药品中大肠埃希菌检查
大肠埃希菌的鉴定流程及相应试验结果
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药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
本研究旨在探究药品控制菌检查法中，大肠埃希菌的贮藏方法对于其生长、存活及对
药品的感受性等方面的影响。
为了达到这个目的，本文将进行扩散法和过滤法两种大肠埃
希菌的贮藏方案实验。
扩散法实验中，我们随机选取了10个含有大肠埃希菌的琼脂平板培养基，分别将其贮藏于4种不同的条件下：常温下24小时（即室温），4摄氏度低温保存，-20摄氏度冷冻
保存，以及液氮冷冻保存。
在贮藏60天后，我们将这些琼脂平板培养基用于检测大肠埃希菌的生长情况。
结果表明，在4种不同的贮藏条件下，大肠埃希菌的增殖情况均较为正常，但液氮冷冻较其他3种贮藏条件下更有利于大肠埃希菌的生长。
过滤法实验中，我们同样随机选取了10个含有大肠埃希菌的培养基滤膜，分别将其贮藏于与扩散法实验相同的4个不同条件下。
在贮藏60天后，我们采取相同的方法检测滤膜上的大肠埃希菌数量及其感受药品的情况。
结果显示，液氮冷冻保存对于大肠埃希菌的存
活率及对药品的感受性均更有利。
综上，本研究发现液氮冷冻保存对于药品控制菌检查法中大肠埃希菌的贮藏最为适合。
本研究的结果可以为药品的质量控制提供一定的参考。
20版药典大肠埃希菌检查操作规程
20版药典大肠埃希菌检查操作规程以下是一份20版药典大肠埃希菌检查操作规程的示例：1. 实验室准备a. 确保实验室设备、试剂和培养基的准备充足。
b. 检查培养基的质量和有效期限。
c. 清洗和消毒实验台面和工具。
2. 样品准备a. 收集待检样品，如食品、水源等。
b. 如果样品体积较大，将样品切割成适当大小的块。
c. 样品处理前，使用无菌容器收集样品。
3. 样品处理a. 杀菌样品以杀灭大肠埃希菌以外的其他微生物。
可以使用高温杀菌、化学杀菌等方法。
b. 对于液体样品，使用无菌技术将样品转移到含有适当培养基的试管中。
c. 对于固体样品，将一定重量的样品转移到含有适当培养基的培养皿中。
4. 培养与孵育a. 在适当温度下，将培养皿或试管放入培养箱孵育。
大肠埃希菌通常在37℃下生长。
b. 确保培养基含有抑菌物质（如抗生素），以防止其他非大肠埃希菌的生长。
5. 结果解读a. 在孵育一定时间后，观察培养基上是否有典型的大肠埃希菌菌落。
b. 大肠埃希菌菌落通常呈现金黄色、粘液状，有时也可能呈现其他形态。
c. 使用适当的显微镜技术，观察和鉴定菌落形态，并进行进一步的确认。
6. 结果记录和报告a. 记录培养结果和菌落形态的详细描述。
b. 如需要，进一步进行相关确认试验。
c. 根据操作结果，撰写实验报告，并将结果报告给相关人员或部门。
注意事项：- 确保操作过程中的无菌技术和消毒措施。
- 操作过程中遵循安全操作规范，注意个人防护。
- 严格遵守实验室操作流程，减少污染和误差的可能性。
- 如发现培养出大肠埃希菌，及时采取相应的措施，以避免传播和扩散。
药品中大肠埃希菌检查
药品中大肠埃希菌的检验(1)按细菌总数测定方法制备供试液。
(2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。
(3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。
观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。
(4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。
(5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。
(6)生化试验①乳糖发酵试验。
将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～48 h。
凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。
②靛基质试验。
将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。
液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。
③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。
呈鲜红色或橘红色为阳性反应。
呈黄色为阴性反应。
④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。
将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。
培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。
⑤枸橼酸盐利用试验。
将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。
斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中，常常需要对大肠杆菌进行检测和贮藏。
本研究旨在探究不同大
肠杆菌贮藏方法对其生存能力的影响，并为药品控制菌检查提供实用的参考方法。
方法:
1.选择5个大肠杆菌标准品种进行实验，分别为ATCC25922, ATCC8739, ATCC13706, ATCC23256和ATCC8099。
2.分别将这5种大肠杆菌接种于肉汤培养基中，经过孵育后，采用过滤膜法将细菌分
别按不同浓度制成冻干菌粉：10^6CFU/g, 10^7CFU/g, 10^8CFU/g。
3.将制成的冻干菌粉分别保存在常温、冰箱和低温冰箱内，并在保存0、30、60、90、120、150和180天时分别取出1份进行活菌数的检测和分析。
结果:
1.不同浓度的大肠杆菌冻干菌粉在不同贮藏条件下的存活率有所不同，其中随着存储
时间的延长，存活率显著下降。
2.长时间耐受除冰后，低温冰箱存储的大肠杆菌贮藏状态较好，存活率较高。
3.ATCC23256和ATCC8099两种大肠杆菌在低温冰箱中的存活率较高。
结论:
1.大肠杆菌在冻干状态下对贮藏温度较为敏感。
2.长时间耐受除冰后，低温冰箱是一种可靠的大肠杆菌存储方法。
3.对不同种类的大肠杆菌，选择适合它们生存的温度和储存方式是保证其贮藏状态和
活力的关键。
总之，本研究提供了一种科学、实用的大肠杆菌贮藏方法，并为药品控制菌检查提供
了参考建议。
大肠埃希菌的检验原理
大肠埃希菌的检验原理
大肠埃希菌的检验原理主要是基于大肠埃希菌能够产生酶、产生特定代谢产物以及具有一定生理特征等方面进行检测。
1. 酶的检测：大肠埃希菌能够产生β-半乳糖苷酶和大肠埃希菌酶等酶。
常用方法是利用含有染色底物的培养基，如培养基中加入苔藓素和半乳糖时，大肠埃希菌能够分解底物产生酶，使底物变色。
这样可以通过颜色变化来判断培养基中是否存在大肠埃希菌。
2. 代谢产物的检测：大肠埃希菌在产酸过程中会产生大量的氢离子，降低培养基的pH值，可以使用酚红指示剂来检测pH值的变化。
另外，大肠埃希菌还会产生气体，如二氧化碳和氢气，在含有较少营养物质的培养基上可以形成气泡。
这些变化可以作为大肠埃希菌存在的判断依据。
3. 生理特征的检测：大肠埃希菌有一些特有的生理特征，如能够产生胆红素，对产酸、反应pH等均有一定特殊性。
对大肠埃希菌进行生理生化反应、鉴定和分析可以通过不同试剂和培养基来进行。
综合上述三个方面的检测方法，能够较准确地鉴定出是否存在大肠埃希菌。
当然，最常用的方法是利用尿液或食物中的大肠埃希菌进行培养，并在培养基上观察酶活性、产酸、产气等特征变化。
产品中大肠埃希菌的检测
产品中大肠埃希菌的检测1实验目的：检测产品中的大肠埃希菌2实验步骤2.1仪器恒温培养箱（30 —35℃）、生化培养箱（23 —28℃）、微波炉、电磁炉、匀浆仪、恒温水浴、电热干燥箱（250 —300℃）、电冰箱、366nm 紫外灯、蒸汽压力灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。
电子天平或天平（感量0.1g）, pH系列比色计。
锥形瓶、滴管、培养皿、试管、量筒、试管及塞、吸管、载玻片、盖玻片、火柴、记号笔、酒精灯、酒精棉球或碘伏棉球。
无菌氯化钠溶液、无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液、无菌聚山梨酯80、大肠埃希菌、靛基质、接种环、结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄染液培养基：营养肉汤、营养琼脂、胆盐乳糖（BL）培养基、MUG培养基、EMB2.1.10.9%无菌氯化钠溶液:取氯化钠9.0g,加水溶解至1000mL, 121℃灭菌 20min。
2.1.2pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g, 磷酸氢二钠7.23g,氯化钠4.30g,蛋白胨1.0g,加水1000mL，微温溶解，分装，过滤，灭菌。
2.1.3无菌聚山梨酯80氯化钠溶液：取吐温80 1mL加0.9%氯化钠溶液至100mL, 121℃灭菌20min。
2.1.4靛基质试液:取对二甲氨基苯甲醛10.0g,加入戊醇150g, 充分振摇，完全溶解后，取浓盐酸50mL徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。
2.1.5沙黄染液：取沙黄0.25g，加95%的乙醇10mL，使完全溶解后，加水至100mL。
2.1.6结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95%的乙醇20mL使溶解，加1%的草酸铵溶液80mL，混匀。
静置#23使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.7碘试液:取碘化钾2.0g，加水3-5mL溶解,加入碘片1.0g，全部溶解后，加水稀释至300mL，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.8营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，，氯化钠5g，水 1000mL取上述成分，混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,灭菌。
大肠埃希菌的检测
35℃。
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实训器材(qìcái)：
蒸汽灭菌物品： 1.乳糖胆盐发酵(fā jiào)培养基试管10
支 干热灭菌物体： 5mL移液管1支 1mL移液管5支
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流程图：
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甲基伞形酮葡糖苷(tánggān)酸(MUG)
EMB培养18-24h后，检查有无疑似 大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形 态特征见表），若无，判供试品未 检出大肠埃希菌；若有，进一步做 培以养下基试验大肠埃希菌落菌形落态形态特征
呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红
色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色
EMB
中心，圆形，微突起，边缘整齐，表 面光滑，湿润，常有金属光泽。
成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现 出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合， 形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
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伊红美蓝培养基（EMB培养基）
蛋白胨水琼脂培养基100ml，20%乳
糖溶液2ml，2%伊红水溶液2ml，0.5%
美蓝水溶液1ml，将已灭菌的蛋白胨水
琼脂培养基（pH7.6）加热溶化
(rónghuà)，冷却至60℃左右时，再把已
培养基
胨10.0g
硫酸锰0.5mg
硫酸锌0.5mg 硫酸镁0.1g
氯化钠5.0g 氯化钙50.0mg
磷酸二氢钾0.9g 磷酸氢二钠6.2g
亚硫酸钠40.0mg 去氧胆酸钠1.0g
MUG 75mg
水1000mL
除MUG外，取上述成分，混合。微温溶
解，调节(tiáojié)PH7.2-7.4，加入MUG，溶
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检测(jiǎn cè)原理：
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药品中大肠埃希菌的检验
(1)按细菌总数测定方法制备供试液。
(2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。
(3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。
观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。
(4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。
(5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。
(6)生化试验
①乳糖发酵试验。
将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～
48 h。
凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。
②靛基质试验。
将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。
液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。
③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。
呈鲜红色或橘红色为阳性反应。
呈黄色为阴性反应。
④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。
将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。
培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。
⑤枸橼酸盐利用试验。
将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。
斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。
(7)判断结果。
经染色镜检证实为G–无芽孢短杆菌，乳糖发酵试验产酸产气，IMVC试验结果为++––或–+––的，可确认供试品中含有大肠埃希菌。
药检中各控制菌检测的注意事项——大肠埃希菌检测
（1）MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。
除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株，以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。
因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰。
至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法也能检出。
既然药品中不得检出大肠埃希菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌。
（2）配制MUG培养基时，务必校正pH，灭菌后pH不得过7.4，否则pH偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。
（3）培养时间：供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在4h、24h 观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，该延长培养至48h再观察结果。
由于大肠埃希菌各菌株间的MUG 的属性不完全相同，对底物和底物浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间；温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等；对结果的判断亦有影响。
（4）结果观察：取供试品的MUG试管、阳性对照管。
阳性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。
试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管，阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦该移去阳性对照管。
（5）药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响。
在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征有变化时，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选23个以上菌落分别做IMVIC 试验鉴别，挑选菌落越多，挑选阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落IMVIC试验的鉴别，则易漏检。
（6）在IMVIC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。
切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。
枸橼酸盐利用试验培养时间，原定为2d，根据试验资料，发现培养3d后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。
仅培养2d是不够的，故试验培养时间改为2—4d。
（7）阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。
阳性对照菌液的制备、计数及加入含供品的培养基中等操作，不能在检测供试品的无菌室或净化台上进行，必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及操作环境。
（8）在各类供试品中检测大肠杆菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不准抽样复检。
检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留 1 个月，复查。