肿瘤分子生物标志物的流式定量分析

目前，从病理形态学方法对于可能癌变的病例 作出一个确切的诊断标准还十分困难。 研究证明，DNA异倍体的出现可能是癌前病变 发生癌变的一个重要标志物，已有作者对食管、 宫颈、胃、鼻咽、口腔粘膜癌前病变进行了流 式DNA倍体分析研究。 Tedori等应用 FCM 分析了20例胃粘膜萎缩性胃 炎伴不典型增生细胞的DNA倍体，发现DNA异 倍体9例，其中5 例在随诊半年后被病理学确诊 为癌变，发现异倍体与癌前病变细胞不典型增 生程度有关。
一、DNA异倍体

研究证明，大部分恶性肿瘤有DNA含量的异常 改变(DNA含量的增多或减少)，Badogie等报道， 实体瘤的异倍体检出率在60-100%。由于肿瘤 细胞在增殖分裂过程中出现DNA合成的丢失或 不分离，而产生了DNA异常的细胞群，即出现 DNA异常的干系(克隆)，这种DNA异常干系， 即称为DNA异倍体。流式细胞术定量分析DNA 异倍体，应用于肿瘤的早期诊断和预后评价方 面。

作者对208例石蜡包埋组织、和1000 多例食管 脱落细胞的癌前病变细胞流式 DNA 倍体分析 (见表15)，并指出如下诊断标准，供参考。 1.出现DNA异倍体峰位诊断阳性。 2.S期细胞大于15%，G2M期大于10%(突出的 四倍体峰位)诊断为阳性。 3.S期细胞大于 10-15%， 并有突出四倍体峰位， 诊断为可疑癌。 4.GO/1期细胞峰的CV值大于9%，作为参考指 标。


P53基因是近年来发现的具有重要作用的抑癌基 因，定位于人的17号染色体(17、13、1)其早 在1979年就发现了P53基因。 当时是在被恶性转化的细胞内发现，被认为是 一个原癌基因(oncogene)，因此没有引起研究 者的重视，直到1989年，一些科学家的研究有 了新发现，认为P53基因存在两种类型：即野生 型(wild type)和突变型(Mutant type)，这两种 类型的P53基因在人体内具有两种不同的作用。
㈠癌前病变出现DNA异倍体及在癌变 早期诊断的意义。


癌前期病变是肿瘤防治研究中的一个重要课题， 从癌前病变中发现早期癌变的患者，并找出作 为早期癌变的特征性标志物，是人们一直努力 探寻的方法，使肿瘤得到早期发现、早期治疗 具有重要意义。 研究发现，在众多的癌前病例中，并非所有的 癌前病变都将发生、发展成为癌症。哪些癌前 病变将发生癌变，哪此将不发生癌变，是人们 正在努力寻找作为癌变的恃征性标志物。


我们的研究结果(见表16)，表明DNA异倍体可 能是重要的癌变标志物。


从癌前病变中发现早期癌变和潜在癌变病例， 并对其作出一个早期预警性诊断，已成为人们 十分关注的研究焦点，通过对癌前病变细胞 DNA异倍体的FCM检测，可能有助于对癌前病 变作出病理学诊断的超早期癌诊断。 研究发现癌前病变细胞DNA含量与病变不典型 增生程度密切相关(见表17)。DNA指数随不典 型增生增高逐渐渐升高，从DNA含量进一步说 明癌变并非由正常细胞突发为癌细胞，而是经 过一个量变到质变的过程，癌前病变即处于量 变过程。


近年来已经发现多种肿瘤生物分子标志物，已 将标志物应用于肿瘤诊断、判定疗效、预测预 后和转移等方面，且有较大的肿瘤临床和研究 的实用价值，并在研究癌变的发生和发展机制 中引起人们的极大关注，特别在癌前期病变肿 瘤标志物研究中，成为肿瘤防治研究的热点之 一，已经显示出在癌变研究中具有重要意义。 流式细胞应用于肿瘤分子生物标志的检测已有 较多的文献报道，如DNA异倍体、激素受体、 癌基因和抗癌基因蛋白产物等，发现这些标志 物与恶性肿瘤的发生、发展和细胞的分化、分 级、转移和预后有一定相关性，现分述如下：
二、抑癌基因P53蛋白

从生物分子水平研究证明，肿瘤是基因性疾病， 是由某些致癌基因激活或抑癌基因的失活(突 变或丢失)及其功能的调控失常而促发肿瘤， 当各种致癌因子参与下诱导癌基因和抑癌基因 的异常改变，其效应分子的基因蛋白产物的过 量表达，它们相互之间在肿瘤的发生发展上起 着重要作用。


因此，对癌基因与抗癌基因与癌变的关系研究 成为肿瘤研究的热点之一，已随着分子生物技 术的迅速发展和单克隆抗体技术的应用，大量 具有高度特异性识别肿瘤细胞内外抗原的单克 降抗体出现，为肿瘤研究寻找到了很多新的标 志物。 癌基因和抑癌基因在人体组织的调整作用，是 通过其效应分子蛋白质产物。近年来，由于生 产出多种高度特异的癌基因蛋白产物的单克隆 抗体，为探索癌基因与肿瘤发生、发展以及与 肿瘤的生物学特性关系的研究辟出了新径。


野生型P53可以阻止细胞发生恶性转化，并可阻 止受损伤细胞 DNA无法修复的细胞DNA复制过 程，引起细胞凋亡 (Apoptosis)或程序性细胞死 亡(program cell death. pcd)。这一发现使人们 认识到野生型P53的一个重要功能是作用细胞增 殖周期的一个调控点(check-point)。 野生型 P53 基因的丢失和突变，使 P53基因正常 功能丧失，而成为突变型P53基因，科学家研究 认为， 突变型 P53 可导致细胞增殖功能的增强。 突变后的P53不但失去了正常调控细胞增殖分化 的功能，而且可变为一个直接的肿瘤基因， 对 细胞恶性转化起促进作用。


出现DNA异倍体细胞群则证明从量变到质变的 过程，Tedori 等认为，当癌前病变出现 DNA异 倍体时， 说明已发生癌变或已具有潜在癌变的 可能性， 尽管还不具备病理形态学的癌变诊断 标准， 大多数研究者还发现，癌前病变不典型 增生程度越重，DNA非整倍体出现率越高，不 典型增生程度越重，癌变的发生率越高。 由此可见，癌前病变出现DNA非整倍体对预测 和诊断癌变是一个重要而有价值的标志物， 对 于形态学上诊断为癌前病变的病例， 有必要进 行 DNA 倍体的检测， 对出现DNA异倍体病人， 应 进行密 切的随访， 及时发现早期癌 变征象， 做到早诊断、早治疗。

近年来的研究发现，在人类大多数恶性肿瘤中均存在 P53突变基因，而且不同的致癌物可引起不同的特异性 突变谱。因此P53基因的突变已引起肿瘤研究者极大关 注。