荧光分析法基本原理与定量分析方法
荧光光谱分析法及F7000光度计的使用20120602
~10-9s 。
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二、荧光的激发光谱与发射光谱
荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱和 发射光谱（荧光光谱）。 （1）荧光的激发光谱：表示不同激发波长下 所引起物质发射某一波长荧光的相对率。 绘制激发光谱：固定发射波长(选最大 发射波长),然后以不同波长的入射光激发荧 光物质，以荧光强度F对激发波长l作图， 即为激发光谱。
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二、荧光的激发光谱与发射光谱
激发光谱曲线的最高处，处
于激发态的分子最多，荧光
强度最大，称为最大激发波 长 lex
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二、荧光的激发光谱与发射光谱
（2）荧光的发射光谱（荧光光谱） 荧光光谱表示在所发射的荧光中各种 波长组分的相对强度。绘制发射光谱时， 使激发光波长固定在lex处，然后对发射光 谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度， 以荧光强度F 对发射波长l作图，得发射光 谱图（即荧光光谱）。
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二、荧光效率及其影响因素
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长 比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接 近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。 拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼 光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换 溶剂或改变激发光波长。
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二、荧光效率及其影响因素
a:320nm或350nm为激发光， 荧光峰总是在448nm。 b:将空白溶剂分别在320n m及350nm激发光照射下 测定荧光，拉曼光波长 分别是360nm和400nm， 400nm的拉曼光较接近4 88nm，对荧光有干扰， 因而影响测定结果。 c：选择320nm为激发光， 对测定无干扰。
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三、荧光分析法的应用
• 有机化合物的分析 为提高测定的灵敏度，有时也将芳 香族化合物与适当试剂反应之后再进行测定。 如水杨酸与铽形成络合物后，荧光 增强，测定灵敏度提高。再如糖尿病研究中 的重要物质阿脲(四氧嘧啶)与苯二胺反应后， 荧光增强，可用于测定血液中低至10-10mol 的阿脲。
荧光分析法
光致发光：
吸收某种波长的光后发射出比吸 收波长更长的光的现象。 (荧光和磷光)
荧光分析法 (fluorormetry)
荧光光谱→定性分析 荧光强度→定量分析 分类： 原子荧光分析、分子荧光分析
紫外-可见荧光分析 红外荧光分析 X射线荧光分析
第一节 基本原理 一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1、分子的电子能级与激发过程
=
hc
E
2、荧光的产生
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
振动驰豫
发生在同一电子能级内，分子通过
碰撞以热的形式损失部分能量，从较高
振动能级下降到该电子能级的最低振动
能级上。无辐射跃迁。
内转换
即激发态分子将多余的能量转变 为热能，从较高电子能级降至较低的 电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。
OHH+
NH-
pH<2
pH7~12 兰色荧光
pH>13
荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与 溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度 降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭 的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以 及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
外转换
荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降 至第一电子激发单重态的最低振动能 级后，仍不稳定，停留较短时间后
（约 10-8 s ，称作荧光寿命），以光
辐射形式放出能量，回到基态各振动
能级，这时所发射的光称为荧光。
系间跨跃
第一电子激发态的最低振动能级经过另一 个无辐射跃迁转移至激发三重态，称为系间跨 跃。
荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
仪器分析课件12荧光分析法
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
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原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
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3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
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二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
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2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
荧光分析法的原理和应用有哪些
荧光分析法的原理和应用有哪些1. 原理荧光分析法是一种利用物质在受到激发后发射荧光的光谱分析方法。
其原理是通过物质在受到光激发后，能量被转移到某些特定的电子能级上，然后由该能级经历跃迁发射荧光的过程。
荧光分析法的原理主要包括下面几个方面：•荧光激发：将样品暴露在激发光源下，激发光的特定波长和强度能够激发荧光染料或被测物质中的相应电子跃迁。
•荧光发射：物质受到激发后，电子由激发态返回基态，产生特定波长的荧光发射。
荧光的发射波长和强度与样品中的化学成分和浓度有关。
•荧光信号检测：通过荧光光谱仪等检测设备测量样品发出的荧光信号，获得荧光强度和发射波长的信息。
2. 应用荧光分析法在许多领域有着广泛的应用。
下面列举了几种常见的应用：2.1 荧光显微镜荧光显微镜利用荧光分析法原理，结合显微镜观察和荧光的发射特性，可以用于生物学、医学、材料科学等领域的研究。
通过标记荧光染料来观察或追踪细胞、分子或其他生物体的结构和功能。
2.2 荧光光谱仪荧光光谱仪是一种用于测量样品荧光发射光谱的仪器。
它可以用于分析和定量测量不同类型的化合物，例如荧光染料、生物分子、环境污染物等。
荧光光谱仪广泛应用于分析化学、生物化学、环境科学等领域。
2.3 荧光染料的标记和追踪荧光染料在生物医学研究、生命科学和分子生物学等领域中被广泛用作标记和追踪剂。
通过将荧光染料与分析目标物相结合，可以实现对生物分子、细胞、组织和病原体等的定位和追踪。
2.4 荧光传感器荧光分析法还可以用于制备荧光传感器，用于检测和定量分析化学物质。
这些传感器可以通过与特定的化学物质相互作用，产生特定的荧光响应，从而实现对目标化合物的检测和测量。
2.5 荧光生物成像荧光分析法在生物医学成像中有着重要的应用。
通过标记荧光分子，可以实现对生物体内部结构和功能的成像观察。
荧光生物成像技术在癌症研究、药物筛选、生物反应动力学等方面具有潜在的应用价值。
3. 总结荧光分析法是一种基于荧光现象的光谱分析方法，具有灵敏度高、选择性好、非破坏性等优点。
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
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的长（10-4~10s）
基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的
改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻
跃迁
S0→S1、S2 允许跃迁；
S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入
(见能级图)；进入的几率小；
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
12
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
荧光分析法基本原理和定量分 析方法
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
1
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
2
由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就
下村修现年80岁的下村修1928 发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光
年出生于日本京都府，1960年 蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞
获得名古屋大学理学博士学位后 的遗传信息之中，让其随着这些需要
赴美，先后在美国普林斯顿大学、 跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长大
波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物 的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症对
实验所工作。他1962年从一种 大脑造成的损害、观察有害细菌的生
水母中发现了荧光蛋白，被誉为 长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何
生物发光研究第一人。
产生分泌胰岛素的β细胞。
·沙尔菲马丁·沙尔菲出生于194761岁，是美国哥伦比亚大学生物学 教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光 的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。
8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁·沙尔菲和日 本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学 奖，将均分1000万瑞典克朗（约合140万美元）奖金。帮助他们获 奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实验带来革命，它发 出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞 层面的诸多反应。
激发三重态,用符号T表荧示光分。析（法基T本1原T理2和定T量3…分析）方
法
10
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
电子能级的多重性 M=2S+1
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应
单重态能级低；
大多数有机分子的基荧光态分处析法于基本单法原理重和态定量；分析方
11
小结：激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激
发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的
激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
7
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限 约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到1010甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
8
第一节
荧光分析法的基本原理
2008年诺贝尔化学奖 荧光分析法基本原理和定量分析方 法
3
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
4
澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海里 动物通过发出色彩鲜艳的 荧光来恐吓警告敌对者或 者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
5
green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层→基态
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 l3的荧光，10-7~10-9s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
l3 > l 2 > l 1 ； 荧光分析法基本原理和定量分析方
法
15
外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1 S0
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
9
分子吸收辐射后
S0
电子被激发且不发生自旋方向的改变 ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为 激发单重态,用符号S表示。 （S1 S2 S3…）
电子被激发且伴随着自旋方向的改变
ms为+1/2和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l4
l1
l2
l3
激发态→基态的能量传递途径√
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
★分子能级比原子能级复杂 ★在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级 ★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层
★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态, 用符号S0表示
磷光：10-4～10s； 第荧一光激分析发法基三本原重理态和定的量分最析低方 振动能级→基态
法
14
辐射和非辐射能量传递过程√
振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s
内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激
1 nm
荧光分析法基本原理和定量分析方
法
6
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。
光致发光√
荧光 fluorescence
磷光 phosphorescence
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进
行物质鉴定和含量测定的仪器方法。