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大肠埃希菌检查法
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载大肠埃希菌检查法地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容大肠埃希菌检查法Escherichia Coli Test Method1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。
3.责任者QC化验员。
4.程序：4.1.简述4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。
埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。
大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。
在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。
大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。
为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。
MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。
大肠埃希菌的鉴定流程及相应试验结果
大肠埃希菌的鉴定流程及相应试验结果下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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致病性大肠埃希氏菌及其检验
致病性：（1）致 病因素
LT与ST的比较
特性
分子量 耐热性 免疫原性 B亚单位受 体
致病机理
不耐热肠毒素
耐热肠毒素
较大，73000
较小，1500-5000
不耐热
耐热
有
无
肠黏膜GM1神经节苷酯 肠黏膜GM1神经节苷酯
活化细胞腺苷酸环化酶，活化细胞鸟苷酸环化酶，
细胞内cAMP含量升高， 细胞内cGMP含量升高，
原理：伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂。 大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，故可染上酸性染料伊红，又因 伊红与美兰结合（该两种染料即结合成复合物）使大肠菌群产生带 核心的、有金属光泽的深紫色的（龙胆紫的紫色）阳性菌落，从菌 落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。在伊红美兰平板上的典 型菌落呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。 有的由于被检样品影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、 湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。
革兰氏阴性杆菌
革兰氏 阳性杆 菌
大肠杆菌扫 描电镜照片源自大肠杆菌 透射电镜 照片大肠杆菌革兰氏染色照片
大肠杆菌平 板菌落照片
一、埃希氏菌属生物学特性
生化特性
一．可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或 迟缓发酵乳糖；
二．不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致; 三．本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。 四．不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素;
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（二）、分离培养
将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦 康凯或伊红美兰琼脂平板上。 2、于36±1℃培养 18—24小时观察菌落对于污染严重的食品可直接按 划线法接种，不经过增菌过程。不但要注意乳糖发酵 的菌落，同时也要注意乳糖不发酵的菌落。
大肠埃希氏菌O157H7NM检验 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验1 范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM（Escherichia coli O157:H7/NM）的检验方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；b）冰箱：2 ℃～5 ℃；c）恒温水浴箱：46℃± 1 ℃；d）天平：感量0.1 g、0.01g；e）均质器；f）显微镜：10×～100×；g）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或移液器及吸头；h）无菌均质杯或无菌均质袋：容量500 mL；i）无菌培养皿：直径90 mm；j）pH计或精密pH试纸；k）长波紫外光灯：366nm，功率≤6W；l）微量离心管：1.5 mL/2.0 mL；m）磁板、磁板架、样品混合器；n）全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3.1 改良EC肉汤（mEC+n）：见附录A中A.1。
3.2 改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）：见附录A中A.2。
3.3三糖铁琼脂（TSI）：见附录A中A.3。
3.4半固体琼脂：见附录A中A.4。
3.5月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST）：见附录A中A.5。
3.6氧化酶试剂：见附录A中A.6。
3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。
3.8 PBS-Tween20洗液：见附录A中A.8。
3.9亚碲酸钾（AR级）。
3.10头孢克肟（Cefixime）。
3.11 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）。
3.12大肠埃希氏菌O157显色培养基。
3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂。
3.14生化鉴定试剂盒。
3.15抗-E.coli O157免疫磁珠。
第一法常规培养法4 检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序见图1。
大肠埃希氏菌生化鉴定结果
大肠埃希氏菌生化鉴定结果大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，可以引起多种感染性疾病，包括腹泻、尿路感染和食物中毒等。
鉴定大肠埃希氏菌的生化特征可以帮助确定病原菌的身份以及其潜在的耐药性和毒力因子。
本次实验目的是对一株致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，以确认其菌株的性质和特征。
首先，我们进行了气体产生实验。
在Triple Sugar Iron Agar（TSI）培养基中，观察到菌落周围发生了气体产生，此结果表明该菌株具有产气性。
产气性通常意味着大肠杆菌等需要葡萄糖产生酸，进而分解产生气体的细菌。
其次，我们进行了甲烷发酵试验。
在Methyl Red（MR）试剂中，当菌液发酵产酸时，溶液颜色由黄色变成红色。
然而，该菌株在MR试剂中没有产生红色反应，这表明它无法通过甲烷发酵产酸。
这一结果与典型的大肠杆菌不同，因为大肠杆菌通常可以通过此途径产酸。
进一步，我们进行了亮氨酸脱氨酶试验。
使用亮氨酸脱氨酶（LDC）培养基，如果菌株具有亮氨酸脱氨酶活性，菌液会变色。
然而，我们观察到该菌株在培养基中没有出现任何颜色变化，这表明它不具备亮氨酸脱氨酶活性。
亮氨酸脱氨酶活性通常是大肠杆菌的典型特征之一。
此外，我们还进行了尿素酶试验。
使用尿素平板培养基，如果菌株具有尿素酶活性，培养基颜色将由黄色变为粉红色。
然而，我们观察到该菌株在培养基上未显示出任何颜色变化。
这暗示着该菌株可能缺乏尿素酶活性，与大肠杆菌的典型特征不同。
最后，我们进行了青霉素酶试验。
使用青霉素酶试纸进行反应检测，在试纸上出现蓝色点状斑点表示菌株具有青霉素酶活性。
而对于这个菌株，我们观察到在试纸上没有出现蓝色斑点。
这意味着该菌株可能对青霉素类药物敏感，这对于抗生素选择治疗提供了重要信息。
综上所述，通过对致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，我们发现该菌株具有产气性，但与典型的大肠杆菌不同，它不表现出甲烷发酵、亮氨酸脱氨酶和尿素酶活性。
20版药典大肠埃希菌检查操作规程
20版药典大肠埃希菌检查操作规程以下是一份20版药典大肠埃希菌检查操作规程的示例：1. 实验室准备a. 确保实验室设备、试剂和培养基的准备充足。
b. 检查培养基的质量和有效期限。
c. 清洗和消毒实验台面和工具。
2. 样品准备a. 收集待检样品，如食品、水源等。
b. 如果样品体积较大，将样品切割成适当大小的块。
c. 样品处理前，使用无菌容器收集样品。
3. 样品处理a. 杀菌样品以杀灭大肠埃希菌以外的其他微生物。
可以使用高温杀菌、化学杀菌等方法。
b. 对于液体样品，使用无菌技术将样品转移到含有适当培养基的试管中。
c. 对于固体样品，将一定重量的样品转移到含有适当培养基的培养皿中。
4. 培养与孵育a. 在适当温度下，将培养皿或试管放入培养箱孵育。
大肠埃希菌通常在37℃下生长。
b. 确保培养基含有抑菌物质（如抗生素），以防止其他非大肠埃希菌的生长。
5. 结果解读a. 在孵育一定时间后，观察培养基上是否有典型的大肠埃希菌菌落。
b. 大肠埃希菌菌落通常呈现金黄色、粘液状，有时也可能呈现其他形态。
c. 使用适当的显微镜技术，观察和鉴定菌落形态，并进行进一步的确认。
6. 结果记录和报告a. 记录培养结果和菌落形态的详细描述。
b. 如需要，进一步进行相关确认试验。
c. 根据操作结果，撰写实验报告，并将结果报告给相关人员或部门。
注意事项：- 确保操作过程中的无菌技术和消毒措施。
- 操作过程中遵循安全操作规范，注意个人防护。
- 严格遵守实验室操作流程，减少污染和误差的可能性。
- 如发现培养出大肠埃希菌，及时采取相应的措施，以避免传播和扩散。
药品中大肠埃希菌检查
药品中大肠埃希菌的检验(1)按细菌总数测定方法制备供试液。
(2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。
(3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。
观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。
(4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。
(5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。
(6)生化试验①乳糖发酵试验。
将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～48 h。
凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。
②靛基质试验。
将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。
液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。
③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。
呈鲜红色或橘红色为阳性反应。
呈黄色为阴性反应。
④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。
将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。
培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。
⑤枸橼酸盐利用试验。
将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。
斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。
大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌查看法之阳早格格创做Escherichia Coli Test Method1.脚段修坐大肠埃希菌查看法的尺度支配步调.适用于大肠埃希菌查看的支配.QC化验员.4.步调：. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种.埃希菌属除大肠埃希菌中，新近创造有非脱羧埃希氏菌等5个种.大肠埃希菌是人战温血动物肠讲内的栖居菌，随粪便排出体中.正在药品中检出大肠埃希菌，标明该样品受到人战温血动物的粪便传染，即大概传染肠讲病本体.大肠埃希菌除一般大肠埃希菌中尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼女、成人迸收性背泻.为包管人体健壮，心服药品必须查看大肠埃希菌.. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)战靛基量(Indole)考查查看大肠埃希菌是一项新技能，其考验步调为：删菌培植后，转种MUG-蛋黑胨培植基培植，普遍情况下不需要从混同菌中分散单个菌，如MUG、Indole考查为阳性或者阳性即可报告截止.. 本理：利用目标菌规定酶效率的底物的火解产品，爆收颜色或者荧光反应动做指示系统去审定目标菌.真验说明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶.MUG被GUD火解，爆收荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于瞅察，不主瞅性，果而用MUG审定大肠埃希菌已被广大应用于临床、食品、饮火、污火等的检测.简单的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，基于98％的大肠埃希菌其靛基量考查为阳性，故将MUG与靛基量考查分散，比单用MUG可普及大肠埃希菌的检出率.如MUG与Indole考查的反应纷歧致时，则需将供试液的删菌培植物用EMB琼脂仄板分散培植、革兰染色、镜检及死化考查鉴别.该法表里上可使大肠埃希菌的检出率达98％.如仅用IMViC死化考查去鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其截止是含混的.4.2.仪器、设备及东西. 无菌室. 净化处事台. 培植箱(36±1℃). 下压蒸汽灭菌器. 隐微镜(1500X). 微波炉. 恒温火浴（45±1℃）. 离心机(500～4000r/min). μm±μm薄膜及过滤器. 电冰箱. 匀浆仪. 366nm紫中灯. 玻璃器皿、器具4.3.试液、指示液. 0.9％无菌氯化钠溶液与氯化钠，加火使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟.. 靛基量试液与氯化二甲氨基苯甲醛，加进戊醇(或者丁醇)75ml，充分振摇，使真足溶解后，再与浓盐酸25ml缓缓滴进，边加边振摇，免得散热引导溶液色泽变深，或者与对于二甲氨基苯甲醛，加进95％乙醇95ml，充分振摇，使真足溶解后，与浓盐酸20ml缓缓滴进.. 甲基黑指示液与甲基黑，加95％乙醇300ml，使溶解后加火至500ml，即得.. V-P试液α-萘酚乙醇试液：与α－萘酚，加无火乙醇溶解使成100ml.氢氧化钾试液：与氢氧化钾、加火使溶解成100ml.. 革兰染色液.1. 结晶紫染液与结晶紫、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml.将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混同，静置48h，置稀关棕色瓶，可存搁数月..2. 革兰碘液碘、碘化钾、蒸馏火300ml.用少量火溶碘化钾，再加碘，待齐溶后，加蒸馏火至30ml，置棕色瓶备用. .3. 脱色液 95％乙醇.4. 沙黄(番黑)染液沙黄(SafranineO)、95％乙醇10ml、蒸馏火适量，将沙黄加进乙醇中，真足溶解后再加火至100ml. . 亚甲蓝指示液与亚甲蓝，加火溶解使成100ml.. 溴麝香草酚蓝指示液与溴麝香草酚蓝，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加火稀释至100ml.变色范畴pH6.0～7.6(黄→黑). 酸性品黑指示液与酸性品黑，加火100ml溶解，再渐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，曲至溶液呈草黄色；于沸火中脆持15分钟，静置2小时，滤过，即得.变色范畴pH6.0～7.4(黄→黑). . 曙黑钠指示液与曙黑钠，加火溶解使成100ml.. 无菌散山梨酯80-氯化钠溶液与散山梨酯80 1ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟.. 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 与磷酸氢二钠与磷酸二氢钠，加火稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟.. 无菌对于氨基苯甲酸试液与对于氨基苯甲酸，加进含10ml火的具塞试管中，121℃灭菌20分钟.. 中性黑指示液与中性黑，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加火至100ml.变色范畴Ph6.8～8.0（黑→黄）.. 无菌氯化钠-蛋黑胨缓冲液(pH7.0) 与磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钠，蛋黑胨，加火1000ml，加热使溶解，过滤.分拆，灭菌.4.4.培植基. 营养肉汤培植基胨 10g 氯化钠牛肉浸出粉火 1000ml±0.2，分拆，灭菌.. 营养琼脂培植基胨 10g 氯化钠牛肉浸出粉火 1000ml琼脂±0.2，分拆，灭菌.. 胆盐乳糖培植基（BL）胨磷酸二氢钾乳糖牛胆盐氯化钠（或者去氧胆酸钠）()磷酸氢二钾火1000ml±0.2，煮沸，滤浑，加进乳糖、牛胆盐或者去氧胆酸钠，分拆，灭菌.. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β-D-glu-curonide,MUG）培植基胨磷酸二氢钾（无火）硫酸锰磷酸氢二钠（无火）硫酸锌亚硫酸钠40mg硫酸镁去氧胆酸钠氯化钠MUG 75mg氯化钙 50mg 火1000ml±0.1，加进MUG，溶解，每管分拆5ml，灭菌.. 曙黑亚甲基蓝琼脂培植基（EMB）营养琼脂培植基100ml 曙黑钠指示液2ml20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液与营养琼脂培植基，加热凝结后，热至60℃，按无菌支配加进灭菌的其余3种溶液，摇匀，倾注仄皿.. 麦康凯琼脂培植基（MacC）胨1%中性黑指示液3ml乳糖琼脂牛胆盐火1000ml氯化钠±0.2，加进琼脂，加热凝结后，再加进其余各身分，摇匀，分拆，灭菌，热至约60℃，倾注仄皿.. 蛋黑胨火培植基胰蛋黑胨 10g氯化钠 5g火 1000ml±0.1，分拆于小试管，灭菌.. 磷酸盐葡萄糖胨火培植基胨 7g 磷酸氢二钾（K2HPO4）2g葡萄糖 5g 火 1000ml ±0.1，分拆于小试管，灭菌.. 枸橼酸盐培植基氯化钠 5g 枸橼酸钠（无火）2g硫酸镁（MgSO4·7H2O）溴麝香草酚蓝指示液 20ml磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g 琼脂14g硫酸二氢铵（NH4H2PO4） 1g 火1000ml±0.1，加进琼脂，加热凝结，加进指示液，混匀.分拆于小试管，灭菌，造成斜里.注：所用琼脂应不含游离糖，用前用火浸泡浑洗.. 乳糖培植基胨乳糖0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 火1000ml±0.2，加进指示液，分拆于含倒管的小试管中，每管3ml.灭菌.5%乳糖培植基胨溴麝香草酚蓝指示液 6ml氯化钠乳糖 5g磷酸氢二钠火 100ml 除乳糖战指示液中，混同各身分，微温溶解，安排pH 使灭菌后为7.4，加进乳糖/指示液，混同，分拆于含小倒管的灭菌小试管中，115℃灭菌15min.4.5.对于照用菌液与大肠埃希菌[CMCC(B)44102]的营养琼脂斜里培植物少许，交种至5ml营养肉汤培植基内，置36±1℃培植18～24小时，与匀称培植物1 ml用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释造成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数正在搞对于照考查的共时用营养琼脂注皿或者仄板涂布，经培植后计数决定.4.6.准备. 考验量.1. 每批供试品考验量，普遍为10g或者10ml，特殊贵重或者微量包拆的供试品考验量不妨酌减..2. 供试品均须与自2个以上的包拆单位.. 供试液的造备.1. 液体供试品与供试品10ml，加无菌氯化钠-蛋黑胨缓冲液(pH7.0)至100ml，混匀，动做供试液..2. 固体、半固体或者黏稀液供试品与供试品10g，加无菌氯化钠-蛋黑胨缓冲液(pH7.0) 至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或者其余灵验的要领，混匀，动做供试液.需要时加适量的无菌散山梨酯80，并置火浴中适合加温使供试品分别匀称..3. 非火溶性供试品要领1 与供试品5g（或者5ml），加至含凝结的（温度不超出45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸苦油酯、10g散山梨酯80无菌混同物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，缓缓加进45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋黑胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，动做1：20的供试液.要领2 与供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸同丙酯（造法睹无菌查看法中供试品的无菌查看项下）战无菌玻璃珠的相宜容器中，需要时可减少十四烷酸同丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解.而后加进45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋黑胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃与，静置使油火明隐分层，与其火层动做1：10的供试液.以上供试品如吸火伸展，或者粘度过下，可减少稀释剂的量，造成1：20～1：100供试液..4. 含抑菌身分供试品供试品按惯例查看法，加进确定量的对于照菌，不克不迭检出时，标明供试品有抑菌活性.该供试液按以下要领之一或者二种以上要领共同处理后，照章查看.共时搞阳性战阳性对于照.稀释法与确定量的供试液交种到较大概积的培植基中，使该供试液稀释至不具抑菌效率的浓度.离心重法与一定量的供试液，500转/分散心3分钟，与局部上浑液混同.用于细菌查看.薄膜过滤法与确定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌支配加进拆有曲径为47mm、孔径不大于±μm 微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂浑洗滤膜，屡屡很多于100ml，将培植基加进滤器或者与出滤膜，加进删菌培植基中.中战法与确定量含磺胺类的供试品，于100ml删菌液(含1％对于氨基苯甲酸约1～5ml)中，含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培植基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量散山梨酯80等表面活性剂的100ml删菌液中(表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌效率).重降法与确定量供试液，自然重降5min，与表层液于100ml删菌液中，本法适用于易溶于火的抗菌造剂.4.7.查看要领考证正在修坐供试品的大肠埃希菌查看法或者本查看法的考验条件爆收改变大概效率考验截止的准确性时，应付于供试品的抑菌活性及查看法的稳当性举止考证.考证考查按供试液的造备战大肠埃希菌查看法所确定的要领举止.. 考证要领.1. 考查组与确定量供试液及10-100cfu考查菌加进删菌培植基中，依大肠埃希菌查看法举止查看.当采与薄膜过滤法时，与确定量供试液，过滤，浑洗，考查菌应加正在末尾一次浑洗液中，过滤后，注进删菌培植基或者与出滤膜交种到删菌培植基中..2. 阳性菌对于照组创造阳性菌对于照组是为了考证大肠埃希菌查看法的博属性.要领共考查组，考证大肠埃希菌时的阳性对于照菌采与金黄色葡萄球菌.阳性对于照菌不得检出.. 截止推断阳性菌对于照组不得检出阳性对于照菌.若考查组检出考查菌，按此供试液造备法战大肠埃希菌查看法举止供试品的大肠埃希菌查看；若考查组已检出考查菌，应采与培植基稀释法、离心重淀集菌法、薄膜过滤法、中战法等要领或者共同使用那些要领与消供试品的抑菌活性，偏偏重新举止要领考证.考证考查也可与供试品的大肠埃希菌查看共时举止.4.8.支配步调. 考验步调.1. 阳性对于照考查各供试品举止大肠埃希菌查看时，应搞阳性对于照考查.阳性对于照考查的加菌量为10-100cfu，供试品战删菌培植基用量及查看按供试品的大肠埃希菌查看.阳性对于照考查应查看出大肠埃希菌.已搞考证考查的供试品，正在该供试品查看时不必再搞阳性对于照..2.阳性对于照考查与稀释剂10ml加进100ml（或者200ml）大肠埃希菌查看用的删菌培植基中，培植，应无菌死少.. 删菌培植.1. 与胆盐乳糖(BL)培植基2份，每份各100ml.1份加进10ml供试液(相称于供试品1g、1ml、10cm2)，另1份加进与供试液等量的稀释剂做阳性对于照.培植18～24小时，需要时可延少48小时)，阳性对于呼应无菌死少..2. 与上述培植物，交种至含5mlMUG培植基的试管内，培植，于5、24小时正在366nm紫中光下瞅察，共时与已交种的MUG培植基做本底对于照.正在紫中光下若管内培植物浮现蓝红色荧光，为MUG阳性；不浮现荧光，为MUG 阳性.瞅察后，沿培植管的管壁加进数滴靛基量试液，液里呈玫瑰红色，为靛基量阳性；呈试剂赋性，为靛基量阳性.本底对于照的MUG战靛基量考查应为阳性.如MUG阳性、靛基量阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基量阳性，判供试品已检出大肠埃希菌.. 分散培植如浮现MUG阳性、靛基量阳性或者MUG阳性、靛基量阳性时，应将上述供试品BL删菌培植液沉沉摇动，以交种环1～2ml环培植液划线于EMB或者麦康凯琼脂仄板上，培植18～24小时.若仄板上无菌降死少、或者死少的菌降与表1所列的菌降形态特性不符，判供试品已检出大肠埃希菌.表1 大肠埃希菌菌降形态特性当阳性对于照的仄板呈典型菌降死万古，若EMB或者麦康凯琼脂仄板上死少的菌降与表1所列菌降形态特性相符或者疑似者，应挑与可疑菌降举止分散、杂化、染色镜检战IMViC考查，确认大肠埃希菌.为了典型支配，以下是对于药典央供的补充.. 杂培植如EMB或者麦康凯琼脂仄板上死少的菌降与表1所列特性相符或者疑似者，以交种针沉沉交触单个疑似菌降的表面核心，沾与培植物，应选择2～3个以上疑似菌降，分别交种营养琼脂斜里，培植18～24h，做以下查看.如仄板上无单个可疑菌降，但是有可疑菌团（紫乌色，或者有金属光芒），应沾与可疑菌团培植物少许，或者重新与删菌培植液分区划线交种于EMB琼脂仄板，培植18～24h，再选择单个疑似菌降，杂培植，做以下查看.. 革兰染色、镜检.1. 以交种环沾与无菌火于净净载玻片上，与上述疑似菌降的营养琼脂斜里新陈培植物少许，造成匀称涂片，自然或者微温搞燥，再通过火焰2～3次(载玻片烫脚)牢固..2. 滴加结晶紫染液，染色1分钟，火洗..3. 滴加碘液，媒染1分钟，火洗，以滤纸吸搞余火..4. 滴加95％乙醇，脱色20～30秒钟，火洗..5. 滴加沙黄染液，复染1分钟，待搞后，镜检..6. 染色截止革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰氏阳性呈红色.大肠埃希菌为革兰阳性短埃希菌，或者球埃希菌状，亦有埃希菌状..7. 注意事项（1）玻片必须净净，无划痕.涂片的菌量宜少，菌不可浓.可则，菌细胞成堆或者连成片.不利菌细胞染色反应推断及形态瞅察.（2）培植物的菌龄以16～24小时为宜.培植时间过少，革兰阳性菌易染成红色.（3）脱色是关键.脱色时间缺累，菌细胞易染成阳性；脱色时间过少，菌细胞易染成阳性.（4）可用已知革兰染色为阳性、阳性的菌种搞染色的品量统造.4.9.死化考查. 乳糖收酵考查与上述斜里培植物，交种于乳糖收酵管，培植24～48h，瞅察产酸（指示剂为酸性品黑者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）.为预防早缓收酵乳糖爆收假阳性，亦可交中5%乳糖收酵管.绝大普遍早缓收酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性.或者适合延少培植时间.. 靛基量考查(Ⅰ) 与上述斜里培植物，交种于蛋黑胨火培植基，培植24～48小时，沿管壁加进靛基量试液数滴，沉沉摇动试管，液里呈玫瑰红色为阳性，呈试剂赋性为阳性.98％的大肠埃希菌靛基量考查为阳性，普遍24小时即可出现阳性截止.常以无菌支配先从管中与出1或者2ml培植液举止查看，如靛基量阳性，余下的蛋黑胨火培植物再培植24小时，做靛基量考查.. 甲基黑考查(M) 与上述斜里培植物，交种于磷酸盐葡萄糖胨火培植基中，培植48±2小时，于培植液中加进甲基黑指示液2～3数滴(约每ml培植液加指示液1滴)，沉微摇动，坐时瞅察，呈陈红色或者橘红色为阳性，呈黄色为阳性.. 乙酰甲基甲醇死成考查(V-P) 与上述斜里培植物，交种于磷酸盐葡萄糖胨火培植基中，培植48±2小时，于每2ml培植液中加进α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，正在4小时(常常正在30分钟)内出现红色判为阳性，无红色反应为阳性.. 枸橼酸盐利用考查(C) 与上述斜里培植物，交种于枸橼酸盐培植基斜里上，培植2～4天，培植基斜里有菌苔死少，培植基由绿色形成蓝色时为阳性，培植基颜色无改变，无菌苔死少为阳性.4.10.截止判决. 当阳性对于照考查呈阳性，阳性对于照考查MUG呈阳性、靛基量阳性，供试品MUG阳性、靛基量阳性，报告1g或者1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阳性、靛基量阳性，报告1g或者1ml供试品已检出大肠埃希菌.. MUG阳性、靛基量阳性、IMViC考查为－＋――、革兰阳性埃希菌，报告1g或者1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阳性、靛基量阳性、IMViC考查为＋＋――、革兰阳性埃希菌，报告1g或者1ml供试品检出大肠埃希菌.. 供试品培植物查看不切合4.10.2中的任一项，报告1g或者1ml供试品已检出大肠埃希菌.. 当阳性对于照有菌死少或者阳性对于照已死少或者死少但是非大肠埃希菌，不克不迭搞出考验报告.4.11.注意事项. MUG法不必从混同菌中分散单个菌降.除大肠埃希菌中，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少量革兰阳性球菌、埃希菌战芽孢菌，其MUG为阳性.果此，正在MUG 培植基身分中减少了去氧胆酸钠的量，可排除革兰阳性菌的搞扰.至于志贺菌、沙门菌正在胆盐乳糖培植基中较易死少，纵然有死少，本法能检出亦判为分歧格.. 配造MUG培植基时，务必矫正pH值，灭菌后pH不得过，可则pH值偏偏下，MUG领会，自己则隐荧光；分拆MUG培植基的试管应选择，试管、蛋黑胨不得隐荧光.. 培植时间供试品培植液交种于MUG培植基中，普遍培植5h战24h要瞅察是可爆收荧光，如荧光很微小，不克不迭准确推断时，可延少培植至48h再瞅察截止.由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不真足相共，对于底物战底物的浓度反应的好别；培植基中采用果子的效率；培植时间、温度；pH的改变；洪量比赛菌战样品自己物量身分的搞扰等，对于截止的推断亦灵验率.. 截止瞅察与供试品的MUG考查管、阳性对于照管、阳性对于照管共时正在366nm紫中灯下瞅察，阳性对于照管应有较强的蓝红色荧光，阳性对于照管无荧光.供试品MUG 管是可有荧光，应小心瞅察比较，或者将各管变更位子(阳性管居中)，适合倾斜试管.如阳性对于照管荧光热烈，效率供试品管与阳性对于照管的瞅察时，亦可移去阳性对于照管.. 药品中传染的大肠埃希菌，易受死产工艺及药物的效率.正在曙黑亚甲蓝琼脂或者麦康凯琼脂仄板上的菌降形态特性时有变更，挑与可疑菌降往往凭体味，主瞅性较大，务必选择2～3个菌降分别搞IMViC考查鉴别，选择菌降越多，检出阳性菌的机率越下，如仅选择一个菌降搞IMViC 考查鉴别，则易漏检.. 正在IMVIC考查中，以灭菌交种针沾与菌苔，最先交种于枸橼酸盐琼脂斜里上，而后交种于蛋黑胨火培植基、磷酸盐葡萄糖胨火培植基中.切勿将培植基戴进枸橼酸盐琼脂斜里上，免得爆收假阳性截止.. 枸橼酸盐利用考查培植时间，本订为2天，根据考查资料，创造培植3天后，枸橼酸盐利用考查爆收阳性.仅培植2天不敷的，故考查培植时间改为2～4天.. 以IMViC考查去推断大肠埃希菌属中的大肠埃希菌是含混的，有大概把埃希菌属的其余种判为大肠埃希菌.IMViC 考查为＋＋――者，除大肠埃希菌中，另有非活跃大肠埃希菌、弗格森埃希菌、赫我曼埃希菌.IMViC考查为－＋――者，除大肠埃希菌中，另有非活跃大肠埃希菌、伤心埃希菌、蟑螂埃希菌.. 正在百般供试品中检测大肠埃希菌及其余统造菌，按一次检出截止为准，不再抽样复验.检出的大肠埃希菌及其余统造菌培植物须死存一个月，备查.死化考查也可采与商品化的自动领会仪器举止、仪器不妨给出菌种的审定截止，搞相映报告.。
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大肠埃希菌检查法ESCheriChia COliTeSt MethOd1. 目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2. 范围适用于大肠埃希菌检查的操作。
3. 责任者QC化验员。
4. 程序：4.1. 简述4.1.1. 大肠埃希菌(ESCheriChia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。
埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。
大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。
在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。
大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。
为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-MethylumbelliferyI- β-D-glucuronide , MUG和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase ，GUD) 约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。
MUGS GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。
单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUGf靛基质试验结合，比单用MU可提高大肠埃希菌的检出率。
如MUGf Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。
该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。
如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。
4.2. 仪器、设备及用具4.2.1. 无菌室4.2.2. 净化工作台4.2.3. 培养箱(36 ± 1C )4.2.4. 高压蒸汽灭菌器4.2.5. 显微镜(1500X)426. 微波炉427. 恒温水浴（45± 1C）4.2.8. 离心机（500 〜4000r∕min）4.2.9. 0.45 μm± 0.02 μm薄膜及过滤器4.2.10. 电冰箱4.2.11. 匀浆仪4.2.12. 366nm 紫外灯4.2.13. 玻璃器皿、器具4.3.试液、指示液4.3.1. 0.9 %无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g ,加水使溶解成1000ml, 121 C灭菌20分钟。
4.3.2. 靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g ,加入戊醇（或丁醇）75ml ,充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛 1.0g ,加入95%乙醇95ml,充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。
4.3.3. 甲基红指示液取甲基红0.1g ,加95%乙醇300ml,使溶解后加水至500ml ,即得。
4.3.4. V-P 试液α-萘酚乙醇试液：取α—萘酚6.0g ,加无水乙醇溶解使成100ml。
氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。
4.3.5. 革兰染色液4.3.5.1. 结晶紫染液取结晶紫1.0g、95%乙醇20ml、1 %草酸铵[（NH4）2C2O4] 溶液80ml。
将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h,置密闭棕色瓶，可存放数月。
4.3.5.2. 革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。
用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml ,置棕色瓶备用。
4.3.5.3. 脱色液95 %乙醇4.3.5.4. 沙黄（番红）染液沙黄（SafranineO）0.25g、95%乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。
4.3.6. 亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g ,加水溶解使成100ml。
4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g ,加1mol∕L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。
变色范围pH6.0〜7.6（黄→红）4.3.8. 酸性品红指示液取酸性品红0.5g ,加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml ,每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。
变色范围pH6.0〜7.4（黄→红）。
4.3.9. 曙红钠指示液取曙红钠2.0g ,加水溶解使成100ml。
4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0.9 %氯化钠溶液使成100ml, 121C灭菌20分钟。
4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g , 加水稀释至1000ml, 121C灭菌20分钟。
4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g ,加入含10ml水的具塞试管中，121 C灭菌20分钟。
4313. 中性红指示液 取中性红1.0g ,研细，加95聽醇60ml 使溶解，再加水至100ml 。
变色范围Ph6.8 〜8.0 （红→黄）。
4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0） 取磷酸二氢钾3.56g ,磷酸氢二 钠7.23g ,氯化钠4.30g ,蛋白胨1.0g ,加水1000ml ,加热使溶解，过滤。
分装， 灭菌。
4.4. 培养基4.4.1. 营养肉汤培养基胨10g 氯化钠 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 PH值使灭菌后为7.4 ± 0.2 ,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装， 灭菌。
4.4.4. 4- 甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1- β-D-glu-curonide,MUG ）培养基胨10.0g 磷酸二氢钾（无水） 0.9g 硫酸锰0.5mg 硫酸锌0.5mg 磷酸氢二钠（无水）6.2g 亚硫酸钠 40mg硫酸镁 0.1g 去氧胆酸钠 1.0g氯化钠 5.0g MUG5mg氯化钙 50mg 水 1000ml除MUG 7卜，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH 值使灭菌后为7.3 ± 0.1 ,加入MUG 溶解，每管分装5ml ,灭菌。
4.4.5. 曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB 营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml20%⅛糖溶液 5ml 亚甲蓝指示液 1.3-1.6ml取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至 60C ,按无菌操作加入灭菌的其他 5.0g牛肉浸出粉3.0g 1000ml 取上述成份混合，微温溶解，调解 为7.2 ± 0.2 ,分装，灭菌。
4.4.2. 营养琼脂培养基胨 10g5.0g牛肉浸出粉 3.0g1000ml琼脂 14.0g 取上述成份混合，微温溶解，调解灭菌后为7.2 ± 0.2 ,分装，灭菌。
4.4.3. 胆盐乳糖培养基（BL ）胨20.0g 磷酸二氢钾1.3g 乳糖5.0g 牛胆盐2.0g 氯化钠5.0g （或去氧胆酸钠）磷酸氢二钾4.0g 水1000ml 水PH 为弱碱性，煮沸，调节PH 值使灭菌后氯化钠 水 PH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节PH 值使 (0.5g)3种溶液，摇匀，倾注平皿。
4.46 麦康凯琼脂培养基（MaCC胨20.0g 1%H 生红指示液 3ml乳糖 10.0g 琼脂 14.0g牛胆盐5.0g 水 1000ml氯化钠5.0g除乳糖1%H 生红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解， 调节PH 值使灭菌后为7.2 ± 0.2 ,加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分， 摇匀，分装，灭菌，冷至约60 C ,倾注平皿。
4.4.7. 蛋白胨水培养基胰蛋白胨 10g氯化钠 5g水 1000ml取上述成分混合，加热溶化，调节PH 使灭菌后为7.3 ± 0.1，分装于小试管, 灭菌。
4.4.8. 磷酸盐葡萄糖胨水培养基胨 7g 磷酸氢二钾（K2HP0）2g葡萄糖5g 水1000ml 取上述成分混合，微温溶解，调节PH 使灭菌后为7.3 ± 0.1，分装于小试管, 灭菌。
4.4.9. 枸橼酸盐培 养基氯化钠 5g 2g硫酸镁（MgSO4 7H2O 0.2g 20ml磷酸氢二钾（K2HPO ） 1g 14g 硫酸二氢铵（NH4H2PO4 1g 1000ml除指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节 PH 使灭菌后为6.9 ± 0.1 ,加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀。
分装于小试管，灭菌，制成 斜面。
注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
4.4.10. 乳糖培养基胨 20.0g 乳糖10.0g0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 水1000ml除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH 使灭菌 后为7.2 ± 0.2 ,加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml 。
灭菌。
5%乳糖培养基胨 0.2g溴麝香草酚蓝指示液枸橼酸钠（无水） 溴麝香草酚蓝指示液 琼脂 水6ml氯化钠0.2g 乳糖5g磷酸氢二钠0.2g 水100ml除乳糖和指示液外，混合各成分，微温溶解，调节PH使灭菌后为7.4 ,加入乳糖/指示液，混合，分装于含小倒管的灭菌小试管中，115C灭菌15mi n。
4.5. 对照用菌液取大肠埃希菌［CMCC（B）44102］的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置36± 1C培养18〜24小时，取均匀培养物1 ml用0.9 %灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10〜100Cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
4.6. 准备4.6.1. 检验量4.6.1.1. 每批供试品检验量，一般为10g或10ml,特殊贵重或微量包装的供试品检验量可以酌减。
4.6.1.2. 供试品均须取自2个以上的包装单位。
4.6.2. 供试液的制备4.6.2.1. 液体供试品取供试品10ml,加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）至100ml ,混匀，作为供试液。
4.6.2.2. 固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g,加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）至100ml ,用匀浆仪（3000〜5000r∕min、2〜4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。