蔗糖酶-酶工程实验

蔗糖酶液 （ml） 0.0 0.05 0.2 0.5 0.05 0.2 0.5 0.05 0.2 0.5 0.02 0.2 0.5
5% 蔗 糖 溶 液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
（ml）
保温时间
立即混匀后，35℃保温 10 分钟
(5) 考马斯亮蓝 G-250 溶液（0.01%）：称取 0.1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml 95%乙醇中，再加入 100ml 浓磷酸（市售质量百分数为 85%），然后加蒸馏水定容至 1000ml。
(6) 3,5-二硝基水杨酸试剂:
3.15 g DNS（3,5-二硝基水杨酸,化学纯）溶于 131 ml 2M NaOH热溶液中（10.48g NaOH溶于 131ml蒸馏水 中），加入 250 ml酒石酸钾钠热溶液（91 g酒石酸钾钠溶于 250 ml蒸馏水中），再加 2.5 ml苯酚（固体加 热）和 2.5 g Na2SO3，溶解后定容到 500 ml，贮于棕色瓶中 7 天后使用。 2、仪器：
由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始 终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。
蛋白质在用有机溶剂沉淀分离后，需要将蛋白质中的有机溶剂除去，常用的办法是透析。透析机可以 除盐，又可以除杂蛋白，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透 析 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0.2mol/L 乙酸缓冲 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
液 （ml）
蒸馏水 （ml） 1.0 0.95 0.8 0.5 0.95 0.8 0.5 0.95 0.8 0.5 0.95 0.8 0.5
以与钙、铜等正二价阳离子迅速形成凝胶。海藻酸钠浓度过大时，凝胶的孔径较小，影响酶与底物的结合；
海藻酸钠浓度较小，凝胶的孔径太小，固定化酶容易流失，所以酶活较低。氯化钙浓度过低时也会导致凝
胶强度太小，孔径过大，包埋不完全，内部的部分酶会损失。
3、蔗糖酶活性测定原理 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶 EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗 糖）的 1,2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解 1mol 蔗糖，就能生 成 2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉（Nelson-Smogyi）试剂比色法，斐林 试剂法等。 本实验采用 3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是 3.5-二硝 基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正 比。因此可利用分光光度计在 520nm 进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干 扰较小。 蔗糖酶活力单位(u)：蔗糖酶在室温(25℃）, pH4.5 的条件下，每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖所需的 酶量(ml)。 蔗糖酶比活力的计算：每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg 蛋白质表示。酶 的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力 的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。 比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白 mg 数，即每 mg 蛋白所含有的酶活力单位数。 比活力＝活力单位/mg 蛋白 4、蛋白质浓度测定原理： Bradford 法是基于考马斯亮蓝 G-250 有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下， 可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速稳定，反应化合物在 465～595nm 有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。因此可检测 595nm 的光吸收值的大 小计算蛋白质的含量。 二、试剂和仪器 1、实验材料 （1）市售蔗糖酶， 95% 乙醇(-20℃）、透析袋；（2）5%蔗糖溶液 500ml；（3）20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 （4）0.2mol/L 乙酸缓冲液（pH 4.5）： A：0.2mol/L NaAC：称取 27.616g NaAC 溶解并定容至 1000ml。 B：0.2mol/L HAC：100ml 乙酸(分析纯)定容至 500ml。 将两者分别取 315ml、185ml 混合，用强碱调 pH 到 4.5。
μmol 的稀释度为宜。读取吸光度值，以吸光度的平均值查标准曲线即可求出酶活力。
蔗糖酶活力单位（U/mL）：酶在 35℃，pH=4.5 条件下，每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖所需酶量。
蔗糖酶活力单位=酶的稀释倍数×(x 微克/180 分子量)/10min/酶液体积
样品
空 白
样品 I（1：200） 样品 II（1：200） 样品 III（1：200） 样品 IV（1：50）
电子天平（称量样品）；10ml 塑料离心管（4 支/组）；高速离心机；恒温水浴箱； 1.5ml 离心管（留样 品Ⅰ、Ⅱ、III 用）及离心管架 ；4℃冰箱；磁力搅拌器；分光光度计；微量移液枪（200ul～1000ul）；电 磁炉及搪瓷缸。 三、实验步骤 1、蔗糖酶的提取：
称取市售蔗糖酶 0.1g，量取 20ml 预冷的 20mmol/L Tris-HCl（pH7.3） 缓冲液溶解，静置 3min 后将 上清转移到 2 支 10ml 离心管中，两支离心管平衡后， 4000r/min 离心 5 分钟，收集上清液并量出体积， 4℃冰箱保存，留 1ml 用于蔗糖酶蛋白含量测定和蔗糖酶活力测定。 2、热处理： 取上一步抽提液（样品 I）20ml，加 4mol/L 的预冷的醋酸(1ml 左右)，使溶液的 pH 值约为 4.5 左右， 迅速放入 45℃恒温水浴中，并用玻璃棒温和搅拌，保温 30 分钟后迅速用冰浴冷却 5 分钟，转移至 10ml 离心管中，平衡后，4000r/min 离心 10 分钟，小心收集上清液（样品Ⅱ）并量出上清液体积 V2，另留 1ml 上清液（样品Ⅱ）放置 4℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定和测定蔗糖酶活力。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀： 将热处理后的上清液用稀醋酸调节 pH 值至 4.5，用 32％的乙醇饱和度除杂蛋白（计算所需 95％乙醇 的量并与初酶液在冰浴中预冷，缓慢滴加预冷的 95％乙醇并不断搅拌。滴加结束后，4℃放置 30 分钟， 于 4000r／min 离心 10min，留取上清液）；再用预冷的 95％乙醇调节酶液到 47.5％的乙醇饱和度，4 ℃放置 30 分钟，于 4000r／min 离心 10min 沉淀蔗糖酶（此时需准确计算出使粗酶液的乙醇浓度达 47.5 ％时所需补加 95％乙醇的体积）。小心弃去上清，在沉淀中加入 4mL Tris-HCl 缓冲液（pH 7.3，20mmol/L） 4、透析 将上述粗酶提取液装入透析袋中，对 20mmol/L Tris-HCl pH 7.3 缓冲液（1000ml）充分透析 5～6 小时 （磁力搅拌，每隔 1 小时更换缓冲液），7000rpm 离心 10min，弃沉淀，取上清液（样品 III）。并取 出 1mL 待测酶液，测定酶的活力和蛋白浓度。 5、测定样品 I、II、III 的蔗糖酶活性 还原糖标准曲线为： 以还原糖（mg 数）为横坐标，A520 值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线.
五、讨论 1.本实验在对蔗糖酶进行初步纯化时的两次蛋白质沉淀的原理是不一样的，第一次是蛋白质在高温条件下 变性失活，第二次是在有机溶剂中沉淀，蛋白质保持原有构型和活性。因为蔗糖酶比较耐高温，可以在 50 摄氏度保持活性，因此蔗糖酶在纯化过程中不会有太大的损失。但是在离心等过程中，为了尽可能地保持 蔗糖酶的活性，还是要在低温中进行。 2.在进行离心操作前，要先对两支离心管进行平衡（要盖上离心管的盖子，因为不同的盖子的质量也是不 一样的），避免离心过程中产生较大噪音甚至损坏离心机。
试管号
1号
2号
3号
4号
5号
6号
葡．萄．糖．浓．度．（．g．．/L．）．
0．
0．．.1． 0．．.1．5． 0．．.2． 0．．.2．5． 0．．.3．
1g/L 葡萄糖标准溶液（ml）
0.00
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
H2O
（ml）
2.0
1.80
1.70
1.60
1.50
1.40
3，5-二硝基水杨酸 （ml）
和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但
此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，
有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
海藻酸钠作为固定化酶的载体，对固定化酶的酶活力有显著影响。海藻酸钠具有强烈的吸附作用，可
3，5-二硝基水杨酸 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
试剂 （ml）
保温时间
在 100℃恒温水浴中加热 5 分钟
蒸馏水 （ml） 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
混匀
A520nm 还原糖（mg） 6、测定样品 I、II、III 的蛋白质含量 0.8ml的样品I、II、III加入 3.2ml的考马斯亮蓝溶液，反应时间为 10min，测定的A595 值，依据上述公式 即可计算出样品的蛋白质含量。
蛋白质浓度标准曲线做法（不做，直接套用公式）： 采用了 Bradford 法，首先配置 1mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）母液，再用灭菌的去离子水依次稀释一 组浓度为 100µg/ml，75µg/ml，50µg/ml，25µg/ml，5µg/ml 的 BSA 溶液，室温反应体系为 0.8ml 的蛋白样 品加入 3.2ml 的考马斯亮蓝溶液，反应时间为 10min，然后在 595nm 波长下测定吸光值，用标准蛋白质量 （µg）为横坐标，用吸光度值为纵坐标，作图，即得到标准曲线，