微生物实验—三平板分离技术1
土壤微生物的分离纯化 实验：微生物的分离、培养和菌种保藏
思考题
❖ 什么叫无菌操作？分离放线菌和真菌为什么 需要分别加重铬酸钾和链霉素？
❖ 平板培养时为什么要把培养皿倒置？ ❖ 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？
Байду номын сангаас
实验七
结束
下周实验
理化因素对微生物的影响
（实验三十二、实验三十四、实验三十八）
每毫升样品中微生物细胞数=
每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数
混匀 凝固
28～30℃ 培养
图7－4 混合法流程图
实验程序 Ⅳ——平板涂抹法（涂布法）
❖ 每人取无菌培养皿1付（每个同学做一只）。在皿底贴上标签，注明 分离菌名、稀释度、组别、班级。
❖ 取已熔化的高氏培养基，分别倒15－20ml入培养皿中，铺平，制成 平板。
养皿里。 ❖ 3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯培养基（PDA培养基），
分别倒约15－20ml入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液、培养基 充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于28～300C恒温培养 5～6d。观察真菌菌落形态以及计数 菌落。并计算出每g土壤中真菌的数 量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即 得。 （见图7－4）
挑取单个菌落接种于斜面培养基 上，如果不纯，再移植纯化，最 后得到纯培养。
实验程序Ⅵ——四大类微生物菌落形态的比较和
识别
❖ 区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态） 和细胞形态（个体形态）两方面的观察。
❖ 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。 菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。
淀粉琼脂培养基 马铃薯蔗糖培养基
❖ 无菌水：带有玻璃珠装有99mL无菌水三角瓶
菌种的分离纯化技术——平板划线法
划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,
第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区) 是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的 单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积 的分配应是D＞C＞B＞A。
实验目的
态结构等特征的子细胞的群落。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每 个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养
温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
菌苔：细菌在固体培养基接种线上由母细胞繁 殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征 的细菌群落，是许多菌落连成一片形成的 细菌在斜面培养基接种线上长成的一片密集的 细菌群落，不同属种细菌的菌苔形态是不同的
了解平板划线分离纯种的原理，并熟练 掌握该操作法。
实验器材
Βιβλιοθήκη 菌悬液 牛肉膏蛋白胨培养基 无菌培养皿，水浴锅，接种环等。
实验步骤
1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水 浴中加热至融化。 2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操 作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。
实验原理平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞经培养后生长繁殖成单菌落通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种
平板划线技术
王伟青
名词的认识：
菌落：由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固 体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有一定形
微生物的分离和纯化实验原理及步骤
实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。
单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
微生物实验
微生物学实验实验一一、目的要求二、基本原理➢➢➢三、实验材料每组同学需要准备以下材料（2人/组）：●●●●●●●●●●●●●●四、实验内容（一）、培养基的配制：注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。
操作图示：四、实验内容培养基配方：1．配制肉汤斜面培养基50 mL 2．配制麦芽汁斜面培养基3．注意事项：◆◆◆◆（二）培养基灭菌四、实验内容（三）包扎1．培养皿：2．吸管：3．三角玻扒：五、实验报告思考题：◆◆◆◆◆◆◆◆实验二一、目的要求➢➢二、基本原理三、实验材料1．各组所需的物品●●●●2．注意事项：①②①②③④四、实验内容1．微生物的斜面接种技术：斜面接种的操作方法：转下页接种菌名及接种划线方式、接种工具：细菌：霉菌：酵母菌：图2-1 各种无菌操作接种技术示意图图2-2 穿刺接种操作过程示意图2．生物的培养技术——培养箱恒温培养法3. 为下次实验准备平板培养基：注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。
培养基配方：(1)配制肉汤平板培养基100 mL(2)配制麦芽汁平板培养基配制好的培养基进行灭菌！五、实验报告1．观察记录实验结果:微生物琼脂斜面上的生长状况。
2．思考题:◆◆实验三一、目的要求●●二、基本原理三、实验材料1、各组所需物品：•••••2、平板的制备：四、实验内容1. 平板混合分离法：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌（3皿）图3-1 混合倒平板操作法示意图四、实验内容2. 平板划线分离法：（3皿）图3-2 平板划线分离操作法示意图图3-3 平板划线菌落分离效果图四、实验内容3. 平板涂布分离法(3皿)：图3-4 涂布平板操作法示意图四、实验内容4. 平板点殖：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3皿）四、实验内容5. 生物的培养技术：培养箱恒温培养法➢➢五、实验报告1、观察记录实验结果：微生物的菌落特征注:菌落特征描写方法参考如下：五、实验报告2、思考题:实验四一、目的要求二、基本原理转下页二、基本原理三、实验材料1. 菌种：2. 每组制片用具：3. 染色剂1套：四、实验内容四、实验内容3.细菌、酵母菌、霉菌的制片技术及个体形态观察：●●●图4-10 涂片制备过程四、实验内容4 注意事项：●●●●。
分离细菌的实验报告
一、实验目的1. 学习细菌分离和纯化的基本方法。
2. 掌握平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化细菌。
3. 了解细菌纯化过程中的注意事项。
二、实验原理细菌分离和纯化是微生物学实验中的重要技术，通过将混合菌液中的细菌分离出来，得到单个菌落，从而研究细菌的生物学特性。
本实验采用平板划线法和稀释涂布平板法进行细菌分离。
1. 平板划线法：将菌液滴在琼脂平板上，用无菌接种针划线，使菌液在平板上逐渐稀释，最终形成单个菌落。
2. 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列稀释，将适量稀释液涂布在琼脂平板上，使菌液在平板上稀释至形成单个菌落。
三、实验材料1. 实验试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、无菌水、生理盐水、无菌棉签、无菌接种针、酒精灯、无菌培养皿、移液器、显微镜等。
2. 实验菌种：待分离的细菌菌液。
四、实验步骤1. 制备牛肉膏蛋白胨培养基：按照实验要求，将牛肉膏蛋白胨培养基溶解于蒸馏水中，调整pH至7.0-7.2，分装于无菌培养皿中，高压灭菌。
2. 菌液制备：将待分离的细菌菌液用无菌生理盐水进行适当稀释。
3. 平板划线法分离：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基冷却至50℃左右，倒入无菌培养皿中，待凝固。
（2）用无菌棉签蘸取适量菌液，在平板上划线。
（3）将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时。
4. 稀释涂布平板法分离：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基冷却至50℃左右，倒入无菌培养皿中，待凝固。
（2）将菌液进行一系列稀释，取适量稀释液涂布在平板上。
（3）将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时。
5. 观察结果：观察平板上的菌落生长情况，记录菌落特征。
五、实验结果与分析1. 平板划线法：在平板上观察到多个菌落，其中有些菌落可能为单个菌落，但有些菌落可能为多个细菌聚集而成。
2. 稀释涂布平板法：在平板上观察到单个菌落，说明菌液已成功分离。
六、实验讨论1. 平板划线法分离细菌时，划线次数和划线速度对分离效果有较大影响。
划线次数过多或过少、划线速度过快或过慢，均可能导致分离效果不佳。
实验三 平板分离技术与活菌计数
实验三平板分离技术与活菌计数实验教学课题：实验三平板分离技术与活菌计数实验教学目的：1学习从泡菜中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。
2用稀释法分离大肠杆菌和酵母菌。
3用平板划线法分离微生物。
实验教学重点：平板划线分离方法。
实验教学难点：转角划线的轻重。
实验用品：1酵母菌。
2已灭菌的LB、YPD固体培养基各1瓶。
3无菌培养皿10套、无菌EP管10支、泡菜样品、天平、称量纸、药匙、试管架、记号笔、涂布器、1ml、10ml移液管，1000ul、200ul枪头和移液器。
4无菌水(90、带玻璃珠) 1瓶。
实验教学方法与手段：板书讲解+演示实验＋学生动手实验教学课时：4课时教学过程：一、实验方法(一)泡菜稀释分离1取泡菜：取表层以下5-10ml处的泡菜10g，泡菜汁10ml，或放在4℃冰箱中暂存。
2制备稀释液(1)制备泡菜悬液：称泡菜10g，或泡菜汁10ml，迅速倒人带玻璃珠的无菌水瓶中，振荡5-10min，使泡菜充分打散，即成为10-1的泡菜悬液。
(2)梯度稀释：用移液器吸10-1的泡菜悬液1ml，放入装有9ml无菌水的试管中，震荡，即为10-2的稀释液，如此重复，可依次制成10-3-10-8的稀释液。
注意：每一个稀释度换用一支移液管。
3混菌法测定菌落数的方法(1)LB：取原液、10-1两管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。
然后取冷却至50℃的MRS培养基，分别倒人以上培养皿中(装量以铺满皿底的2／3为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿平皿的边缘，待琼脂凝固即成乳酸菌平板。
倒平板时要注意无菌操作。
(2)酵母菌：先把冷却至50℃的PDA培养基倒入培养皿中，凝固后，取10-4、10-5两管稀释液各200ul，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释险接两个平皿。
接着，用涂布棒（灭菌）把菌液涂布均匀，即为酵母菌平板。
4培养：将接种好的平板倒置，即皿盖朝下放置，于28-30℃中温培养，大肠杆菌和酵母菌均培养1-2d。
平板分离技术与活菌计数实验报告
平板分离技术与活菌计数实验报告篇一：微生物学大实验实验报告微生物学大实验实验题目：土壤微生物的分离纯化与鉴定一．实验目的：1.巩固本学期所学的所有微生物实验操作技能。
2.再次强调无菌操作概念。
3.初步学习微生物鉴定纯化的方法和思路。
4.学会应用相关手册对微生物进行分类。
二．实验原理：1. 培养基的制备、消毒与灭菌：培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。
不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。
所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。
此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
2. 微生物的分离与纯化：自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
土壤是微生物生活的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是及其丰富的。
因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可以从中分离到很多有价值的菌株。
本实验将采用平板划线分离法。
3. 平板分离技术与活菌计数：值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。
有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
微生物的分离纯化：平板分离法
微生物的分离纯化：平板分离法基本原理分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
包括稀释涂布平板法稀释混合平板法平板划线法土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地。
本实验采用三种不同的培养基和方法从土壤中分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。
操作步骤采样：选取校园内或校园附近地点，用无菌药匙，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样约30g，装入事先准备好的无菌瓶内并盖好。
编号并记录地点、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
制备土壤稀释液土壤稀释液的制备和稀释液的取样（建议稀释到10-即可）无菌操作1.取三只无菌培养皿，在皿底用记号笔写上稀释度、组别观察分离出的真菌菌落形态。
稀释混合平板法土壤稀释液的制备和稀释液的取样倒平板的无菌操作将融化的琼脂培养基,冷却至50℃左右(以手背能忍受的温度为准)，在酒精灯火焰旁，右手掌心握住三角瓶的底部，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，灼烧瓶口。
用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15 mL,铺满皿底），迅速盖好皿盖。
左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。
也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。
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实验三微生物分离纯化技术
一、目的要求
掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作
二、实验材料
1、菌种
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基
3、试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅
2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿
三、实验原理
平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。
浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。
最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。
涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。
四、实验过程
（1）稀释平板法
A 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。
先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
B 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边；
C 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。
（2）平板涂抹法
A 每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。
在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释
度、组别、班级。
B 取已熔化的培养基倒入培养皿制成平板。
C 凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释液0.2 mL放在平板上。
D 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。
倒置于37 ℃条件下培养。
（3）平板划线法
A 每组取无菌培养皿2只，在皿底贴上标签，注明事项。
取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。
B 凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－3或10－4）在平板上划线。
连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。
C 划线完毕，盖上皿盖，倒置于37℃温室培养。
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12:0715:13
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