实验二抗体制备和凝集反应沉淀反应共20页
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沉淀反应
二、 絮状沉淀试验
絮状沉淀试验：是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉 眼可见的絮状沉淀物。 方法评价：敏感度较低、简便、受抗原抗体 比例的影响非常明显 应用：性病研究实验室试验（VDRL）、USR、 RPR，本实验只能作为定性或半定量实验方法。
絮 Ag
1:2
状
沉淀线靠近谁浓度则小，沉淀弧趋向谁分子量则大
1表示待检Ag 2表示标准Ag 两条沉淀线互相吻合相连，表明两个抗 原完全相同。 两条沉淀线呈部分相切，表明两个抗
原之间有部分相同。
两条沉淀线交叉而过，表明两个抗原 完全不同。 待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较 低；
1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。
＋
－
对流免疫电泳
• 优点及应用 • 电场限制了抗原抗体运动方向，加速了 反应速度，使反应时间大大缩短了，灵 敏度显著提高了，本法主要用于一些病 原微生物及其他蛋白质抗原的检测。
二、火箭免疫电泳
rocket immnoelectrophoresis，RIE
1、原理
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原 向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动 的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的 沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性 复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗 原量呈正相关。
体量固定，所测吸光度与复合物的量成正比，与
待测抗原量成正比。用已知浓度的抗原标准品建 立标准曲线，根据待测样品的吸光度可得出抗原
的含量。
2、方法：
1) 稀释检测标本和标准抗原（5个浓度） 2) 将稀释标本和标准抗原与适当过量的抗血清混 合反应 3) 在340nm处测各管吸光度（IC：35~100nm，选择 范围：290~410nm）
凝集反应和沉淀反应课件
第五章 凝集反应和沉淀反应 （P37）
凝集反应 (agglutination reaction)
概念：
细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加 入相应抗体，在电解质存在下，两者 特异性结合，出现肉眼可见的凝集现 象。
Ag 凝集原 agglutinogen Ab 凝集素 agglutinin
颗粒性抗原： 凝集反应
原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体 上，检测未知抗原
反向间接血凝试验结果判定
3.间接凝集抑制反应
方法：
待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab
→ +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性 Ag） → 观察是否有凝集现象
凝集为阴性，说明标本中无相应Ag; 不凝集为阳性，说明标本中有相应Ag
如： 用胶乳凝集抑制试验检测尿液 中绒毛膜促性腺激素（HCG）
体液免疫测定种类及敏感度
反应名称 抗原 结果 敏感度（m g/ml)
直接凝集 颗粒 凝集
0.5~1.0
间接凝集 抗原 现象
0.001~0.003
环沉
20~30
双扩
可溶 沉淀
3~5
单扩
抗原 现象
12~110
放射扩散
3~10
免疫电泳
50~200
思考题：
1.玻片凝集试验和试管凝集试验的区 别
2.反向间接凝集试验、间接凝集抑制 试验的原理及实例
协同凝集试验
协同凝集试验实际是用已知 抗体检测未知抗原，可用于的 细菌、病毒的直接检测
5 明胶凝集试验（gelatin-gglutination ,GAT)
属正向间接凝集反应 方法：
粉红色明胶颗粒吸附病毒抗原（称为致敏 Ag颗粒）+待测血清→观察有无凝集现象。 凝集为阳性，说明血清中含相应的病毒Ab; 不凝集为阴性，说明无相应Ab。 用途：常用于抗HIV-1抗体及抗精子抗体的 检测
凝集反应 (agglutination reaction)
概念：
细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加 入相应抗体，在电解质存在下，两者 特异性结合，出现肉眼可见的凝集现 象。
Ag 凝集原 agglutinogen Ab 凝集素 agglutinin
颗粒性抗原： 凝集反应
原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体 上，检测未知抗原
反向间接血凝试验结果判定
3.间接凝集抑制反应
方法：
待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab
→ +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性 Ag） → 观察是否有凝集现象
凝集为阴性，说明标本中无相应Ag; 不凝集为阳性，说明标本中有相应Ag
如： 用胶乳凝集抑制试验检测尿液 中绒毛膜促性腺激素（HCG）
体液免疫测定种类及敏感度
反应名称 抗原 结果 敏感度（m g/ml)
直接凝集 颗粒 凝集
0.5~1.0
间接凝集 抗原 现象
0.001~0.003
环沉
20~30
双扩
可溶 沉淀
3~5
单扩
抗原 现象
12~110
放射扩散
3~10
免疫电泳
50~200
思考题：
1.玻片凝集试验和试管凝集试验的区 别
2.反向间接凝集试验、间接凝集抑制 试验的原理及实例
协同凝集试验
协同凝集试验实际是用已知 抗体检测未知抗原，可用于的 细菌、病毒的直接检测
5 明胶凝集试验（gelatin-gglutination ,GAT)
属正向间接凝集反应 方法：
粉红色明胶颗粒吸附病毒抗原（称为致敏 Ag颗粒）+待测血清→观察有无凝集现象。 凝集为阳性，说明血清中含相应的病毒Ab; 不凝集为阴性，说明无相应Ab。 用途：常用于抗HIV-1抗体及抗精子抗体的 检测
抗体沉淀反应实验报告
抗体沉淀反应实验报告实验目的本实验旨在通过抗体沉淀反应的方法，从混合溶液中分离出目标蛋白，以验证抗体对特定抗原的选择性结合能力和分离纯化的能力。
实验原理抗体沉淀反应是利用抗体与抗原的特异性结合原理，通过与特定抗原结合的抗体将抗原从混合溶液中沉淀下来，从而实现目标蛋白的分离纯化。
实验步骤如下：1. 将混合溶液与目标抗体充分混合，形成抗原-抗体复合物。
2. 添加沉淀剂（如硫酸铵）使复合物沉淀形成沉淀物。
3. 离心沉淀物，将上清液与下沉淀分离。
4. 用适量的缓冲液将沉淀洗涤，去除非特异性结合物质。
5. 最后重悬沉淀物，并进行后续的分析和检测。
实验材料和设备- 抗原溶液- 目标抗体- 混合溶液- 12孔离心管- 离心机- 分光光度计- 蛋白测定试剂盒实验步骤1. 准备混合溶液：将抗原溶液与混合溶液按一定比例混合均匀。
2. 添加目标抗体：将目标抗体逐滴加入混合溶液中，充分混合反应。
3. 沉淀产物的制备：添加适量硫酸铵至混合溶液中，使复合物沉淀生成。
4. 离心分离：将混合溶液转移到12孔离心管中，离心机设定合适的速度和时间，离心使沉淀物沉淀到离心管底部。
5. 沉淀物洗涤：将上清液倒出，加入适量的缓冲液轻轻洗涤沉淀物，去除非特异性结合物质。
6. 沉淀物重悬：将洗涤好的沉淀物加入适量的缓冲液中，轻轻振荡使其重悬形成目标蛋白溶液。
实验结果与分析本实验利用抗体沉淀反应成功分离得到目标蛋白。
利用分光光度计对沉淀物进行测定，得到其吸光度值为0.8。
通过蛋白测定试剂盒对目标蛋白的浓度进行测定，浓度为2 mg/ml。
结论本实验采用抗体沉淀反应成功分离纯化了目标蛋白，并通过吸光度测定和蛋白浓度测定验证了抗体沉淀反应的有效性。
抗体沉淀反应是一种简单可靠的蛋白质分离方法，具有很高的特异性和选择性，可以应用于生物医学研究和生物工程领域。
实验总结本次实验通过抗体沉淀反应方法成功分离了目标蛋白，验证了该方法的有效性。
实验过程中，应严格控制实验条件，充分混合抗体和抗原，并正确选择沉淀剂和洗涤缓冲液，以确保分离的目标蛋白质的纯度和活性。
最新5实验五经典免疫学检测技术：抗原抗体凝集实验和抗原抗体沉淀实验课件PPT
注意2：看并列词组同它相关的句子成分搭 配是否完全恰当。
一.“和”字（3）
1、通过检查，大家讨论、发现、解决了课外活动 中的一些问题。
2、产品要赢得消费者的喜爱，厂家必须在售后、 生产、销售等各个环节下足功夫，真正为消费者 着想。
3、人生价值和意义，其实并不在于别人对自己 如何膜拜、崇敬、羡慕，而在于自己对社会，对 历史的进步和发展作出何种贡献。
高考真题
（13江西）B.教育主管部门要求，各级各类学校学生的生 活用品以及床上用品都应由学生自主选购，不得统一配备。
（13四川）D.2013年财富全球论坛是成都自改革开放以 来举办的具有里程碑意义的国际盛会，是成都推进和发展 国际化建设进程面临的重大历史性机遇。
（13辽宁）A. 第二十五届阿姆斯特丹国际记录片电影节 12天里吸引了20多万名观众，来自40多个国家的近2500 名电影人、300多部电影前来参与。
注意3：看并列词组内部的逻辑顺序是否恰 当。
一.“和”字（4）
1.他背着总经理和副总经理偷偷地把这笔钱分别 存入了两家银行。 2.这次外出比赛，我一定说服老师和你一起去， 这样你就不会太紧张了，可以发挥得更好。 3.因患病住院，83岁高龄的黄昆和正在美国的姚 明没能到场领奖。
注意4：出现并列的多个人或物时，看是否 有歧义
A
+抗A血清
+抗B血清
B
3.实验方法
（3）手持玻片，前后左右轻轻转动，促 其充分混匀。
A
B
不凝集（-） 凝集（+）
•如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不 等的红色凝集块者，即为红细胞凝集；如混合液仍呈均匀 混浊状，则为不凝集。
4.实验结果
记录受检者红细胞凝集情况，根据 ABO血型鉴定表，判断受检者的血型。
一.“和”字（3）
1、通过检查，大家讨论、发现、解决了课外活动 中的一些问题。
2、产品要赢得消费者的喜爱，厂家必须在售后、 生产、销售等各个环节下足功夫，真正为消费者 着想。
3、人生价值和意义，其实并不在于别人对自己 如何膜拜、崇敬、羡慕，而在于自己对社会，对 历史的进步和发展作出何种贡献。
高考真题
（13江西）B.教育主管部门要求，各级各类学校学生的生 活用品以及床上用品都应由学生自主选购，不得统一配备。
（13四川）D.2013年财富全球论坛是成都自改革开放以 来举办的具有里程碑意义的国际盛会，是成都推进和发展 国际化建设进程面临的重大历史性机遇。
（13辽宁）A. 第二十五届阿姆斯特丹国际记录片电影节 12天里吸引了20多万名观众，来自40多个国家的近2500 名电影人、300多部电影前来参与。
注意3：看并列词组内部的逻辑顺序是否恰 当。
一.“和”字（4）
1.他背着总经理和副总经理偷偷地把这笔钱分别 存入了两家银行。 2.这次外出比赛，我一定说服老师和你一起去， 这样你就不会太紧张了，可以发挥得更好。 3.因患病住院，83岁高龄的黄昆和正在美国的姚 明没能到场领奖。
注意4：出现并列的多个人或物时，看是否 有歧义
A
+抗A血清
+抗B血清
B
3.实验方法
（3）手持玻片，前后左右轻轻转动，促 其充分混匀。
A
B
不凝集（-） 凝集（+）
•如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不 等的红色凝集块者，即为红细胞凝集；如混合液仍呈均匀 混浊状，则为不凝集。
4.实验结果
记录受检者红细胞凝集情况，根据 ABO血型鉴定表，判断受检者的血型。
凝集反应和沉淀反应
21
自身红细胞凝集试验
RBC为未经致敏 的受检者新鲜红 细胞，试剂：抗 人O型红细胞的 单克隆抗体
临床应用： HIV检测 HBV检测
22
四、胶乳凝集试验
致 敏 于 胶 乳 颗 粒
23
24
五、明胶凝集试验
将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明 胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用 时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉 眼可见的粉红色凝集
抗体球蛋白
带负电荷较少，籍 ＋
电渗作用向负极泳
动
43
对流免疫电泳
结果分析： ✓ 无沉淀线出现则表明无相
应的抗原。 ✓ 沉淀线位于抗原抗体孔中
间，说明两者比例较适合 。 ✓ 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
44
二、火箭免疫电泳
+
Ab
-
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 注：只能测定ug/ml以上的含量
反应特点：
IgM 的作用比IgG大数百倍 IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不完全抗 体
5
可见反应形成
6
第二节 直接凝集反应和间接凝集反应
一、直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用
下，出现肉眼可见的凝集现象
常用的凝集试验有玻片法和试管法
25
第三节 抗球蛋白参与的血凝试验
抗球蛋白试验是 抗球蛋白参与的 间接血凝试验， 又称Coombs试验
直接Coombs试验 间接Coombs试验
26
（一）直接Coombs试验
抗球蛋白抗体
全血操作
检测红细胞上不完全抗体
应用：检测新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自
自身红细胞凝集试验
RBC为未经致敏 的受检者新鲜红 细胞，试剂：抗 人O型红细胞的 单克隆抗体
临床应用： HIV检测 HBV检测
22
四、胶乳凝集试验
致 敏 于 胶 乳 颗 粒
23
24
五、明胶凝集试验
将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明 胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用 时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉 眼可见的粉红色凝集
抗体球蛋白
带负电荷较少，籍 ＋
电渗作用向负极泳
动
43
对流免疫电泳
结果分析： ✓ 无沉淀线出现则表明无相
应的抗原。 ✓ 沉淀线位于抗原抗体孔中
间，说明两者比例较适合 。 ✓ 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
44
二、火箭免疫电泳
+
Ab
-
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 注：只能测定ug/ml以上的含量
反应特点：
IgM 的作用比IgG大数百倍 IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不完全抗 体
5
可见反应形成
6
第二节 直接凝集反应和间接凝集反应
一、直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用
下，出现肉眼可见的凝集现象
常用的凝集试验有玻片法和试管法
25
第三节 抗球蛋白参与的血凝试验
抗球蛋白试验是 抗球蛋白参与的 间接血凝试验， 又称Coombs试验
直接Coombs试验 间接Coombs试验
26
（一）直接Coombs试验
抗球蛋白抗体
全血操作
检测红细胞上不完全抗体
应用：检测新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自
凝集反应、沉淀反应
2
当抗原与相应抗体结合时，抗体的交联作 用克服了抗原颗粒表面的Z电位，而使颗粒 相互靠拢，聚集在一起。 当抗体的分子太少或分子量小，不能克服 相当厚度的离子云层时，则不能使颗粒聚 集。在凝集反应中IgM的作用远大于IgG。 为促使凝集现象的出现，可采取以下措施： 1、增加蛋白质和电解质，缩短颗粒间的距 离；2、增加溶液的黏稠度；3、用胰酶和 神经氨酸酶处理；4：以离心的方式克服颗 粒间的排斥力。
第五章
凝集反应
颗粒性抗原与特异性抗原结合后，在适当 的电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现 象，称为凝集反应。 可溶性抗原或抗体与载体颗粒结合形成致 敏颗粒后，与相应的抗原或抗体结合，也 能发生凝集反应。
1
第一节 凝集反应的特点 凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗 体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的 凝集现象。 颗粒性抗原在悬液中带负电荷，周围吸引 一层与之牢固结合的正离子，外面又排列 一层松散的负离子，构成一个双层电子云。 在松散层内界和外界间的电位差形成Z电位。 溶液中负离子强度越大，Z电位也越大，Z 电位使颗粒间互相排斥。
示意图
标准品抗原浓度测定
抗原浓度 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找
不同病人抗原浓度测定
相应抗原浓度
35
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原 时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原 扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
36
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以 上,可见T3为直线，T1为反抛物线
当抗原与相应抗体结合时，抗体的交联作 用克服了抗原颗粒表面的Z电位，而使颗粒 相互靠拢，聚集在一起。 当抗体的分子太少或分子量小，不能克服 相当厚度的离子云层时，则不能使颗粒聚 集。在凝集反应中IgM的作用远大于IgG。 为促使凝集现象的出现，可采取以下措施： 1、增加蛋白质和电解质，缩短颗粒间的距 离；2、增加溶液的黏稠度；3、用胰酶和 神经氨酸酶处理；4：以离心的方式克服颗 粒间的排斥力。
第五章
凝集反应
颗粒性抗原与特异性抗原结合后，在适当 的电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现 象，称为凝集反应。 可溶性抗原或抗体与载体颗粒结合形成致 敏颗粒后，与相应的抗原或抗体结合，也 能发生凝集反应。
1
第一节 凝集反应的特点 凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗 体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的 凝集现象。 颗粒性抗原在悬液中带负电荷，周围吸引 一层与之牢固结合的正离子，外面又排列 一层松散的负离子，构成一个双层电子云。 在松散层内界和外界间的电位差形成Z电位。 溶液中负离子强度越大，Z电位也越大，Z 电位使颗粒间互相排斥。
示意图
标准品抗原浓度测定
抗原浓度 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找
不同病人抗原浓度测定
相应抗原浓度
35
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原 时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原 扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
36
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以 上,可见T3为直线，T1为反抛物线
实验二沉淀反应
实验二
沉淀反应
一、实验内容
1.双向琼脂扩散试验(小组做)
2.单向琼脂扩散试验(示教) 3.免疫电泳(示教) 4.火箭电泳(示教) 5.尿液HCG检测(胶体金免疫法 ) (小组操作) 6.录像：免疫反击战
免疫标记技术
沉淀反应
二、目的与要求
1.掌握单扩、双扩基本原理、方法、结果
分析及应用。
2.熟悉免疫电泳基本原理及应用。
用途：抗原或抗体的检测，定性或可粗略定量。
缺点：需时长，灵敏度不高。
3.单向琼脂扩散试验（示教）
Ag稀释度
1 :80 1 :40
1 :20
1 :10
用途：已知抗体测抗原，定量实验； 缺点：耗时长。
4.免疫电泳（示教）
1
2
先Ag电泳，后扩散。
注意：1、2孔为Ag样本孔。
免疫电泳的用途：
A.用于某种蛋白缺乏的疾病的诊断；
B.用于抗原纯度的定性分析。
5.火箭电泳（示教）
火箭电泳＝单向琼脂扩散＋电场 用途：已知抗体测抗原，定量实验；
优点：耗时短，反应敏感性好。
四、操作内容
1.甲胎蛋白(AFP)的检测（小组操作）
（1）材料：
A.待测Ag： AFP可疑血清； B.阳性对照：AFP阳性血清； C.阴性对照：生理盐水（NS）
早早孕HCG胶体金试纸,采用了双抗体夹心 法的检测模式。
HCG金标试纸
带条中含有均匀分布的胶 体金标记的鼠抗人HCG单抗 1.鼠抗人HCG单抗 (固定的检测线) 2.羊抗鼠IgG(固定的质控线)
标志线
尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG结合形成免疫复合物； 随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色
在检测线未结合的金标记鼠抗人 HCG 单抗 (IgG) 随着尿液上行 , 到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质控对照。
沉淀反应
一、实验内容
1.双向琼脂扩散试验(小组做)
2.单向琼脂扩散试验(示教) 3.免疫电泳(示教) 4.火箭电泳(示教) 5.尿液HCG检测(胶体金免疫法 ) (小组操作) 6.录像：免疫反击战
免疫标记技术
沉淀反应
二、目的与要求
1.掌握单扩、双扩基本原理、方法、结果
分析及应用。
2.熟悉免疫电泳基本原理及应用。
用途：抗原或抗体的检测，定性或可粗略定量。
缺点：需时长，灵敏度不高。
3.单向琼脂扩散试验（示教）
Ag稀释度
1 :80 1 :40
1 :20
1 :10
用途：已知抗体测抗原，定量实验； 缺点：耗时长。
4.免疫电泳（示教）
1
2
先Ag电泳，后扩散。
注意：1、2孔为Ag样本孔。
免疫电泳的用途：
A.用于某种蛋白缺乏的疾病的诊断；
B.用于抗原纯度的定性分析。
5.火箭电泳（示教）
火箭电泳＝单向琼脂扩散＋电场 用途：已知抗体测抗原，定量实验；
优点：耗时短，反应敏感性好。
四、操作内容
1.甲胎蛋白(AFP)的检测（小组操作）
（1）材料：
A.待测Ag： AFP可疑血清； B.阳性对照：AFP阳性血清； C.阴性对照：生理盐水（NS）
早早孕HCG胶体金试纸,采用了双抗体夹心 法的检测模式。
HCG金标试纸
带条中含有均匀分布的胶 体金标记的鼠抗人HCG单抗 1.鼠抗人HCG单抗 (固定的检测线) 2.羊抗鼠IgG(固定的质控线)
标志线
尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG结合形成免疫复合物； 随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色
在检测线未结合的金标记鼠抗人 HCG 单抗 (IgG) 随着尿液上行 , 到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质控对照。
病原生物与免疫学实验免疫实验二：沉淀反应与溶血试验
Ab
？
Ag
标本
阳性对照
Ab
？
Ag
：标本中无Ag
Ab
？
Ag
：标本中有Ag （相同抗原?）
2、双向琼脂扩散试验（定性） （请按照实验指导讲义方法进行操作）来自Ab？Ag
标本
阳性对照
Ab
？
Ag
：标本中无Ag
Ab
？
Ag
：标本中有Ag （相同抗原）
1. Make a agar plate (without Ab or Ag)
溶血素 SRBC
不溶血 （标本中有 Ag）
？ 无Ag Ab
补体
溶血素 SRBC
溶血 （标本中无 Ag）
无沉淀线：无Ag，无AFP）
（二）补体参与的免疫反应
1、溶血反应
补体 SRBC + Ab
SRBC-Ab
（溶血素）
溶血
请按照实验指导讲义方法进行操作
2人/组 注意观察溶血现象 请分析：为何第3、4管不溶血，分别缺什么成分？
2、补体结合试验（检测原理）
反应系统（待测系统）
？ 有Ag Ab
补体
指示系统
？
Ag
：no Ag(AFP) in sample serum
Ab
？
Ag ：same Ag(AFP) in sample serum
Result (2): Ag Ab Ag
：no Ag(AFP) in sample serum
Ag
?
?
Ab
?
?
Ag
：same Ag(AFP) in sample serum
＋
Ab
Ag
－ pH 8.6
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Ⅰ 单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
Ⅱ 双向琼脂扩散实验:
方法：
1. 微波炉中彻底融化1% 琼脂
2. 取5ml 琼脂均匀铺在载玻片上
凝固
3. 在琼脂板上打5个孔
4. 在孔中加入相应样品 5. 37℃, 孵育24h
Ag1 Ag2
4. 预期结果
上清 清亮 轻度混浊 中等混浊 混浊 与对照相同
沉淀 大的凝集块 大多凝集管底 小、部分凝集块 很小的凝集颗粒 无凝集现象
凝集程度 ++++ +++ ++ + -
管底沉淀 凝集程度
最高稀释比例
待测血清的滴度
Test 2 沉淀反应
——琼脂扩散实验
沉淀反应:
➢ 经典抗原抗体反应的一种。
抗体滴度：
能产生明显凝集反应的、抗体最高 稀释度的倒数。
1. 实验材料：
灭活的伤寒菌液 (7×108/ml), 待测血清
2. 方法：
1
② 待测血清
0.1
① 生理盐水
(ml)
00.5.9ml
③ 灭活的伤 寒菌液 0.5ml
2
0.5 00.5.5ml
0.5ml
3
0.5 00.5.5ml
0.5ml
4
0.5 00.5.5ml
制备绵羊红细胞溶液20%、 25%、30%、40%
取0.1ml 皮下注射 免疫小鼠
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
实验二抗体制备和凝集反应沉淀反应
•
6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
•
7、心急吃不了热汤圆。
•
8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
•
9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
•
10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
➢
+
可溶性抗原
➢ 分类:
✓ 琼脂扩散 ✓ 环状沉淀反应 ✓ 絮状沉淀反应 ✓ 免疫电泳
相应抗体
沉淀线或沉淀环
Байду номын сангаас
➢ 琼脂扩散实验:
✓ 可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例 下形成沉淀线或沉淀环。
✓ 分类:
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量实验
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性实验
实验二 抗体制备和凝集反应 (2) &沉淀反应
实验二 抗体制备和凝集反应 (2) &沉淀反应
1. 原理:
抗原抗体反应
直接凝集反应
玻片凝集
试管凝集
定性
半定量
1) 玻片凝集反应:
? 已知抗原 + 未知抗体
凝集团块 混浊
2) 试管凝集反应：
定量抗原
+
系列稀释抗体
不同程度的凝集反应 确定抗体的滴度
YES NO
Ag2 Ag1
Ab
注意：
✓ 琼脂板一定平整、光滑 (无气泡). ✓ 琼脂不可过厚 ✓ 孔中液体不可过满
Test 3 再次免疫
2. 方法: 脱纤维绵羊红细胞（SRBC） 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min 弃上清 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min 弃上清
0.5ml
5
0.5 00.5.5ml
0.5ml
弃掉 0.5
6
0.5
0.5ml
抗体稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 对照管
彻底混匀
④
56℃, 1h
3. 注意事项
➢ 标记试管 ➢ 正确使用滴管 ➢ 彻底混匀 ➢ 温度: 56℃ ➢ 记录时间 ➢ 轻拿试管，观察结果，首先观察对照管