药品中大肠埃希菌检查

药品中大肠埃希菌的检验

(1)按细菌总数测定方法制备供试液。

(2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。

(3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。

(4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。

(5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。

(6)生化试验

①乳糖发酵试验。将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～

48 h。凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。

②靛基质试验。将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。

③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。呈鲜红色或橘红色为阳性反应。呈黄色为阴性反应。

④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。

⑤枸橼酸盐利用试验。将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。

(7)判断结果。经染色镜检证实为G–无芽孢短杆菌，乳糖发酵试验产酸产气，IMVC试验结果为++––或–+––的，可确认供试品中含有大肠埃希菌。

药检中各控制菌检测的注意事项——大肠埃希菌检测

（1）MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株，以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法也能检出。既然药品中不得检出大肠埃希菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌。

（2）配制MUG培养基时，务必校正pH，灭菌后pH不得过7.4，否则pH偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。

（3）培养时间：供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在4h、24h 观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，该延长培养至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的MUG 的属性不完全相同，对底物和底物浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间；温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等；对结果的判断亦有影响。

（4）结果观察：取供试品的MUG试管、阳性对照管。阳性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管，阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦该移去阳性对照管。

（5）药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征有变化时，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选23个以上菌落分别做IMVIC 试验鉴别，挑选菌落越多，挑选阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落IMVIC试验的鉴别，则易漏检。

（6）在IMVIC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。枸橼酸盐利用试验培养时间，原定为2d，根据试验资料，发现培养3d后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养2d是不够的，故试验培养时间改为2—4d。

（7）阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阳性对照菌液的制备、计数及加入含供品的培养基中等操作，不能在检测供试品的无菌室或净化台上进行，必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及操作环境。

（8）在各类供试品中检测大肠杆菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不准抽样复检。检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留 1 个月，复查。