为沉降式和过滤式。 ②按操作方式有间歇、连续和半连续。 ③按用途有分析用、制备用及分析、制备两用。 ④按结构特点则有管式、吊篮式、转鼓式和碟式