控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程
微生物限度检查法标准操作规程
1.目的建立微生物限度检查法的标准操作规程，规范微生物限度检验操作。
2.范围适用于QC生测室微生物限度检查的操作。
3.责任人微生物限度检验员、QC部负责人对本规程的实施负责。
4.依据《中国药典》2010版二部附录5.程序5.1.微生物限度检查法定义微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
5.2.微生物限度检查室环境要求微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
5.3.抽样5.3.1.供试品一般按批号随机抽样。
5.3.2.抽样量为一般检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
5.3.3.抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检验。
5.4.供试品保存5.4.1.供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件而引起致死、损伤或繁殖。
5.4.2.供试品在检验之前，应保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
5.5.检查前的准备5.5.1.用具的洗涤与灭菌5.5.1.1.试管：使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立，晾干备用。
灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。
5.5.1.2.吸管：使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用水冲洗4-5次，晾干，备用。
灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。
5.5.1.3.研钵：使用过的研钵用清洁液洗刷后，用水冲洗数次，晾干备用。
微生物限度、控制菌检查记录
产品名称
批号
数量
供货单位
取样量
检验日期
温度
湿度
报告日期
检验依据
供试液制备
取供试品（g），加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml，混匀，作为1:10的供试液；细菌检查：吸取本品1ml至5个平皿，每个平皿0.2ml；霉菌和酵母菌检查：吸取本品1ml至平皿
平皿号
细菌
培养基/批号
营养琼脂培养基/
供试品
阳性对照
阴性对照
结果
□检出□未检出（规定：）
备注
结论
本品按进行检验，结果。
检验人
复核人
2天
3天
3天
4天
4天
5天
5天
5
1天
1天
2天
2天
3天
3天
4天
4天
5天
5天
每组菌落总数
平均数
平均数
结果
（规定：）
结果
（规定：）
备注
结论
本品经按进行检验，结果。
检验人
复核人
控制菌检查记录
检验编号：
产品名称
批号
数量
供货单位
取样量
检验日期
温度
湿度
报告日期
检验依据
一、大肠埃希菌检查
供试品制备：取供试品（g/ml/cm2），加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml，混匀，作为的供试液。
培养基信息：①营养肉汤培养基配制批号：②四硫磺酸钠亮绿培养基配制批号：
③胆盐硫乳琼脂培养基配制批号：④EMB配制批号：
培养温度：培养时间：培养箱编号：
营养肉汤预增菌（18～24h）
四硫磺酸钠亮绿增菌（18～24h）
口服液药品中控制菌大肠埃希菌的检查
口服液药品中控制菌大肠埃希菌的检查生物工程学院11生物5.2 作者：王千牵绪论：大肠菌群系指一群在37℃、24h能发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧菌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群主要来自人或温血动物粪便，药品中检测出大肠菌群则说明药品受到了人或动物粪便的污染，大肠菌群数量越多则表明粪便污染越严重，由此推测该药品在肠道致病菌污染的可能性，潜伏者药品中毒和流行病的威胁。
故以此作为大肠菌群污染指标来评测药品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
微生物营养需求是微生物维持其生命和增长所需求的营养物质。
营养物对微生物作用有：提供合成细胞质需要的物质（CO2、、HCO3-、有机化合物及微量元素和生长素）；作为细胞增长和生物合成反应的能源（有机化合物、无机化合物、能源）；充当产能反应所释放的电子受体（O2、有机化合物、无机化合物中的化合氧）。
按所需碳源形式的不同，微生物可分为为：自养型(即用CO2、或HCO3-作为唯一的碳源)和异养型（即需要摄取存在于相对复杂的还原态有机化合物中的碳）。
按所需能源不同，微生物可分为：光营养型和化能营养型（即利用氧化-还原反应提供能源）。
微生物代谢是指微生物吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，包括有机物的降解和微生物的增殖。
在分解代谢中，有机物在微生物作用下，发生氧化、放热和酶降解过程，使结构复杂的大分子降解；合成代谢中，微生物利用营养物及分解代谢中释放的能量，发生还原吸热及酶的合成过程，使微生物生长增殖。
内源呼吸是细胞质进行自身氧化并放出能量的过程，当有机物充足时，细胞质得到大量合成，而内源呼吸则并不显著；当缺乏营养时，则只能通过内源呼吸吸收氧化自身的细胞物质而获得微生物生命活动所需的能量。
药品中检验微生物的原则：对试剂的要求：有效性和无毒性。
检验方法的选择：尽量选择操作简便，快捷及避免损伤供试品中污染的微生物的方法。
对照培养基的说明：由中检测所研制计分发。
非无菌产品微生物限度检查标准操作规程
非无菌产品微生物限度检查标准操作规程1 制定目的为使QC检验人员在非无菌产品微生物限度检查工作中能规范和正确地进行检验工作，特制定本操作规程。
2 适用范围本操作规程适用于非无菌产品进行微生物限度检查。
3 职责3.1 QC负责按照本操作规程进行非无菌产品微生物限度检查的检验工作；3.2 QC检验员在进行非无菌产品微生物限度检查的检验工作时出现异常现象，包括微生物计数、微生物负载、控制菌检测超标和超趋势时要向QC 主管汇报，并照《微生物检查超标、超趋势调查标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-020）配合调查；3.3 QA及管理人员负责监督其实施情况。
4 规程细则4.1 实验环境：按《微生物实验室标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-002），《化验室洁净区标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-004）。
4.2 培养基的制备：按《培养基标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-019）；微生物计数用的商品化预判培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
4.3 稀释剂的制备：称取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g，置1000ml三角瓶中，加纯化水1000ml，摇匀，加热溶解，于121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
4.4 微生物计数法：适用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数；计数方法应进行方法适用性试验；按《微生物计数方法适应性确认》（文件编号：）。
4.4.1 供试液的制备（经计数方法适用性试验确认）4.4.1.1 取样：按《取样标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-026）；一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml。
4.4.1.2 供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃；供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
4.4.1.3 水溶性供试品：取供试品，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH 7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。
微生物限度检查法标准操作规程
建立微生物限度检查法标准操作规程，规范操作，保证结果的准确性。
成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
微生物限度检验人员本检验操作规程依据中国药典 2022 年版四部《通则 1105 非无菌产品微生物 限度检查：微生物计数法》和《通则 1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查 法》进行检查。
1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法 本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基合用性检查和供试品计数方法合用性检查 供试品微生物计数中所 使用的培养基应进行合用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法合用性试验， 以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1 试验用菌株的传代次数不得超过 5 代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 袋)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基合用性检查和计数方法合用 性试验。
4.2 菌液制备 按规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、 白色念珠菌的新鲜培养物， 用 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或者 0.9%无菌 氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入 3-5ml 含 0.05% (ml/ml )聚山梨酯 80 的 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或者 0.9%无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含 0.05% (ml/ml )聚xxxxxxx 中药饮片厂ZL ·SOP ·05 ·062-01 页 数 制定日期 年 月 日 修订日期 审核日期 年 月 日 颁发部门 批准日期 年 月 日 生效日期 质量管理部、质量控制科 编号制定人审核人批准人分发部门 共 9 页 年 月 日 年 月 日质量管理部山梨酯80 的PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或者0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
微生物限度检查操作规程
更改历史微生物限度检查操作规程1.0 目的建立微生物限度检查标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确2.0 范围适用于本公司采用微生物限度检查法测定的供试品。
3.0 职责质量部负责按本规程的要求执行微生物限度检查操作。
4.0 工作程序4.1 洁净区间的确认微生物计数检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全部过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品（即待检样品、产品）中微生物的检出。
4.2 培养基4.2.1 应使用按中国药典处方及规定的方法制备的培养基。
4.2.2 所用培养基可按中国药典规定的处方及制备方法自行配制，也可使用按中国药典规定的处方生产的脱水培养基进行配制；或购买商品化的预制培养基。
4.2.3 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25℃、避光的环境下保存。
4.2.4 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
4.2.5 供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
4.2.6 供试品的微生物计数方法、控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数或控制菌检查。
4.3 菌种及菌液制备检查所用的菌种及菌液制备见附件 1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
稀释剂、冲洗液及其制备的要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查。
4.4 培养基的适用性检查供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
微生物限度检查所用的培养基每批均应进行适用性检查，检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。
具体要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
4.5 方法适用性试验供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
大豆油食用级微生物限度检验操作规程
目的制定大豆油（食用级）微生物限度检验操作规程，规范大豆油（食用级）微生物限度的检验，确保准确、及时的检验大豆油（食用级）微生物限度，确保检验的规范性与准确性。
范围适用于大豆油（食用级）微生物限度的检验。
职责QC主管：负责督促检验人员按本规程操作。
生化组组长：负责对检验人员的操作进行指导与监督。
生化组检验人员：负责严格按照本规程对大豆油（食用级）微生物限度进行检验。
内容1物料/产品代码、名称1.1代码：PYF0571.2名称：大豆油（食用级）2标准依据2.1 STP03-QS-205500 “大豆油2.2《中国药典》3仪器、工具3.1锥形瓶（食用级）质量标准”500ml3.2培养皿90mm3.3刻度吸管、乳胶头1ml3.4量筒10ml3.5锥形瓶200ml3.6盐水瓶3.7试管、试管架100ml3.8接种环3.9酒精灯3.10试管塞3.11量杯、纱布3.12生化培养箱3.13电子天平3.14洁净工作台3.15灭菌锅3.16水浴锅3.17剪刀3.18试药4.175%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭溶液或70%异丙醇4.2胰酪大豆胨琼脂培养基4.3沙氏葡萄糖琼脂培养基4.4胰酪大豆胨液体培养基4.5麦康凯液体培养基4.6麦康凯琼脂培养基4.7聚山梨酯804.8pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4.9、健康和安全(EHS)5.1微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。
5.2在操作中注意酒精灯的使用，酒精灯中酒精的量不能超过装量的2/3。
5.3由于酒精灯或是75%的乙醇溶液或是70%异丙醇着火时，切忌用水扑灭，应采用窒息法使其熄灭。
6准备6.1将纱布、量杯、滤杯用灭菌呼吸袋装好，经121℃ 20分钟湿热灭菌后，经紫外消毒30分钟后，由洁净传递窗传入洁净区。
应填写“仪器使用记录” (SMP04-QC-00080001)、“紫外灯消毒记录”(SMP04-QC-00210001)。
6.2将量筒、培养皿、弯头镊子、垫片于160℃〜180℃干热灭菌2小时后，经紫外消毒30分钟后，由洁净传递窗传入洁净区。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
(3)．“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml 分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
2.3用过的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。
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控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程1.目的建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。
2.范围适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。
3.责任者QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部4.内容4.1检测准备4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。
4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。
4.2 供试液的制备4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。
4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。
如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。
4.2.2.1 可溶性液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。
可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
4.2.2.2 非水溶性液体供试品油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。
4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。
必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.2.2.4 非水溶性供试品取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。
4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。
4.2.2.7具抑菌成分供试品当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。
取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每个平皿倾注培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，按每1ml分注的平皿点计菌落数之和计数，即为每1ml的菌落数，共得2组数据，再以2组数的平均数乘以稀释倍数的值报告菌数。
4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。
4.3检验操作4.3.1 操作程序4.3.2培养基选择与标记4.3.2.1 增菌培养使用胆盐乳糖（BL）培养基，标记符号为BL4.3.2.2 快速生化试验使用4-甲基伞形酮葡萄苷酸蛋白胨培养基，标记符号为MUG 4.3.2.3 分离培养使用曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）或麦康凯琼脂培养基（MacC）4.3.2.4 纯培养使用营养琼脂（YY）培养基，标记符号为YY4.3.2.5 乳糖发酵试验使用乳糖（RT）培养基、5%乳糖培养基，标记符号为RT4.3.2.6 靛基质试验（I）使用蛋白胨水培养基，标记符号为RT标记符号为I4.3.2.7 甲基红试验（M）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为M4.3.2.8 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为V-P 4.3.2.9 枸橼酸盐利用试验（C）使用枸橼酸盐培养基，标记符号为C4.3.3 阳性对照与阴性对照4.3.3.1阳性对照试验对各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验，加菌量为10~100cfu，培养、检查等方法按照供试品的各控制菌检查同法进行，阳性对照试验应检出相应的控制菌；已做验证试验的供试品，在该供试品检查时可不必再做阳性对照。
4.3.3.2 阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的相应培养基中，培养，应无菌生长。
4.3.4 增菌培养取胆盐乳糖（BL）培养基2份，每份各100ml。
一份加入10ml供试液（相当于供试品1g或1ml），另一份加入与供试液等量的稀释剂作为阴性对照。
温度36℃，培养8~24hr，必要时可延至48hr。
阴性对照应无菌生长。
4.3.5 快速生化试验4.3.5.1取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，温度36℃培养，于5hr和24hr时在366nm紫外灯光下观察，同时用未接种的MUG培养基作为本底对照。
在紫外光下若管内培养物呈蓝白色荧光，则为MUG阳性；不呈现荧光，则为MUG阴性。
4.3.5.2 观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，则为靛基质阳性；若呈试剂本色，则为靛基质阴性。
本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。
4.3.5.3 如果MUG阳性、靛基质阳性，则判供试品检出大肠埃希菌；如果MUG阴性、靛基质阴性，则判供试品未检出大肠埃希菌。
4.3.6 分离培养4.3.6.1如果呈现MUG阳性、靛基质阴性或者MUG阴性、靛基质阳性时，则应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环蘸取1~2环培养液划线于EMB或MacC平板上，温度36℃培养18~24hr。
4.3.6.2 观察平板，若EMB或MacC平板上无菌落生长或生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征不符，则判供试品未检出大肠埃希菌。
4.3.6.3 观察平板，当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或MacC平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，应挑取可疑菌落2~3个以上菌落分别进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。
4.3.6.4 大肠埃希菌菌落形态特征4.3.7 纯培养4.3.7.1 如果EMB或MacC平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，蘸取培养物，应挑选2~3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，温度36℃培养18~24hr，进行以下检查。
4.3.7.2 如果平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（如呈紫黑色或有金属光泽），则应蘸取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB或MacC平板，温度36℃培养18~24hr，再挑选单个疑似菌落，纯培养，进行以下检查。
4.3.8 革兰氏染色、镜检4.3.8.1 以接种环蘸取无菌水于洁净无划痕的载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2~3次固定。
4.3.8.2 在载玻片的菌斑上滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。
4.3.8.3 滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。
4.3.8.4 滴加95%乙醇，严格控制时间脱色20~30s，水洗。
4.3.8.5 滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。
4.3.8.6 镜检结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色；大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌或球杆菌。
4.3.9 生化（IMViC）试验4.3.9.1 乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，温度36℃培养24~48hr，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。
为了避免迟缓发酵产生假阴性，也可接种5%乳糖发酵管。
绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24hr出现阳性，或适当延长培养时间。
4.3.9.2 靛基质试验（I）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，温度36℃培养24~48hr，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24Hr即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24hr，做靛基质试验。
4.3.9.3 甲基红试验（M）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度36℃培养48±2hr，于培养液中加入甲基红指示液2~3滴（约每1ml培养液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
4.3.9.4 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度36℃培养48±2hr，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4hr（通常在30min时）内出现红色判为阳性，无红色判为阴性。
控制菌大肠埃希菌检查操作规程文件类型操作规程（SOP）文件编号编订依据《中国药典》2010年版、《GMP》2010年版替代文件4.3.9.5 枸橼酸盐利用试验（C）取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，温度36℃培养2~4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时，判为阳性，培养基颜色无变化、无菌苔生长，判为阴性。
4.4 结果判定4.4.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；供试品MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.4.2当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为“- + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；供试品MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为“+ + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。
4.4.3 供试品培养物检查不符合上条中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.4.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未有菌生长或有菌生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。
5．培训5.1 培训对象：QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部QA审核人员。
5.2 培训时间：八小时。
聚协昌（北京）药业有限公司GMP文件第7页/共7页。