细胞侵袭迁移检测
1.2.3 软琼脂集落形成: 参照文献方法[10], 进行软琼脂集落培养实验, 观测PRL-3 siRNA对大肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响.
1.2.4 体外侵袭: 收集转染48 h的细胞, 采用Boyden小室模型[11]检测癌细胞侵袭情况. Boyden小室上室细胞穿过膜上matrigel到膜的下室面, 其数量反映了细胞侵袭能力的大小. 400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数, 以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力. 随机计数5个视野内的细胞数, 取平均值进行统计处理, 每组计数3份样本.
1.2.5 大肠癌细胞裸鼠体内侵袭: 收集各组细胞, 无血清的DMEM洗涤2次后, 准确计数并调整细胞浓度为3×109/L, 将各组细胞接种到裸鼠的皮下, 0.2 mL/只. 28 d后, 断颈处死裸鼠, 解剖裸鼠, 用40 g/L甲醛固定收集的组织, 制片, HE染色, 观察肿瘤细胞在体内有无转移和局部浸润的情况.
.2 软琼脂集落形成实验 大肠癌HCT116细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落. 而经PRL-3 siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少(P<0.05, 图2).
图2?PRL-3 siRNA转染对大肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响.
2.3 PRL-3 siRNA对肠癌细胞侵袭的影响 本研究采用Boyden小室模型方法采用PRL-3 siRNA转染对大肠癌细胞侵袭能力的影响, 结果发现: 与对照组比较, siRNA组穿过滤膜的癌细胞数明显下降, 且与浓度相关(P<0.05, 图3).
图3?PRL-3 siRNA转染对大肠癌HCT116细胞侵袭的影响.
2.4 裸鼠病理组织学 Con-A组和Con-B组癌细胞有较多部位侵犯癌组织周围的横纹肌, 并存在癌细胞侵入血管的现象, 而siRNA转染组未见这些现象. 说明转染组癌细胞体内侵袭能力明显受到抑制.
正常真核细胞, 除成熟血细胞外, 大多须黏附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活, 称为锚着依赖性(anchorage dependence). 肿瘤细胞可以锚着不依赖性生长. 肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少与恶性程度呈正相关. 癌细胞侵袭能力强, 则在软琼脂上形成的集落数目多. 软琼脂集落培养实验和Boyden小室模型实验发现, 经PRL-3 siRNA转染处理的结肠癌细胞软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少, 且呈浓度依赖性. 裸鼠模型实验发现, 对照组癌细胞有多处侵犯肿瘤周围组织, 并存在癌细胞侵入血管的现象, 而PRL-3转染组未出现这些现象. 提示PRL-3下调可抑制大肠癌细胞的体内外侵袭能力.
细胞迁移的实验。
其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。
我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。
材料：
6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）
marker笔
直尺
20微升枪头（灭菌）
无血清培养基
PBS
准备：
所有能灭菌的器械都要灭菌
，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）
流程：
1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。
3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。
如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。
一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。
划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。）
划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为
1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。
2。细胞有极性，方便测量，观察。
3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。
我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。
非常同意，tacthgin战友的思想。其实在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该
是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质，侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说，可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动，是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。